SECTOR TECNICO

Esta tecnología está relacionada con la industria agrícola, en particular se presenta una cepa bacteriana como bioestimulante con propiedades antifúngicas para la promoción del crecimiento en plantas.

ESTADO DEL ARTE

La agricultura sostenible debe garantizar la seguridad alimentaria mundial y al mismo tiempo promover ecosistemas saludables y apoyar la gestión sostenible de la tierra, el agua y los recursos naturales. Para ello la agricultura debe satisfacer las necesidades de las generaciones presentes y futuras de sus productos y servicios, garantizando al mismo tiempo la rentabilidad, la salud del medio ambiente y la equidad social y económica (FAO). Actualmente el incremento de la población mundial ha requerido un aumento en los rendimientos de los cultivos para mantener la rentabilidad y cumplir con las exigencias de los mercados en calidad, sanidad y producción, para esto recurren al uso de agroquímicos y fertilizantes minerales los que están siendo cuestionados por su efecto sobre la salud humana (Wolansky, 2011), problemas de eutrofización, deficiencia de Zn y una disminución en la actividad y diversidad de la microbiota nativa presente en los suelos (Babalola y Glick, 2012).

En este contexto el desarrollo de nuevos productos orientados a promover ecosistemas saludables, mejorando la rentabilidad cobran un enorme valor para ayudar a resolver la problemática agrícola actual. Estos productos en Chile los podemos encontrar como "bioestimulantes", la gran mayoría de estos son a base de algas, y los que son a base de microorganismos su principal función es el control de enfermedades basándose principalmente en el uso de bacterias del genero Bacillus. De los bioestimulantes a base de microorganismos (Biológicos) comercializados en Chile al menos del 50% que se utilizan son importados (Red Agrícola, 2017), las respuestas de estos productos en los cultivos son variables ya que su comportamiento se ve afectado por el ambiente, el cual está estrechamente relacionado con el entorno de donde fueron aislados, presentando una menor adaptabilidad a las condiciones de suelo y ambiente que hay en Chile (Toju et al., 2018).

A nivel de investigación, la tendencia está enfocada en bacterias promotoras de crecimiento (PGPR: "Plant Growth Promoting Rhizobacteria") aplicadas como controladores biológicos, mientras que sus propiedades de promoción directa de crecimiento (solubilización de fósforo, producción de AIA, otras) han sido estudiadas ampliamente bajo condiciones in vitro o controladas, pero con pocas experiencias a nivel de terreno donde pocas veces poseen resultados significativos en campo (Backer et al., 2018). Poblaciones de Pseudomona fluorescens han sido caracterizadas por producir antibióticos como 2,4-diacetilfloroglucinol (2,4-DAPG), pioluteorina, pirrolnitrina, ácido fenazina-l-carboxílico 2-hidroxi fenacinas y fenazina-l-carboxamida (Dilantha et al., 2005). Gaeumannomyces graminis var. tritici s altamente susceptible a 2,4-DAPG, y la interacción bacteria - planta se ve beneficiada por el monocultivo, generando un declive de la enfermedad a través de los años de monocultivo sin generar una resistencia por parte del hongo (Weller et al., 2002). Este declive o supresión de la enfermedad ha sido descrito en el mundo (Weller et al., 2002) y en Chile (Campillo et al., 2001) en predios donde continuamente se cultiva trigo. Pseudomonas fluorescens que producen compuestos como 2,4-DAPG también han demostrado actividad promotora de crecimiento indirecta al controlar la enfermedad en trigo, pero también promoción de crecimiento vegetal (Campillo et al., 2001).

Investigaciones realizadas en Chile, determinaron la presencia de bacterias Pseudomonas protegens con genes antimicrobiales asociados a la producción de 2,4- DAPG, pioluteorina y pirrolnitrina y con actividad inhibitoria sobre G. graminis var. tritici y otros hongos que afectan trigo (Moya-Elizondo et al., 2013; Cattan, 2014), mientras en trabajos realizados por Moya-Elizondo y Tejeda-Tribiño (2014) se han aislado bacterias desde papas nativas chilenas con actividad quitinolítica, glucanolítica y de producción de surfactantes, lo cual muestra el potencial de la microflora presente en suelos del sur Chile para el control de enfermedades, pero no se conoce si estas cepas chilenas tienen algún efecto promotor de crecimiento. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1: Se observa los halos de solubilización de fosfato formados por algunas cepas chilenas de Pseudomonas protegens y Pantoea spp. sobre medio Pikovskaya Figura 2: Agrupación por capacidad de solubilización cuantitativa de fosfato para distintas cepas de Pseudomonas protegens y Pantoea spp. en medio líquido Pikovskaya la cual fue determinada por análisis de conglomerados de Ward. Se observa que la cepa Ca6 obtuvo los valores más altos para la solubilización de fosfato.

Figura 3: Agrupación por capacidad de producción de ácido indol - 3 - acético (AIA) para distintas cepas de Pseudomonas protegens y Pantoea spp. determinado por el análisis de conglomerados de Ward.

Figura 4: Promedio de resultados de producción de AIA de la cepa bacteriana Ca6 en diferentes medios de cultivos, donde los medios -T son medios con triptófano y los -S poseen las sales del medio de cultivo KB. Figura 5: Promedio de tres mediciones del porcentaje de atizonamiento en el cultivo de la papa.

Figura 6: Promedio del rendimiento de las tres hileras centrales, para cada uno de los tratamientos en el cultivo de la papa.

Figura 7: Promedio de la sumatoria del número de frutos por planta, de tres mediciones, para cada uno de los tratamientos en un huerto comercial de frutillas cv. San Andrea.

Figura 8: Promedio del número de frutos por planta de tres mediciones realizadas en diferentes fechas para cada uno de los tratamientos en un huerto comercial de frutillas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente tecnología corresponde al uso de una cepa bacteriana como Bioestimulante con propiedades antifúngicas para la promoción del crecimiento en plantas.

La invención se basa en el uso de la cepa bacteriana para la promoción del crecimiento, la cuales además producen compuestos antimicrobiales. Esta tecnología corresponde a la cepa de Pseudomonas protegens Ca6, depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos con número de registro RGM 2331, la cual fue depositada con fecha 30 de septiembre de 2016.

Esta bacteria fue aislada desde suelos Andisoles, los cuales constituyen sólo el 1% de los suelos del mundo (FAO), esto explica que las características que presenta esta bacteria es poco común y permite suponer que no está ampliamente distribuida a nivel mundial y que poseen una mayor adaptabilidad a los suelos y condiciones climáticas que hay en Chile.

El bioestimulante comprende a una suspensión bacteriana líquida >10 ⁸ UFC mL ^{~ 1} obtenida de la fermentación de la cepa bacteriana en medio líquido King B (KB) por 48 horas a 24°C y 150 rpm de agitación. El medio KB es el mejor medio de cultivo para la formulación debido a que en este medio las bacterias aumentan su capacidad de producción de AIA.

El bioestimulante a base de esta cepa bacteriana aislada en Chile, aumenta el rendimiento de los cultivos a través de mecanismos como son la producción de la fitohormona ácido indol acético (AIA) y la solubilización de fósforo (P) (Figura 1, 2 y 3). La producción de una fitohormona es de gran importancia ya que son moléculas que en bajas concentraciones son capaces de generar estímulos sobre las plantas, siendo el AIA una de las fitohormonas que causa mayor estímulo sobre las plantas, principalmente promoviendo el crecimiento de raíces. Por otra parte la solubilización de fosfato (P) es de gran importancia ya que los datos obtenidos en el estudio previo de esta bacteria los valores fueron altos comparadas con otras bacterias, por lo que poseen ventajas comparativas, más aun dentro del país donde los suelos poseen una gran cantidad de P inmovilizado lo que obliga a los productores aplicar grandes cantidades de P aumentando los costos de producción, por lo tanto el uso de estas bacterias implicaría una disminución ya que utilizan el fósforo que se encuentra inmóvil en el suelo. Todos estos datos indican que esta cepa es capaz de promover el crecimiento vegetal a través de dos mecanismos, la producción de AIA (Figura 3) y principalmente por la solubilización de fósforo (Figura 2) y de forma indirecta son capaces de controlar enfermedades mejorando el estado fitosanitario en plantas, por la producción de compuestos antimicrobianos. Estos resultados son contrastados con los bioestimulantes presentes en el mercado los cuales son principalmente solubilizadores de fosforo, pero no son productores de AIA.

El bioestimulante presenta una alta adaptabilidad al suelo chileno, promoviendo el crecimiento de la planta, garantizando disponibilidad y absorción de macronutrientes como el fósforo, la producción de la fitohormona (AIA), y además protege los cultivos contra diversos patógenos.

La recomendación de aplicación de este producto, debido a sus características de protección, debiera estar de acuerdo al siguiente modelo: a) Papas: a. Tratamiento del tubérculo: Aplicación a la siembra directa al tubérculo mediante la aplicación al surco de siembra usando una pulverizador manual o al usar maquinaria de siembra de papa con boquilla integrada, la aplicación del producto puede ser en conjunto con fungicidas o de forma individual. Esta aplicación permite lograr la colonización endófita inicial, para lograr una emergencia homogénea del cultivo junto con la protección inicial de la plántula. b. Tratamientos foliares: Las aplicaciones foliares son mediante pulverizadoras manuales o mecánicas, y se recomienda realizar al menos tres aplicaciones en la temporada para lograr un aumento en los rendimientos, las cuales pueden ser alternadas con aplicaciones de fungicidas para mejorar el efecto de control de enfermedades. b) Frutillas a. Tratamiento de raíces: para lograr una colonización endófita inicial de las bacterias en las plantas las raíces y/o coronas deben ser suspendidas en la solución liquida durante 10 minutos previo al transplante. b. Tratamiento foliar: Las aplicaciones foliares son mediante pulverizadoras manuales o mecánicas, y se recomienda realizar al menos tres aplicaciones en la temporada para lograr un aumento en los rendimientos, las cuales pueden ser alternadas con aplicaciones de fungicidas para mejorar el efecto de control de enfermedades.

EJEMPLOS DE APLICACIÓN

Ejemplo 1: aislamiento y caracterización de las cepas.

La bacteria Ca6 (RGM 2331) que corresponde a la especie de Pseudomonas protegens, fue obtenida desde el sector de Cajón, lugar ubicado en la región de la Araucanía, se caracteriza por producir diferentes compuestos antimicrobiales como es el 2,4- diacetilfloroglucinol (2,4-DAPG), pioluteorina y pirrolnitrina. La caracterización de la especie se hizo mediante análisis de gen 16S ARNr, y amplificación con partidores específicos de los genes ph/D, pltB, y prnC asociados a la producción de 2,4-DAPG, pioluteorina y pirrolnitrina, respectivamente. Cabe hacer notar que las bacterias con que se está trabajando en esta propuesta están genéticamente secuenciadas en el gen 16S ARN ribosomal, y corresponden a especies de Pseudomonas protegens que tienen mutaciones en su secuencia genómica que las hacen diferentes de otras especies descritas en los Banco de secuencia de genes existentes a nivel mundial. Por otra parte, estas cepas han demostrado habilidad para solubilizar fósforo inmovilizado, producir ácido indól acético y otras propiedades biosurfactantes, los cuales no son características comunes de aislados de la misma especie, como P. protegens cepa Pf5 aislado en Estados Unidos (Paulsen et al., 2005; Ramette et al., 2011).

Ejemplo 2: pruebas de solubilización fosforo y producción de AIA.

Las pruebas fueron realizadas sobre diferentes cepas, incluida la Cepa Ca6. Para cuantificar la capacidad de solubilización de fosfato de las cepas bacterianas se utilizó el medio líquido de Pikovskaya. Las bacterias fueron inoculadas en el medio y se determinó la solubilización cuantitativa de fosfato. Las cepas Ca6 fue capaz de solubilizar el fósforo a 123,3 mg L ¹ (Figuras 1 y 2). Estos resultados concuerdan con los reportados por Kumar et al. (2014) en donde utilizaron cepas del género Pseudomonas las cuales solubilizaron fosfato alcanzando un máximo de 15,19 mg de P ₂ O ₄ L ^_1 , valores que fueron ocho veces menor a lo observado en la cepa Ca6 que alcanzó un máximo de 123,3 mg de P ₂ O ₄ L ^_1 . Para realizar la medición de la producción de AIA por las bacterias se multiplicaron en agar soya tripticasa y se incubaron durante 48 h. Para evaluar la concentración de AIA se realizó mediante la metodología descrita por Bric et al., 1991. La cepa Ca6 obtuvo niveles de producción de AIA de 0,79 mg L ^(Figura 3).

Ejemplo 3: Formulación.

El formulado comprende a una suspensión bacteriana líquida >10 ⁸ UFC mL ¹ obtenida de la fermentación de la cepa bacteriana en medio líquido King B (KB) por 48 horas a 24°C y 150 rpm de agitación. Para su preparación se toma una alícuota de 10 pL de la cepa original de la bacteria que se mantiene en 20% glicerol a -80°C, y se coloca a crecer en 10 mL de medio KB por 48 horas para después inocular con 2 mL de esta suspensión (~10 ⁷ UFC mL ¹ ) por 100 mL. El medio KB es el mejor medio de cultivo para la formulación debido a que en este medio las bacterias aumentan su capacidad de producción de AIA (Figura 4).

Esta formulación posee una probada efectividad en la promoción del crecimiento al aplicarla en concentraciones al 5% diluida en agua. Se debe preparar de forma fresca para cada aplicación, pero se puede conservar refrigerada a 4°C por 30 días, en los cuales sobreviven las bacterias.

Ejemplo 4: pruebas sobre cultivos.

Se realizaron ensayos en campo en diferentes cultivos y zonas geográficas. Las cepas dispuestas en la formulación fueron aplicadas a las raíces en el caso de las frutillas previo al trasplante, mientras que en el cultivo de la papa las cepas bacterianas fueron aplicadas directo a las semillas. Posterior a la aplicación inicial se realizaron entre 3 a 4 aplicaciones de forma foliar formuladas en caldo de cultivo KB, obteniendo diversos resultados en la promoción del crecimiento asociados a un aumento de los rendimientos, los resultados varían según cultivo donde fueron aplicadas las bacterias:

1. Papas: El ensayo fue establecido el 3 de octubre del 2019 en el campo experimental "El Nogal" en la localidad de Chillán. Se utilizaron papas de la variedad PUKARA, que es la más plantada en la región, el ensayo estuvo conformado por doce tratamientos y cuatro repeticiones aplicadas en parcelas de 20 m ² con 5 hileras de 4 m de largo, los tubérculos se plantaron aproximadamente cada 33 cm (3 tubérculos por metro). Los tratamientos fueron aplicados en el momento de la plantación sobre los tubérculos con una pulverizada. Para la preparación de los formulados se dejaron creciendo las bacterias en caldo KB durante 48 horas en un agitador orbital a 150 rpm con una temperatura de 25 °C, además de aplicar los tratamientos 11 parcelas se inocularon con el hongo de Rhizoctonia sotaní dejando una como control sano, para asegurar que la enfermedad este presente y poder medir parámetros de control de enfermedades de parte de las bacterias. Durante el desarrollo del cultivo se realizaron dos aplicaciones de los tratamientos, una cuando alcanzó la emergencia total de las plantas, y la siguiente cuando estaba en el 50% de la floración. Además se realizaron dos aplicaciones de fungicidas y una aplicación de fertilizantes nitrogenados en la primera aporca del cultivo. Para determinar la capacidad de promoción del crecimiento de parte de las bacterias aplicadas, en el establecimiento del cultivo se realizó en todos los tratamientos con bacterias una fertilización al 50% (Nitrógeno, fósforo y potasio), en los tratamientos TI y T2 que son los controles se aplicó una cantidad de fertilizantes igual a la de un establecimiento comercial para el desarrollo normal del cultivo. En el cultivo de papas la cepa Ca6 aumentó los rendimientos con una fertilización al 50% comparado al control en un 17,6%, por otra parte, fue capaz de disminuir el atizonamiento de las plantas en un 56% con respecto al control sin bacterias Ctrl positivo (Figura 5 y 6).

2. Frutillas: Se plantaron frutillas del cv. San Andrea el 17 de noviembre del 2018, en la localidad de San Nicolás en un huerto comercial de un usuario de Prodesal. Para el establecimiento del ensayo se aplicaron 6 tratamientos más un control agua y un control positivo basado en una formulación comercial de Trichoderma que es lo que utilizan actualmente los productores de la zona para disminuir las enfermedades y aumentar el crecimiento de las plantas. Cada uno de los tratamientos con cuatro repeticiones, una parcela correspondió a 24 plantas de frutillas. Para la formulación de los tratamientos se dejaron creciendo las bacterias en caldo KB durante 48 horas en un agitador orbital a 150 rpm con una temperatura de 25 °C. Para cada tratamiento se aplicaron los formulados a la raíz de la planta, se embebió la raíz con los tratamientos antes de ser plantadas. Para realizar las mediciones solo se midieron las 16 plantas centrales dejando 8 plantas de borde por cada una de las parcelas. Posterior a la plantación se realizaron aplicaciones cada 15 días de los formulados durante el periodo diciembre-marzo mediante pulverización. A todos los tratamientos se les realizo una fertilización en enero vía riego. Durante el periodo de floración y fructificación del cultivo se realizaron tres evaluaciones, en febrero las temperaturas y la falta de agua redujo drásticamente la producción por lo que no se realizaron mediciones hasta marzo, periodo en que la planta. En el huerto comercial de frutillas la bacteria Ca6 logro aumentar el número de frutos en un 39,1% con respecto al control en el cual utilizan un producto comercial a base de Trichoderma. (Figura 7 y 8).