本発明者らは、上記問題解決のために鋭� ��研究に努めた結果、本発明を想到した。

 本発明は、遺伝子組み換え技術と真核生� ��のセラミド合成・代謝および輸送システム� ��巧く制御することにより、機能性の高いヒ� ��型セラミドを効率的に生産する系を開発す� ��。そのため遺伝子操作が比較的容易であり� ��しかも伝統的に食品製造に利用されている� ��芽酵母を宿主として用いる。

 具体的には、ヒトの角質層に存在し、そ� ��なかでも分布量が最も多く皮膚の保湿・バ� ��ア機能に極めて重要であると言われている� ��ラミドNSをターゲットにする。セラミドの� �造は細胞が持っている酵素の種類によって� �定されており生物種で異なる。宿主として� �いる出芽酵母は、高等動物の主なセラミド� �あるセラミドNSを合成する酵素を持っていな い。その代わり宿主には宿主特有のセラミド を合成する酵素を有している。そのため酵母 でセラミドNSを合成させるためには、宿主由� ��のセラミド合成経路を抑制し、且つ必要な� ��素を酵母に導入する必要がある。

 具体的には、図1に示したように、スフィ ンゴ脂質合成・代謝経路においてジヒドロス フィンゴシン(DHS)生合成以降の反応は、ヒト� ��含む高等動物細胞と酵母の間で大きく異な� ��。即ち、出芽酵母(サッカロミセス属)では� �スフィンゴリピッド δ4-デサチュラーゼ遺� �子(DES1)が存在しないことから、DHSのC-4位に� �重結合を有するヒト型スフィンゴイド塩基(� ��フィンゴシン)は合成されない(図2)。その代 わりスフィンガニン C4-ヒドロキシラーゼ遺� ��子(SUR2)がコードする酵素によってDHSのC-4位� ��水酸化されフィトスフィンゴシン(PHS)が合� �される。次いでそれらのスフィンゴイド塩� �はセラミドへと変換される。

 本発明者らは、まずヒト型セラミドを酵� ��細胞内で製造させるために、酵母細胞内に� ��存在しないスフィンゴリピッド δ4-デサチ� ��ラーゼ酵素を酵母細胞内で発現させること� ��及び、スフィンガニン C4-ヒドロキシラー� �酵素活性を完全に又は部分的にでも破壊す� �ことが重要であること考えた。そこで先ず� �酵母の形質転換により、1)上述したSUR2遺伝� �破壊株を作成し、その変異株に2)ヒトDES1遺� �子を導入する、ということを想到した。

 さらに導入する酵素を最適な場所に局在� ��させることにより、セラミドNSの産生量を� �大させることができる。セラミドNSの合成に 必要なジヒドロセラミドは酵母の小胞体で合 成される。しかしながらヒト型のスフィンゴ リピッド δ4-デサチュラーゼDES1タンパク質� �C末端アミノ酸配列を見た限りでは、酵母の� ��型的な小胞体局在化シグナル、例えば、dily sine-based(KKXXやKXKXX)の配列は認められない。し たがって、ヒト型のスフィンゴリピッド δ4- デサチュラーゼDES1タンパク質を酵母で発現� �せてもヒト型のセラミドNSが効率的に合成さ れるとは考えにくい。

 本発明者らは、ヒト型セラミドをより効� ��的に生産されるためには、酵素であるスフ� ��ンゴリピッド δ4-デサチュラーゼDES1タンパ ク質を小胞体に局在化させるほうがより有効 である、と考えた。即ち、DES1タンパク質を� �胞体に局在化させるため、酵母の典型的な� �胞体局在化シグナルをDES1タンパク質に付加� ��たスフィンゴリピッド δ4-デサチュラーゼ� ��伝子(DES1m)を酵母に導入する。導入する酵素 を最適な場所に局在化させることにより、セ ラミドNSの産生量を増大させることができる� ��

 よって、本発明は、ヒト型セラミドを酵母� ��胞内で製造する方法であって、
  1)酵母細胞の形質転換によって、スフィン ゴリピッド δ4-デサチュラーゼ遺伝子(DES1)の 3’末端に酵母の小胞体局在化シグナルをコ� �ドする塩基配列を付加した小胞体局在化シ� �ナル付スフィンゴリピッド δ4-デサチュラ� �ゼ遺伝子(DES1m)を導入すること;及び
  2)酵母細胞の形質転換によって、酵母スフ ィンガニン C4-ヒドロキシラーゼ遺伝子(SUR2)� ��発現を欠失させること
を含む、前記製造方法を提供する。

 本発明において、ヒト型セラミドは、例� ��ば図2の「目的生産物」に示された構造式を 有する、セラミドNSを意味する。これに対し� ��酵母型セラミドであるフィトセラミドは、� ��ト型セラミドの4位の二重結合部分が水酸基 で置換されている点で相違する(図3)。

 さらにまた、ヒト型セラミドNSを効率的に� �産させるシステムを構築するために、本発� �の製造方法の最適化を行った。具体的な方� �としては、酵母の形質転換によって、以下� �3)又は4)のいずれか、あるいはこれらの組み� ��わせを行い、ヒト型セラミドをより効率よ� ��製造することに成功した:
  3)セラミドNSが水酸化されないように酵母� ��フィンゴ脂質 α-ヒドロキシラーゼ遺伝子(S CS7)の発現を欠失させること;及び/又は
  4)酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝 子(YDC1)の発現を欠失させること。

 よって、本発明は、上記1)及び2)を必須要件 とし、3)-4)を好ましい態様の追加要件として� ��うことにより、ヒト型セラミドを酵母細胞� ��で簡便かつ効率よく製造する方法を提供す� ��ものである。本発明は、好ましくは以下の� ��様を含む。
(態様1)
 ヒト型セラミドを酵母細胞内で製造する方� ��であって、
  1)酵母細胞の形質転換によって、スフィン ゴリピッド δ4-デサチュラーゼ遺伝子(DES1)の 3’末端に酵母の小胞体局在化シグナルをコ� �ドする塩基配列を付加した小胞体局在化シ� �ナル付スフィンゴリピッド δ4-デサチュラ� �ゼ遺伝子(DES1m)を導入すること;及び
  2)酵母細胞の形質転換によって、酵母スフ ィンガニン C4-ヒドロキシラーゼ遺伝子(SUR2)� ��発現を欠失させること
を含む、前記製造方法。
(態様2)
 小胞体局在化シグナルのアミノ酸配列が、2 個以上のリジン残基を含む4又は5個のアミノ� ��残基からなる、態様1に記載の製造方法。
(態様3)
 小胞体局在化シグナルのアミノ酸配列が、V KKEK(Vはバリン残基を、Kはリジン残基を、Eは� ��ルタミン酸を表す)である、態様1又は2に記� ��の製造方法。
(態様4)
 スフィンゴリピッド δ4-デサチュラーゼ遺� ��子(DES1)が、配列番号2のアミノ酸配列又は配 列番号2において1またはそれ以上のアミノ酸� ��基が欠失、付加または置換しているアミノ� ��配列を有しており、かつ、スフィンゴリピ� ��ド δ4-デサチュラーゼ活性を有するタンパ� ��質をコードする、態様1ないし3のいずれか1� ��に記載の方法。
(態様5)
 小胞体局在化シグナル付スフィンゴリピッ� �� δ4-デサチュラーゼ遺伝子(DES1m)が配列番号 4のアミノ酸配列からなるタンパク質をコー� �する、態様1ないし4のいずれか1項に記載の� �法。
(態様6)
 酵母スフィンガニン C4-ヒドロキシラーゼ� �伝子(SUR2)が、配列番号6のアミノ酸配列又は� ��列番号6において1またはそれ以上のアミノ� �残基が欠失、付加または置換しているアミ� �酸配列を有しており、かつ、スフィンガニ� � C4-ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク 質をコードする、態様1ないし5のいずれか1項 に記載の方法。
(態様7)
 さらに、酵母細胞の形質転換によって、酵� ��スフィンゴ脂質 α-ヒドロキシラーゼ遺伝� �(SCS7)の発現を欠失させることを含む、態様1� ��いし6のいずれか1項に記載の方法。
(態様8)
 酵母スフィンゴ脂質 α-ヒドロキシラーゼ� �伝子(SCS7)が、配列番号8のアミノ酸配列又は� ��列番号8において1またはそれ以上のアミノ� �残基が欠失、付加または置換しているアミ� �酸配列を有しており、かつ、スフィンゴ脂� � α-ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク 質をコードする、態様7に記載の方法。
(態様9)
 さらに、酵母細胞の形質転換によって、酵� ��アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子(YDC1)� ��発現を欠失させることを含む、態様1ないし 8のいずれか1項に記載の方法。
(態様10)
 酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子( YDC1)が、配列番号10のアミノ酸配列又は配列� �号10において1またはそれ以上のアミノ酸残� �が欠失、付加または置換しているアミノ酸� �列を有しており、かつ、アルカリジヒドロ� �ラミダーゼ活性を有するタンパク質をコー� �する、態様9に記載の方法。
(態様11)
 酵母が、サッカロミセス属の酵母から選択� ��れる、態様1ないし10のいずれか1項に記載の 方法。

  スフィンゴリピッド δ4-デサチュ ラーゼ遺伝子(DES1)
 本発明の方法は構成要件1)として、酵母細� �の形質転換によって、スフィンゴリピッド  δ4-デサチュラーゼ遺伝子(DES1)の3’末端に酵� ��の小胞体局在化シグナルをコードする塩基� ��列を付加した小胞体局在化シグナル付スフ� ��ンゴリピッド δ4-デサチュラーゼ遺伝子(DES 1m)を導入することを含む。

 限定されるわけではないが、DES1は、好ま しくは、配列番号2のアミノ酸配列又は配列� �号2において1またはそれ以上のアミノ酸残基 が欠失、付加または置換しているアミノ酸配 列を有しており、かつ、スフィンゴリピッド  δ4-デサチュラーゼ活性を有するタンパク質 をコードする。

 本発明に利用可能な遺伝子(核酸)は、ゲ� �ムDNA(その対応するcDNAも含む)、化学的に合� �されたDNA、PCRにより増幅されたDNA、および� �れらの組み合わせが含まれる。

 DES1は、好ましくは配列番号1の塩基配列を� �する。これは配列番号2のアミノ酸配列を有� ��るヒト スフィンゴリピッド δ4-デサチュ� �ーゼタンパク質をコードする塩基配列であ� �、例えば、GenBanK ^TM : accession number AF466375に開示されている。

 1つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコー ドする場合があり、遺伝暗号の縮重と呼ばれ ている。このため、配列番号1とは完全には� �致していないDNA配列が、配列番号2と全く同� ��のアミノ酸配列を有するタンパク質をコー� ��することがあり得る。こうした変異体DNA配� ��は、サイレント(silent)突然変異(例えば、PCR� ��幅中に発生する)から生じてもよいし、また は天然配列の意図的な突然変異誘発の産物で あってもよい。

 DES1は、好ましくは配列番号2に記載のア� �ノ酸配列をコードする。しかしながら、こ� �に限定されることなく、1またはそれ以上の� ��ミノ酸配列が欠失、付加または置換してい� ��アミノ酸配列を有していてもよい。スフィ� ��ゴリピッド δ4-デサチュラーゼ活性を有す� ��限り、全ての相同タンパク質を含むことが� ��図される。配列番号2と同等の機能を有する アミノ酸配列をコードする限り、配列番号2� �限定されるものではない。「アミノ酸変異� �は1から複数個、好ましくは、1ないし20個、� ��り好ましくは1ないし10個、最も好ましくは1 ないし5個である。

 DES1にコードされるアミノ酸配列は、配列 番号2に記載のアミノ酸配列と、少なくとも� �70%、好ましくは約80%以上、より好ましくは90 %以上、さらに好ましくは95%以上、最も好ま� �くは98%以上の同一性を有する。

 アミノ酸の同一性パーセントは、視覚的� ��査及び数学的計算により決定してもよい。� ��るいは、2つのタンパク質配列の同一性パー セントは、Needleman,S.B.及びWunsch,C.D.(J.Mol.Biol.,4 8:443-453,1970)のアルゴリズムに基づき、そして ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグ ループ(UWGCG)より入手可能なGAPコンピュータ� �プログラムを用い配列情報を比較すること� �より、決定してもよい。GAPプログラムの好� �しいデフォルトパラメーターには:(1)Henikoff,S 及びHenikoff,J.G.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915-10919,19 92)に記載されるような、スコアリング・マト リックス、blosum62;(2)12のギャップ加重;(3)4の� �ャップ長加重;及び(4)末端ギャップに対する� ��ナルティなし、が含まれる。

 当業者に用いられる、配列比較の他のプ� ��グラムもまた、用いてもよい。同一性のパ� ��セントは、例えばAltschulら(Nucl.Acids.Res.25.,p.3 389-3402,1997)に記載されているBLASTプログラム� �用いて配列情報と比較し決定することが可� �である。当該プログラムは、インターネッ� �上でNational Center for Biotechnology Information(NCB I)、あるいはDNA Data Bank of Japan(DDBJ)のウェ� �サイトから利用することが可能である。BLAST プログラムによる相同性検索の各種条件(パ� �メーター)は同サイトに詳しく記載されてお� ��、一部の設定を適宜変更することが可能で� ��るが、検索は通常デフォルト値を用いて行� ��。

 本発明の方法において、好ましくは、ス� ��ィンゴリピッド δ4-デサチュラーゼが、配� ��番号2又は配列番号2と少なくとも70%の同一� �アミノ酸配列を有しており、かつ、スフィ� �ゴリピッド δ4-デサチュラーゼ活性を有す� �。

 同一の機能を有するタンパク質であって� ��、由来する品種の相違によって、そのアミ� ��酸配列に相違が存在しうることは当業者に� ��って周知の事実である。スフィンゴリピッ� �� δ4-デサチュラーゼ活性を有する限り、DES1 は、配列番号1の塩基配列のこのような相同� �、変異体も含みうる。配列番号2のヒト ス� �ィンゴリピッド δ4-デサチュラーゼタンパ� �質以外にも、例えばマウス(M. musculus)やショ ウジョウバエ(D. melanogaster)、線虫(C. elegans)� �分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)等で同様の活� ��を示すタンパク質をコードする遺伝子の存� ��が知られている(非特許文献10)。

 「スフィンゴリピッド δ4-デサチュラー� ��活性を有する」とは、例えば図2又は図3に� �されているように、ジヒドロスフィンゴシ� �のC-4にニ重結合を導入し、スフィンゴシン� �合成する活性を意味する。あるいは、ジヒ� �ロセラミドのC-4にニ重結合を導入し、セラ� �ドNSを合成する活性を意味する。DES1の導入� �より、形質転換酵母細胞内では、酵母の天� �の代謝経路では合成されない、スフィンゴ� �ン及び/又はセラミドNSの合成が行われる。

 本発明の好ましいスフィンゴリピッド δ 4-デサチュラーゼ遺伝子はまた、配列番号1の 塩基配列にストリンジェントな条件下、例え ば、中程度又は高程度にストリンジェントな 条件下でハイブリダイズすることが可能であ り、かつ、フィンゴイド δ4-デサチュラーゼ 活性を有する核酸を含む。

 「ストリンジェントな条件下」とは、中� ��度または高程度にストリンジェントな条件� ��おいてハイブリダイズすることを意味する� ��具体的には、中程度にストリンジェントな� ��件は、例えば、DNAの長さに基づき、一般の� ��術を有する当業者によって、容易に決定す� ��ことが可能である。基本的な条件は、Sambroo kら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,第6-7 章,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001に示され 、そしてニトロセルロースフィルターに関し 、5×SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)の前洗浄溶液 、約40-50℃での、約50%ホルムアミド、2×SSC-6× SSC(または約42℃での約50%ホルムアミド中の、 スターク溶液(Stark’s solution)などの他の同様 のハイブリダイゼーション溶液)のハイブリ� �イゼーション条件、および例えば、約40℃-60 ℃、0.5-6×SSC、0.1% SDSの洗浄条件の使用が含� �れる。好ましくは中程度にストリンジェン� �な条件は、約50℃、6×SSCのハイブリダイゼー ション条件(及び洗浄条件)を含む。高ストリ� ��ジェントな条件もまた、例えばDNAの長さに� ��づき、当業者によって、容易に決定するこ� ��が可能である。

 一般に、こうした条件は、中程度にストリ� ��ジェントな条件よりも高い温度および/また は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション(� �えば、約65℃、6×SSCないし0.2×SSC、好ましく� ��6×SSC、より好ましくは2×SSC、最も好ましく� ��0.2×SSCのハイブリダイゼーション)および/ま たは洗浄を含み、例えば上記のようなハイブ リダイゼーション条件、およびおよそ65℃-68� ��、0.2×SSC、0.1% SDSの洗浄を伴うと定義され� �。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩� �液では、SSC(1×SSCは、0.15M NaClおよび15mM ク� �ン酸ナトリウムである)にSSPE(1×SSPEは、0.15M  NaCl、10mM NaH ₂ PO ₄ 、および1.25mM EDTA、pH7.4である)を代用するこ とが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーシ ョンが完了した後で15分間行う。

 当業者に知られていて、以下にさらに記載� ��たように、ハイブリダイゼーション反応と� ��本鎖の安定性を支配する基本原理を適用す� ��ことによって望ましい度合いのストリンジ� ��ンシーを達成するためには、洗浄温度と洗� ��塩濃度を必要に応じて調整することが可能� ��あると理解すべきである(例えば、Sambrookら� ��2001を参照されたい)。核酸を未知配列の標� �核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブ� �ッドの長さはハイブリダイズする核酸のそ� �であると仮定される。既知配列の核酸をハ� �ブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長� �は核酸の配列を並列し、最適な配列相補性� �もつ単数または複数の領域を同定すること� �よって決定可能である。50塩基対未満の長さ であることが予測されるハイブリッドのハイ ブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの 融解温度(T _m )より5-25℃低くなければならず、T _m は、以下の等式により決定される。長さ18塩� ��対未満のハイブリッドに関して、T _m (℃)=2(A+T塩基数)+4(G+C塩基数)。18塩基対を超え る長さのハイブリッドに関しては、T _m =81.5℃+16.6(log ₁₀ [Na ⁺ ])+41(モル分率[G+C])-0.63(%ホルムアミド)-500/nで� ��り、ここで、Nはハイブリッド中の塩基数で あり、そして[Na ⁺ ]は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナ� �リウムイオン濃度である(1×SSCの[Na ⁺ ]=0.165M)。好ましくは、こうしたハイブリダイ ズする核酸は各々、少なくとも8ヌクレオチ� �(または、より好ましくは、少なくとも15ヌ� �レオチド、または少なくとも20ヌクレオチド 、または少なくとも25ヌクレオチド、または� ��なくとも30ヌクレオチド、または少なくと� �40ヌクレオチド、または最も好ましくは少な くとも50ヌクレオチド)、またはそれがハイブ リダイズする核酸の長さの少なくとも1%(より 好ましくは少なくとも25%、または少なくとも 50%、または少なくとも70%、そして最も好まし くは少なくとも80)である長さを有し、それが ハイブリダイズする核酸と少なくとも50%(よ� �好ましくは少なくとも70%、少なくとも75%、� �なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%� �少なくとも95%、少なくとも97.5%、または少な くとも99%、そして最も好ましくは少なくとも 99.5%)の配列同一性を有する。ここで配列同一 性は、上記により詳しく記載されるように、 重複部分と同一性を最大化する一方、配列ギ ャップを最小化するように並列された、ハイ ブリダイズする核酸の配列を比較することに よって決定される。

 核酸の同一性パーセントは、視覚的検査� ��よび数学的計算によって決定することが可� ��である。あるいは、2つの核酸配列のパーセ ント同一性は、目視検査と数学的計算により 決定可能であるか、またはより好ましくは、 この比較はコンピュータ・プログラムを使用 して配列情報を比較することによってなされ る。代表的な、好ましいコンピュータ・プロ グラムは、遺伝学コンピュータ・グループ(GC G;ウィスコンシン州マジソン)のウィスコンシ ン・パッケージ、バージョン10.0プログラム� �GAP」である(Devereuxら、1984、Nucl.Acids Res.12:387 )。この「GAP」プログラムの使用により、2つ� ��核酸配列の比較の他に、2つのアミノ酸配列 の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を 行うことができる。ここで、「GAP」プログラ ムの好ましいデフォルトパラメーターには:(1 )ヌクレオチドについての(同一物について1、 および非同一物について0の値を含む)一元(una ry)比較マトリックスのGCG実行と、Schwartzおよ� ��Dayhoff監修「ポリペプチドの配列および構造 のアトラス(Atlas of Polypeptide SequenceおよびStr ucture)」国立バイオ医学研究財団、353-358頁、1 979により記載されるような、GribskovおよびBurg ess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986の加重アミノ酸比較� ��トリックス;または他の比較可能な比較マト リックス;(2)アミノ酸の各ギャップについて30 のペナルティと各ギャップ中の各記号につい て追加の1のペナルティ;またはヌクレオチド� ��列の各ギャップについて50のペナルティと� �ギャップ中の各記号について追加の3のペナ� ��ティ;(3)エンドギャップへのノーペナルティ :および(4)長いギャップへは最大ペナルティ� �し、が含まれる。当業者により使用される� �の配列比較プログラムでは、例えば、国立� �学ライブラリーのウェブサイト:http://www.ncbi. nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可 能なBLASTNプログラム、バージョン2.2.7、また� ��WU-BLAST2.0アルゴリズムが使用可能である。WU -BLAST2.0についての標準的なデフォルトパラメ ーターの設定は、以下のインターネットサイ ト:http://blast.wustl.eduに記載されている。さら� ��、BLASTアルゴリズムは、BLOSUM62アミノ酸スコ ア付けマトリックスを使用し、使用可能であ る選択パラメーターは以下の通りである:(A)� �い組成複雑性を有するクエリー配列のセグ� �ント(WoottonおよびFederhenのSEGプログラム(Comput ers and Chemistry,1993)により決定され;Woottonおよ びFederhen,1996「配列データベースにおける組� �編重領域の解析(Analysis of compositionally biased  regions in sequence databases)」Methods Enzymol.266:5 44-71も参照されたい)、または、短周期性の内 部リピートからなるセグメント(Claverieおよび States(Computers and Chemistry,1993)のXNUプログラム� ��より決定される)をマスクするためのフィル ターを含むこと、および(B)データベース配列 に対する適合を報告するための統計学的有意 性の閾値、またはE-スコア(KarlinおよびAltschul, 1990)の統計学的モデルにしたがって、単に偶� ��により見出される適合の期待確率;ある適合 に起因する統計学的有意差がE-スコア閾値よ� ��大きい場合、この適合は報告されない);好� �しいE-スコア閾値の数値は0.5であるか、また は好ましさが増える順に、0.25、0.1、0.05、0.01 、0.001、0.0001、1e-5、1e-10、1e-15、1e-20、1e-25、1 e-30、1e-40、1e-50、1e-75、または1e-100である。

 同様に、本発明のスフィンゴリピッド δ 4-デサチュラーゼ遺伝子(DES1)には、1つまたは 複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、 配列番号1の塩基配列とは異なるが、スフィ� �ゴリピッド δ4-デサチュラーゼ活性を有す� �タンパク質をコードする核酸を含む。スフ� �ンゴリピッド δ4-デサチュラーゼ活性を有� �るタンパク質をコードする限り、欠失、挿� �または置換される塩基の数は特に制限され� �いが、好ましくは1個ないし数千個、より好� ��しくは1個ないし千個、さらにこのましくは 1個ないし500個、さらにより好ましくは1個な� ��し200個、最も好ましくは1個ないし100個であ る。

 既定のアミノ酸を、例えば同様の物理化� ��的特性を有する残基により置換してもよい� ��こうした保存的置換の例には、1つの脂肪族 残基を互いに、例えばIle、Val、Leu、またはAla を互いに置換するもの;LysおよびArg、Gluおよ� �Asp、またはGlnおよびAsn間といった、1つの極� ��残基から別のものへの置換;あるいは芳香族 残基の別のものでの置換、例えばPhe、Trp、ま たはTyrを互いに置換するものが含まれる。他 の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を 有する領域全体の置換が、周知である。当業 者は、周知の遺伝子工学的手法により、Sambro okら(2001)(上述)等に記載の、例えば部位特異� �突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、� �入または置換を施すことが可能である。

  小胞体局在化シグナル付スフィン ゴリピッド δ4-デサチュラーゼ遺伝子(DES1m)
 本発明の、小胞体局在化シグナル付スフィ� ��ゴリピッド δ4-デサチュラーゼ遺伝子(DES1m) は、上述したスフィンゴリピッド δ4-デサチ ュラーゼ遺伝子(DES1)の3’末端に酵母の小胞� �局在化シグナルをコードする塩基配列を付� �した遺伝子である。「酵母の小胞体局在化� �グナル」は、当業者において周知であり、� �発明の方法において、任意の小胞体局在化� �グナルを利用可能である。

 例えば、限定されるわけではないが、以� ��の文献には、2個以上のリジン残基を含む4� �は5個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列� ��有する、典型的な酵母の局在化シグナルが� ��示されている。

 EMBO J. 9:3153-3162, 1990(非特許文献15)
 J Cell Biol. 127:653-665, 1994(非特許文献16)
 Science. 263:1629-1631, 1994(非特許文献17)
 Cell. 79:1199-1207, 1994(非特許文献18)
 Eur J Cell Biol. 64:211-216, 1994(非特許文献19)
 Annu Rev Cell Dev Biol. 12:27-54, 1996(非特許文� ��20)
 本発明の「酵母の小胞体局在化シグナル」� ��、好ましくは、「2個以上のリジン残基を含 む4又は5個のアミノ酸残基からなるアミノ酸� ��列を有するもの」である。より好ましくは� ��小胞体局在化シグナルのアミノ酸配列は、K KX ₁ X ₂ 又はKX ₁ KX ₂ X ₃ (Kはリジン残基を、そしてX ₁ 、X ₂ 、X ₃ は、任意の同一又は別個のアミノ酸残基を表 す)を含む。最も好ましい小胞体局在化シグ� �ルのアミノ酸配列の一態様として、本明細� �中の実施例に記載のVKKEK(Vはバリン残基を、K はリジン残基を、Eはグルタミン酸を表す)が� ��まれる。

 本発明の小胞体局在化シグナル付スフィ� ��ゴリピッド δ4-デサチュラーゼ遺伝子(DES1m) のシグナル部分以外、即ちスフィンゴリピッ ド δ4-デサチュラーゼ遺伝子(DES1)は特に限定 されず、「スフィンゴリピッド δ4-デサチュ ラーゼ遺伝子(DES1)」の項目で上述した通りで ある。好ましくは、配列番号2のアミノ酸配� �をコードする。よって、DES1m遺伝子は、配列 番号2のアミノ酸配列+VKKEK、即ち配列番号4の� ��ミノ酸配列からなるタンパク質をコードす� ��。DES1m遺伝子の核酸配列は、典型的には配� �番号3の塩基配列からなる。配列番号3以外で も遺伝子縮重より配列番号4のアミノ酸配列� �コードする塩基配列も含まれる。

 「酵母の小胞体局在化シグナル」は、「2 個以上のリジン残基を含む4又は5個のアミノ� ��残基からなるアミノ酸配列を有するもの」� ��外でも、多様なものが知られている。限定� ��れるわけではないが、例えば小胞体局在の� ��カニズムが知られており本発明の方法に利� ��可能である。

 J Cell Biol. 127:21-28, 1994(非特許文献21)
 アミノ酸配列HDELを有するタンパク質がゴル ジ体より小胞体に回収されることを記載して いる。HDELと同様にKDELも小胞体局在化シグナ� ��として公知である。

 J Biol Chem. 273:33273-33278, 1998(非特許文献22)
 膜貫通ドメイン中の決定因子(群)が、小胞� �への回収に機能していることを開示してい� �。

 J Cell Biol. 152:935-944, 2001(非特許文献23)
 ゴルジ体膜タンパク質の一種が、小胞体膜� ��ンパク質における膜貫通ドメイン中の回収� ��グナルと相互作用して、小胞体への回収に� ��与することを記載している。

 なお、酵母細胞以外の細胞を本発明の製� ��方法における形質転換のための宿主細胞と� ��て利用することも可能である。宿主細胞と� ��ては、哺乳動物細胞(ヒト、マウス、ラット など)、昆虫細胞などが含まれる。これらの� �種細胞において小胞体局在化のためのシグ� �ルが知られており、使用する細胞の種類に� �じた小胞体局在かシグナルを利用可能であ� �。

  酵母スフィンガニン C4-ヒドロキ� ��ラーゼ遺伝子(SUR2)
 本発明の方法は構成要件2)として、酵母細� �の形質転換によって、酵母スフィンガニン  C4-ヒドロキシラーゼ遺伝子(SUR2)の発現を欠失 させることを含む。

 限定されるわけではないが、SUR2は、好ま しくは、配列番号6のアミノ酸配列又は配列� �号6において1またはそれ以上のアミノ酸残基 が欠失、付加または置換しているアミノ酸配 列を有しており、かつ、スフィンガニン C4-� ��ドロキシラーゼ活性を有するタンパク質を� ��ードする。

 SUR2は、好ましくは配列番号5の塩基配列� �有する。これは配列番号6のアミノ酸配列を� ��する酵母スフィンガニン C4-ヒドロキシラ� �ゼタンパク質をコードする塩基配列であり� �例えば、SGD(Saccharomyces Genome Database, http://ww w.yeastgenome.org/)に開示されている。

 SUR2は、好ましくは配列番号6に記載のア� �ノ酸配列をコードする。しかしながら、こ� �に限定されることなく、1またはそれ以上の� ��ミノ酸配列が欠失、付加または置換してい� ��アミノ酸配列を有していてもよい。スフィ� ��ガニン C4-ヒドロキシラーゼ活性を有する� �り、全ての相同タンパク質を含むことが意� �される。配列番号6と同等の機能を有するア� ��ノ酸配列をコードする限り、配列番号6に限 定されるものではない。「アミノ酸変異」は 1から複数個、好ましくは、1ないし20個、よ� �好ましくは1ないし10個、最も好ましくは1な� ��し5個である。

 「スフィンガニン C4-ヒドロキシラーゼ� �性を有する」とは、例えば図2又は図3に示さ れているように、ジヒドロスフィンゴシンの C-4に水酸基を導入し、フィトスフィンゴシン を合成する活性を意味する。あるいは、ジヒ ドロセラミドのC-4に水酸基を導入し、フィト セラミドを合成する活性を意味する。本発明 では、酵母細胞の形質転換によって、SUR2の� �現を部分的又は完全に欠失させることによ� �て、酵母の天然の代謝経路では合成される� �フィトスフィンゴシン及び/又はフィトセラ� ��ドの合成を部分的又は完全に抑制させる。S UR2遺伝子発現の抑制と、DES1遺伝子発現によ� �、スフィンゴシン及び/又はセラミドNSの効� �的な合成が可能になる。

 SUR2にコードされるアミノ酸配列は、配列 番号6に記載のアミノ酸配列と、少なくとも� �70%、好ましくは約80%以上、より好ましくは90 %以上、さらに好ましくは95%以上、最も好ま� �くは98%以上の同一性を有する。

 本発明の好ましい酵母スフィンガニン C4 -ヒドロキシラーゼ遺伝子(SUR2)はまた、配列� �号5の塩基配列にストリンジェントな条件下� ��例えば、中程度又は高程度にストリンジェ� ��トな条件下でハイブリダイズすることが可� ��であり、かつ、酵母スフィンガニン C4-ヒ� �ロキシラーゼ活性を有する核酸を含む。

 同様に、本発明の酵母スフィンガニン C4 -ヒドロキシラーゼ遺伝子(SUR2)には、1つまた� ��複数の塩基の欠失、挿入または置換のため� ��配列番号5の塩基配列とは異なるが、スフィ ンガニン C4-ヒドロキシラーゼ活性を有する� ��ンパク質をコードする核酸を含む。

 「アミノ酸及び/又は塩基の欠失、付加、 置換」、「アミノ酸及び/又は塩基の同一性� �ーセント」、ハイブリダイゼーションの「� �トリンジェントな条件下」など、共通する� �項については、DES1について上述した通りで� ��る。

  酵母スフィンゴ脂質 α-ヒドロキ� ��ラーゼ遺伝子(SCS7)
 本発明の方法はさらに、酵母細胞の形質転� ��によって、酵母スフィンゴ脂質 α-ヒドロ� �シラーゼ遺伝子(SCS7)の発現を欠失させるこ� �を含んでもよい。SCS7は、例えば図3又は図7� �フィトセラミド、ジヒドロセラミド、セラ� �ドNSのスフィンゴイド塩基にアミド結合した 脂肪酸のα位の炭素に水酸基を付加し、各々C er(AP)、Cer(ASa)、Cer(AS)を合成する活性を有する 。SCS7活性の存在により、所望のジヒドロセ� �ミド、セラミドNSが合成されても、さらに水 酸化されてしまう。よって、本発明は好まし くは、SCS7の発現を欠失させることを含む。

 限定されるわけではないが、SCS7は、好ま しくは、配列番号8のアミノ酸配列又は配列� �号8において1またはそれ以上のアミノ酸残基 が欠失、付加または置換しているアミノ酸配 列を有しており、かつ、スフィンゴ脂質 α-� ��ドロキシラーゼ活性を有するタンパク質を� ��ードする。

 SCS7は、好ましくは配列番号7の塩基配列� �有する。これは配列番号8のアミノ酸配列を� ��する酵母スフィンゴ脂質 α-ヒドロキシラ� �ゼタンパク質をコードする塩基配列であり� �例えば、SGD(Saccharomyces Genome Database, http://ww w.yeastgenome.org/)に開示されている。

 SCS7は、好ましくは配列番号8に記載のア� �ノ酸配列をコードする。しかしながら、こ� �に限定されることなく、1またはそれ以上の� ��ミノ酸配列が欠失、付加または置換してい� ��アミノ酸配列を有していてもよい。スフィ� ��ゴ脂質 α-ヒドロキシラーゼ活性を有する� �り、全ての相同タンパク質を含むことが意� �される。配列番号8と同等の機能を有するア� ��ノ酸配列をコードする限り、配列番号8に限 定されるものではない。「アミノ酸変異」は 1から複数個、好ましくは、1ないし20個、よ� �好ましくは1ないし10個、最も好ましくは1な� ��し5個である。

 「スフィンゴ脂質 α-ヒドロキシラーゼ� �性を有する」とは、例えば図7に示されてい� ��ように、フィトセラミド、ジヒドロセラミ� ��、セラミドNSのスフィンゴイド塩基にアミ� �結合している脂肪酸のα位の炭素に水酸基を 付加し、各々Cer(AP)、Cer(ASa)、Cer(AS)を合成す� �活性を有する、ことを意味する。本発明で� �、好ましくは、酵母細胞の形質転換によっ� �、SCS7の発現を部分的又は完全に欠失させる� ��とによって、ジヒドロセラミド、セラミドN Sの好ましくない水酸化を抑制する。

 SCS7にコードされるアミノ酸配列は、配列 番号8に記載のアミノ酸配列と、少なくとも� �70%、好ましくは約80%以上、より好ましくは90 %以上、さらに好ましくは95%以上、最も好ま� �くは98%以上の同一性を有する。

 本発明の好ましい酵母スフィンゴ脂質 α -ヒドロキシラーゼ遺伝子(SCS7)はまた、配列� �号7の塩基配列にストリンジェントな条件下� ��例えば、中程度又は高程度にストリンジェ� ��トな条件下でハイブリダイズすることが可� ��であり、かつ、酵母スフィンゴ脂質 α-ヒ� �ロキシラーゼ活性を有する核酸を含む。

 同様に、本発明の酵母スフィンゴ脂質 α -ヒドロキシラーゼ遺伝子(SCS7)には、1つまた� ��複数の塩基の欠失、挿入または置換のため� ��配列番号7の塩基配列とは異なるが、スフィ ンゴ脂質 α-ヒドロキシラーゼ活性を有する� ��ンパク質をコードする核酸を含む。

 「アミノ酸及び/又は塩基の欠失、付加、 置換」、「アミノ酸及び/又は塩基の同一性� �ーセント」、ハイブリダイゼーションの「� �トリンジェントな条件下」など、共通する� �項については、DES1について上述した通りで� ��る。

  酵母アルカリジヒドロセラミダー ゼ遺伝子(YDC1)
 本発明の方法はさらに、酵母細胞の形質転� ��によって、酵母アルカリジヒドロセラミダ� ��ゼ遺伝子(YDC1)の発現を欠失させることを含� ��でもよい。

 YDC1は、例えば図1-図3に示されているよう にジヒドロセラミドを分解してジヒドロスフ ィンゴシンを合成する活性を有するタンパク 質をコードする。YDC1活性は、セラミド合成� �いわば反対方向の反応を促進する活性であ� �、セラミドNS合成の材料となるジヒドロセラ ミドを減少させる。よって、本発明は好まし くは、YDC1の発現を欠失させることを含む。

 限定されるわけではないが、YDC1は、好ま しくは、配列番号10のアミノ酸配列又は配列� ��号10において1またはそれ以上のアミノ酸残� ��が欠失、付加または置換しているアミノ酸� ��列を有しており、かつ、アルカリジヒドロ� ��ラミダーゼ活性を有するタンパク質をコー� ��する。

 YDC1は、好ましくは配列番号9の塩基配列� �有する。これは配列番号10のアミノ酸配列を 有する酵母アルカリジヒドロセラミダーゼタ ンパク質をコードする塩基配列であり、例え ば、SGD(Saccharomyces Genome Database, http://www.yeast genome.org/)に開示されている。

 YDC1は、好ましくは配列番号10に記載のア� ��ノ酸配列をコードする。しかしながら、こ� ��に限定されることなく、1またはそれ以上の アミノ酸配列が欠失、付加または置換してい るアミノ酸配列を有していてもよい。アルカ リジヒドロセラミダーゼ活性を有する限り、 全ての相同タンパク質を含むことが意図され る。配列番号10と同等の機能を有するアミノ� ��配列をコードする限り、配列番号10に限定� �れるものではない。「アミノ酸変異」は1か� ��複数個、好ましくは、1ないし20個、より好� ��しくは1ないし10個、最も好ましくは1ないし 5個である。

 「アルカリジヒドロセラミダーゼ活性を� ��する」とは、例えば図1-図3に示されている� ��うにジヒドロセラミドを分解してジヒドロ� ��フィンゴシンを合成する活性を有する、こ� ��を意味する。本発明では、好ましくは、酵� ��細胞の形質転換によって、YDC1の発現を部分 的又は完全に欠失させることによって、好ま しくないジヒドロセラミドの分解を抑制する 。

 YDC1にコードされるアミノ酸配列は、配列 番号10に記載のアミノ酸配列と、少なくとも� ��70%、好ましくは約80%以上、より好ましくは9 0%以上、さらに好ましくは95%以上、最も好ま� ��くは98%以上の同一性を有する。

 本発明の好ましい酵母アルカリジヒドロ� ��ラミダーゼ遺伝子(YDC1)はまた、配列番号9の 塩基配列にストリンジェントな条件下、例え ば、中程度又は高程度にストリンジェントな 条件下でハイブリダイズすることが可能であ り、かつ、酵母アルカリジヒドロセラミダー ゼ活性を有する核酸を含む。

 同様に、本発明の酵母アルカリジヒドロ� ��ラミダーゼ遺伝子(YDC1)には、1つまたは複数 の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列 番号9の塩基配列とは異なるが、アルカリジ� �ドロセラミダーゼ活性を有するタンパク質� �コードする核酸を含む。

 「アミノ酸及び/又は塩基の欠失、付加、 置換」、「アミノ酸及び/又は塩基の同一性� �ーセント」、ハイブリダイゼーションの「� �トリンジェントな条件下」など、共通する� �項については、DES1について上述した通りで� ��る。

  酵母の形質転換による遺伝子の導 入及び発現方法
 本発明において、酵母細胞内におけるDES1m� �発現は限定されず、公知の方法を用いて行� �ことが可能である。好ましくは、DES1mを含む 発現ベクターで宿主酵母細胞を形質転換し、 そして、核酸の発現を可能にする条件下で形 質転換酵母細胞を培養する、ことを含む。

 本発明の方法に利用可能な酵母は、限定� ��れるわけではないが、好ましくは、サッカ� ��ミセス属(Saccharomyces)由来の酵母である。よ� ��好ましくは、サッカロミセス・セレビジエ� ��サッカロミセス・パストリアヌス、サッカ� ��ミセス・バイヤヌス、サッカロミセス・ク� ��ベリである。サッカロミセス属を含む出芽� ��母は、遺伝子レベルでセラミドの合成・代� ��の解析が最も進んでいる。そのため、本発� ��のヒト型セラミドの製造方法を迅速に最適� ��することが可能である。また酵母細胞は培� ��が容易で、また、伝統的に食品製造に利用� ��れている。簡便、安全、安価にセラミドを� ��量に抽出・精製する方法を確立することが� ��能である。

 本発明において、遺伝子の導入・発現の� ��めに公知の酵母発現ベクターを使用可能で� ��る。本発明の実施例では、公知の酵母用遺� ��子発現ベクターpRS series(p4XX)(Mumberg et al.,  Gene, 156, 119, 1995)及びpYE22m(Ashikari et al., App l Microbiol Biotechnol,30, 515, 1989)を使用した。

 酵母に導入する際に用いるベクターとし� ��は、多コピー型(YEp型)、単コピー型(YCp型)、 染色体組み込み型(YIp型)のいずれもが利用可� ��である。例えば、YEp型ベクターとしてはYEp2 4 (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of  Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983 )、YCp型ベクターとしてはYCp50 (M. D. Rose et  al., gene, 60, 237, 1987)、YIp型ベクターとして� ��YIp5(K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,  76, 1035, 1979)等多数の酵母用発現ベクター� �当業者に公知であり、本発明の方法に利用� �能である。

 発現ベクターは、各遺伝子の他に、一般� ��に、宿主における増殖のため、選択可能マ� ��カーおよび複製起点を含むベクター内に含� ��されることが可能である。ベクターにはさ� ��に、好ましくは酵母由来の適切な転写また� ��翻訳制御配列が、所望により本発明の核酸� ��連結されて、含まれる。

 制御配列の例には、転写プロモーター、� ��ペレーター、またはエンハンサー、mRNAリボ ソーム結合部位、並びに転写および翻訳開始 および終結を調節する適切な配列が含まれる 。ヌクレオチド配列は、制御配列が該DNA配列 に機能的に関連しているとき、機能可能であ るように連結されている。したがって、プロ モーターヌクレオチド配列は、該プロモータ ーヌクレオチド配列がDNA配列の転写を調節す るならば、DNA配列に、機能可能であるように 連結されている。宿主細胞において複製する 能力を与える複製起点、および形質転換体を 同定する選択遺伝子が、一般的に発現ベクタ ーに取り込まれている。選択マーカーとして は、通常使用されるものを常法により用いる ことができる。例えばテトラサイクリン、ア ンピシリン、またはカナマイシンもしくはネ オマイシン、ハイグロマイシンまたはスペク チノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子やHIS3� �TRP1などの栄養要求性遺伝子などが例示され� ��。

 酵母ベクターは、しばしば、2μ酵母プラ� ��ミド由来の複製起点配列、自律複製配列(ARS )、プロモーター領域、ポリアデニル化のた� �の配列、転写終結のための配列、および選� �可能マーカー遺伝子を含有するであろう。

 べクターは、簡便には当業界において入� ��可能な組換え用べクター(例えば、プラスミ ドDNAなど)に所望の遺伝子を常法により連結� �ることによって調製することができる。プ� �スミドなどのベクターに遺伝子のDNA断片を� �み込む方法としては、例えば、Sambrook,J., and  Russell, D.W. (2001). Molecular Cloning: A Laborator y Manual, 3rd ed. (New York: Cold Spring Harbor Lab oratory Press)に記載の方法などが挙げられる。 簡便には、市販のライゲーションキット(例� �ば、宝酒造製等)を用いることもできる。

 ベクターを宿主細胞に導入する方法とし� ��は、一般に、Sambrook,J.ら(2001)(上述)に記載の リン酸カルシウム法または塩化カルシウム/� �化ルビジウム法、エレクトロポレーション� �、エレクトロインジェクション法、PEGなど� �化学的な処理による方法、遺伝子銃などを� �いる方法などが挙げられる。

  酵母の形質転換による各遺伝子の 欠失方法
 本発明の方法は、酵母細胞の形質転換によ� ��て、酵母スフィンガニン C4-ヒドロキシラ� �ゼ遺伝子(SUR2)の発現を欠失させること、を� �む。

 本発明の方法はさらに、好ましい態様にお� ��て、
 酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィ� ��ゴ脂質 α-ヒドロキシラーゼ遺伝子(SCS7)の� �現を欠失させること;及び
 酵母細胞の形質転換によって、酵母アルカ� ��ジヒドロセラミダーゼ遺伝子(YDC1)の発現を� ��失させること
のいずれか、あるいはこれらの組み合わせを 含む。

 本発明において、各遺伝子の発現を欠失� ��せるとは、各遺伝子によってコードされる� ��ンパク質活性が発揮されないことを意味す� ��。酵母細胞のゲノム上の各遺伝子を破壊す� ��、遺伝子の転写を阻害する、遺伝子からタ� ��パク質の翻訳を阻害する、タンパク質が翻� ��されても活性の発揮を阻害する、など結果� ��に遺伝子によってコードされるタンパク質� ��性が発揮されなければ、本発明の方法にお� ��る目的を達成するため、本発明の範囲に含� ��れる。欠失は、部分的な欠失であっても完� ��な欠失であってもよい。典型的には、母細� ��のゲノム上の各遺伝子を破壊し、遺伝子を� ��分的又は完全に欠失させる。

 SUR2、SCS7、YDC1の各遺伝子の発現の欠失は� ��知の方法によって行うことができる。

 例えば、本明細書中の実施例では各遺伝� ��の上流及び下流の塩基配列、及び選択マー� ��ーを連結させたDNA断片を用い、酵母の天然� ��ゲノム配列との相同組換えによって、各遺� ��子を欠失させた。

 遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝� ��における遺伝子産物の発現に関与する領域� ��例えば、コード領域やプロモーター領域の� ��部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるい� ��欠失させたり、これらの領域全体を欠失さ� ��ることにより行うことができる。このよう� ��遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照す� ��ことができる(例えば、Yeast 10, 1793 (1994)、 Yeast 15,1541(1999)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,� �4951(1979) 、Methods in Enzymology, 101, 202(1983)な ど参照)。

 遺伝子破壊以外にも、本発明の目的のた� ��に、各遺伝子の発現を抑制する方法として� ��、アンチセンス法(例えば、平島および井上 : 新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製� �発現 (日本生化学会編, 東京化学同人) pp.31 9-347, 1993などを参照)、RNAi法(特表2002-516062号� ��報; 米国特許公開公報第2002/086356A号; Nature� �Genetics, 24(2), 180-183, 2000などを参照)、リボ� ��イムによる方法(FEBS Lett. 228: 228, 1988; FEBS  Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059,� �1989などを参照)、共抑制による方法(例えば� �Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997、Martienssen R:  Curr. Biol. 6: 810, 1996など参照)などが挙げ� �れる。

  セラミド合成の確認方法
 本発明の方法によって、製造されたヒト型� ��ラミド(セラミドNS)は、公知の方法を用いる ことによって、抽出・精製することができる 。本発明の方法は、酵母細胞を使用するため 、大量の培養、セラミドの簡便かつ迅速な抽 出・精製が可能である。精製されたセラミド は、公知のスフィンゴイド分析のための方法 を用いて確認することが可能である。分析方 法は、例えば、図4に示すTLCやHPLC、マススペ� ��トル(例えば、LC-MS、LC-MS/MS、FT-MS)等を含む� �