Sector Técnico

Esta tecnología está relacionada con la industria apícola, en particular se presenta una formulación bioestimulante probiótica para abejas (Apis mellifera L.)

Estado del arte

Las colonias de abejas han sufrido un declive sin precedentes, con graves consecuencias en la producción apícola y polinización de los cultivos, siendo una de las principales causas la presencia de parásitos y patógenos; entre los que destacan, el microsporidio Nosema ceranaey el virus de las alas deformadas (DWV). Infecciones de N. ceranaey DWV pueden provocar una supresión del sistema inmune y una reducción en la longevidad de las abejas, induciendo una despoblación de la colonia en un corto plazo (Higes et al., 2009; Schroeder y Martin, 2012). Por lo tanto, estos patógenos son una de las amenazas más significativa de la apicultura actual a nivel mundial. En Chile, se han detectado prevalencias de DWV y N. ceranae cercanas al 50% (Vargas et al., 2017), siendo N. ceranae asociado a mortalidades invernales de abejas en el país (Maggi et al., 2016). De hecho, el último censo 2017-2018 de mortalidades invernales de colmenas arrojó un promedio de 30% en Latinoamérica, alcanzando hasta un 50% en Chile (Sociedad Latinoamericana en Estudios en Abejas, SOLATINA, datos no publicados aún).

Considerando que en el país hay cerca de 800 mil colmenas (ODEPA, 2018), y de acuerdo a los datos de SOLATINA, la mitad de éstas perecieron en la temporada anterior (2017-2018), lo cual equivale aproximadamente 40 mil millones de pesos en pérdidas asociados a problemas sanitarios. Por lo tanto, problemas de mortalidades asociadas a N. ceranae y DWV, son de gran relevancia para la apicultura nacional e internacional. No obstante aquello, el único antibiótico disponible para control de N. ceranae, la Fumagilina-B, es cuestionado por sus efectos en la fisiología de las abejas y por generar residuos en la cera y en la miel (Huang et al., 2013; Van den Heever et al., 2016), lo cual ha provocado que el mercado Europeo no permita su uso. Además, actualmente i este producto ya no es producido en USA (https://amencanbeejournal.com/life-without- fumagilin), mercado que abastecía de Fumagilina-B a los productores apícolas de Latinoamérica, incluyendo Chile. Similarmente, no hay productos comerciales disponibles para el control de virus y menos para el control y/o manejo de DWV en abejas. Por lo tanto, actualmente hay una tremenda oportunidad de buscar alternativas no contaminantes y saludables para el control y/o manejo de N. ceranae y DWV, no solo para el mercado nacional, sino que también, podría eventualmente, abarcar el mercado internacional apícola.

Actualmente se sabe que en la naturaleza existe una fuente considerable de microorganismos con potencial biológico y biotecnológico para ser aplicado en las áreas de las ciencias agrícolas. En ese sentido existen nichos específicos en donde ciertas poblaciones de microorganismos pueden sobrevivir y reproducirse, favoreciendo en muchos casos al agente hospedante. Es así por ejemplo, que los insectos pueden alojar una amplia gama de microbiota intestinal que participan en interacciones simbióticas complejas y dinámicas que van mucho más allá del apoyo al proceso nutricional, sino que participan también en aspectos fisiológicos, de comportamiento, evolución, adaptación, reproducción e inmunidad (Crotti et al., 2013). En este sentido, la comunidad microbiana intestinal de abejas no es ajena a estas funciones y se sabe que dicha comunidad es esencial para mantener una adecuada nutrición, salud e inmunidad en períodos críticos. Diversos estudios han identificado y revelado que bacterias intestinales de las abejas desempeñan funciones específicas (Vásquez et al., 2012; Crotti et al., 2013). Es así que se han identificado bacterias productoras de ácido láctico y que en ensayos de laboratorios han demostrado que la administración de estas bacterias estimula el sistema inmune de A. mellifera y con ello, permite una prevención o una reducción considerable de infecciones por patógenos (Evan et al., 2004). Sin embargo, dichas comunidades bacterianas pueden variar de acuerdo a especies, cepas, localidad, composición, estado de desarrollo, edad, fuente de alimento, entre otros factores (Martinson et al., 2012; Hroncova et al., 2015). Por lo tanto, es necesario el desarrollo de formulaciones o suplementos que permitan mediante su ingestión, mantener esa comunidad en forma estable y proteger adecuadamente a las abejas frente a patógenos que las afectan. Es así que el desarrollo biotecnológico y la aplicación de probioticos a las abejas mediante su ingesta, se puede presentar como una alternativa viable y no contaminante dentro de la colmena, ya que son microorganismos que están presentes en las abejas en forma natural.

Referencias

Crotti, Έ., et al. 2013. Microbial symbionts of honeybees: a promising tool to improve honeybee health. New Biotechnol. 30: 716-722.

Evans J.D.; López D.L., 2004. Bacterial probiotics induce an immune response in the honey bee (Hymenoptera: Apidae). J. Econ. Entomol. 97: 752-756.

Huang, W-F., et al. 2013. Nosema ceranae escapes fumagillin control in honey bees. PLoS Pathol. 9: el003185. doi:10.1371/journal.ppat.l003185.

Higes, M., et al. 2009. Honeybee colony collapse due to Nosema ceranaem professional apiaries. Environ. Microbiol. Rep. 1: 110-113.

Hroncova, Z., et al. 2015. Variation in honey bee gut microbial diversity affected by ontogenetic stage, age and geographic location. PLoS ONE 10 (3): e0118707.

Maggi M., et al. 2016. Honeybee health in South America. Apidologie 47: 835-854.

Martinson, V.G., et al. 2012. Establishment of characteristic gut bacteria during development of the honeybee worker. Appl. Environ. Microbiol. 78: 2830-2840.

ODEPA, 2018. Apicultura chilena: Aactualización de mercado y estadísticas sectoriales. Octubre de 2018. https://www.odepa.gob.cl/wp-content/uploads/2018/10/articulo -miel_octubre-l.pdf

Schroeder, D.C.; Martín, SJ. 2012. Deformed wing virus: The main suspect in unexplained honeybee deaths worldwide. Virulence 3:7 589-591.

Van den Heever J.P., et al. 2016. The effect of dicyclohexylamine and fumagillin on Nosema ceranae -infected honey bee {Apis mellifera) mortality in cage trial assays. Apidologie 47: 663- 670.

Vargas, M. et al. 2017. Viral and intestinal diseases detected in Apis mellifera in Central and Southern Chile. Chilean J. Agricult. Res. 77, 243-249.

Vásquez, A., et al. 2012. Symbionts as major modulators of insect health: Lactic acid bacteria and honeybees. PLoS ONE 7(3): e33188. doi:10.1371/journal. pone.0033188. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Total de cepas aisladas y seleccionadas de acuerdo a cada región muestreada ó zona agroclimática.

Figura 2: Porcentaje relativo de lactobacterias identificadas a nivel de género.

Figura 3: Gel de agarosa de un Box-PCR que muestra los patrones discriminativos de algunas cepas Bifídobacterium asteroides seleccionadas y representado por un cladograma.

Figura 4: Test de compatibilidad entre cepas de lactobacterias en placas petri.

Figura 5: Probabilidad de sobrevivencia de abejas expuestas a un consorcio de lactobacterias e infectadas con Nosema ceranae, DWV y co-infectadas con ambos patógenos en condiciones controladas.

Figura 6: Carga relativa de Nosema ceranae en abejas tratadas con un consorcio de lactobacterias, como también, co-infectadas con DWV y evaluados a los 5, 10 y 15 días post-infección en condiciones controladas. En A) se muestra la carga relativa acumulada promedio y en B) se muestra la carga relativa de N. ceranaeen cada período de muestreo post-infección en abejas tratadas y no tratadas con el consorcio. Barra sobre cada gráfico indica error estándar.

Figura 7: Carga relativa del virus de las alas deformadas (DWV) en abejas tratadas con un consorcio de lactobacterias, como también, co-infectadas con DWV y evaluados a los 5, 10 y 15 días post-infección en condiciones controladas. En A) se muestra la carga relativa acumulada promedio y en B) se muestra la carga relativa de DWV en cada período de muestreo post-infección en abejas tratadas y no tratadas con el consorcio. Asterisco indica diferencias estadísticas significativas con el respecto al control infectado (DWV) según de test de Dunnett (p < 0.05). Barra sobre cada gráfico indica error estándar.

Figura 8: Expresión relativa de (A) abaecina y (B) defensina a los 5, 10 y 15 días post infección en abejas tratadas con el consorcio seleccionado, como también, infectadas con Nosema ceranae, DWV y co-infectadas con ambos patógenos. Se realizó una separación de medias a posteriori utilizando el test de Tukey HSD (p < 0.05) después de un análisis de varianza de medidas repetidas. Barra sobre cada gráfico indica error estándar y el no cruce de éstas indica diferencias significativas entre tratamientos en cada período de medición. Figura 9. Carga de Nosema ceranae (A) y DWV (B) en abejas colectadas antes del ensayo, a los 45 y 135 días post-aplicación (final del ensayo) de colonias infectadas y que fueron tratadas y no tratadas con un consorcio de lactobacterias. Asterisco sobre las barras indica diferencias estadísticas significativas entre tratamientos dentro de cada período de muestreo según el test student (p < 0.05). Barra sobre cada gráfico indica error estándar.

Figura 10. Expresión relativa de abaecina (A) y defensina (B) en abejas colectadas antes del ensayo, a los 45 y 135 días post-aplicación (final del ensayo) de colonias infectadas con Nosema ceranae DWV, las cuales fueron tratadas y no tratadas con un consorcio de lactobacteria. Asterisco sobre las barras indica diferencias estadísticas significativas entre tratamientos dentro de cada período de muestreo, según el test student (p < 0.05). Barra sobre cada gráfico indica error estándar.

Figura 11. Estimación de marcos con crías (A) y abejas adultas (B) antes del ensayo, a los 45 y 135 días post-aplicación (final del ensayo) en colonias infectadas con Nosema ceranae y DWV, las cuales fueron tratadas y no tratadas con un consorcio de lactobacterias. Asterisco sobre las barras indica diferencias estadísticas significativas entre tratamientos dentro de cada período de muestreo según el test student (p < 0.05). Barra sobre cada gráfico indica error estándar.

Fig. 12. Distribución temporal de abejas muertas en la piquera de colonias infectadas con Nosema ceranae y DWV que fueron tratadas y no tratadas con el consorcio seleccionado y comparadas con un grupo control (colonias sanas) durante el desarrollo del ensayo otoño-invierno. Las barras en cada línea de distribución corresponde el error estándar.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La tecnología corresponde a una formulación bioestimulante probiótica para abejas {Apis meHifera L), que comprende cepas de LactobaciHus kunkeei y Bifidobacterium asteroides, que estimulan el sistema inmune, además, de reducir las cargas de dos patógenos importantes de las abejas, como son el caso de Nosema ceranae Fries (Microsporidia) y el virus de las alas deformadas (DWV). Estas cepas se encuentran depositadas en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM) desde el 26 de noviembre de 2019, bajo los números de depósito descritos en la tabla 1.

Tabla 1: Números de depósito en la CChRGM.

Estas cepas se utilizan para la elaboración de una formulación probiótica, compuesta por una cantidad suficiente de cepas que permitan observar su rol protector, de forma preferente esta formulación comprende aproximadamente 100000 - 300000 UFC/cepa abeja, en una base de jarabe de azúcar 40 - 80% (p/v). Esta formulación permite proteger de forma directa e indirecta contra los patógenos previamente mencionados, activando los genes asociados a la producción de péptidos antimicrobianos de las abejas, tales como abaecina y defensina, lo cual genera, por un lado, una resistencia a la infección y por otro lado, reduce la carga de patógenos como N. ceranae y DWV. Los ensayos de laboratorio han demostrado que la actividad estimuladora, basado en genes abaecina y defensina, puede alcanzar de un 67% hasta 300% en abejas infectadas con DWV y N. ceranae, respectivamente, comparadas con aquellas no tratadas con la formulación bioestimulante en base a cepas de L. kunkeeiy B. asteroides, lo cual han tenido como consecuencia un aumento de sobrevivencia hasta un 77% de las abejas infectadas con estos patógenos y comparadas con aquellas no tratadas, que presentaron una sobrevivencia por debajo del 55%. En forma similar, ensayos de campo demuestran que este consorcio reduce significativamente la carga de N. ceranaey DWV 36 y 31%, respectivamente. Además, induce un incremento significativo de la expresión relativa de péptidos antimicrobiales como abaecina (30%) y defensina (21%) al final del ensayo, lo confirma la capacidad bioestimuladora del sistema inmune de las colonias de abejas tratadas con el consorcio en estudio. También este consorcio reduce la mortalidad (63%) de abejas en la colonia infectadas con ambos patógenos e incrementa en forma significativa (hasta 160%) la poblacional de abejas dentro de la colonia, especialmente al final del ensayo y comparadas con aquellas no tratadas. Basado en estos resultados se puede concluir en forma general, que el consorcio seleccionado tiene efectos positivos en reducir la carga parasitaria, aumentar la respuesta inmune y mejorar la fortaleza de la colonia desde punto de vista poblacional.

EJEMPLOS DE APLICACIÓN

Ejemplo 1: Aislamiento, caracterización y selección de las cepas.

Aislamiento de las cepas desde intestino de abejas

Se aislaron cepas de lactobacterias provenientes de colonias de abejas presentes en diferentes zonas agroclimáticas de Chile (Norte, Centro, Sur e Isla de Pascua) mediante protocolos previamente estandarizados. El proceso de aislamiento de cepas de lactobacterias comprendió, primero, extraer intestinos de abejas vivas, órganos que fueron molidos en morteros junto a tampón fosfato salino (PBS IX), seguido de una dilución seriada y sembradas en medios de cultivos sem i -selectivos que permita aislar bacterias productoras de ácido lácticos y enfocadas principalmente a Lactobacillus spp. y Bifídobacterium ; dos géneros conocidos por contener especies de bacterias con capacidad probiótica. De cada dilución se aislaron colonias individuales, las cual fueron re-sembradas hasta obtener colonias puras (cepas) bajo condiciones controladas y en cámaras de anaerobiosis. Cada cepa de lactobacteria se encuentra por triplicado, etiquetada y crio-preservada (-80°C) para uso futuro en los ensayos biológicos. En ese sentido, a la fecha se han muestreado en la mayoría de zonas agroclimáticas previamente establecidas con 756 cepas aisladas. La zona norte considero muestreo en las regiones de Valparaíso y Coquimbo, aislándose 128 cepas de lactobacterias; en la zona centro se muestreo la región del BioBio aislándose 167 cepas; en la zona sur se consideró muestrear las regiones de Los Lagos y Los Ríos, desde donde se han logrado aislar 258 cepas de lactobacterias; y en Rapa Nui se aislaron 203 cepas. Sin embargo, tomando en cuenta las pruebas bioquímicas (test de catalasa y tinción Gram) como primer filtro para seleccionar cepas lactobacterianas, un 38% de estas cepas fueron descartadas en primera instancia y por lo tanto, no fueron incluidas en los siguientes pasos de la selección. Así, 461 cepas lactobacterianas fueron seleccionadas finalmente para su identificación, la realización de ensayos biológicos, test de compatibilidad y formación de consorcios bacterianos. En la Figura 1 se muestra el total de cepas aisladas de acuerdo a cada región de muestreo.

Identificación de las cepas a nivel de género

Se procedió a la identificación de los aislamientos de lactobacterias mediante técnicas convencionales y/o moleculares. En primera instancia, tanto los medios de cultivos semi- selectivo MRS+CaCCb y MRS+L-cisteína y bajo en condiciones anaeróbicas, seguido de pruebas bioquímicas como a la reacción de tinción de GRAM y catalasa, permitió separar cepas de bacterias anaeróbicas facultativas y posibles productoras de ácido láctico. Para determinar que dichas cepas de lactobacterias pertenecían dentro de los géneros objetivos LactobaciHus y Bifídobacterium, se realizaron extracciones de ADN bacterial, amplificación de PCR con partidores específicos y secuenciación de producto de PCR (Macrogen, Corea del Sur). Basado en el gen 16S rRNA, fue posible generar nuevos partidores específicos para amplificar Bifídobacterium spp. Estos partidores fueron capaces de discriminar exitosamente Bifídobacterium spp. de otras bacterias aisladas, tales como LactobaciHus s . Antecedentes que fueron confirmados una vez que algunas de estas cepas fueron secuenciadas y sometidas a un análisis de BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para cotejar con secuencias disponibles similares en la base datos del GenBank (NCBI, USA). Los antecedentes sugieren que el medio de cultivo sem i -selectivo (MRS+L-cisteína) permitió el crecimiento de Bifídobacterium, pero también, otras bacterias que no eran parte del objetivo principal del aislamiento. Tomando en cuenta que en los intestinos de abejas pueden encontrarse un centenar de géneros bacteriales conviviendo, un valor sobre el 10% es considerado aceptable, en un medio que no sea estrictamente selectivo. Por otro lado, el medio semi- selectivo para pesquisar LactobaciHus, fue un poco más preciso y selectivo separar posibles LactobaciHus de otras bacterias presentes en los intestinos de las abejas. Así, del total cepas finalmente seleccionadas (n = 489), la mayoría de ellas correspondieron a los géneros LactobaciHus (n = 320) y a Bifídobacterium (n = 148), lo cual sumado representan alrededor del 97%. El restante 3% corresponden a lactobacterias pertenecientes a los géneros Enterococcus, Fructobaciiius, Lactococcus, Leunostoc y Weisellia ; en la Figura 2 se muestra un gráfico de la distribución cepas por género. Todas estas bacterias son reconocidas como productoras de ácido láctico y otros compuestos secundarios con capacidades antimicrobiales y probióticas. Cepas de lactobacterias identificadas a nivel de especie

Para una identificación por especies de las bacterias seleccionadas se utilizó un análisis molecular de secuencias de ADN (gen 16S rDNA), tomando en cuenta la información disponible en el GenBank. En la tabla 2 se presentan los partidores específicos desarrollados. Tabla 2: Lista de partidores desarrollados para identificar lactobacterias aisladas desde intestinos de abejas.

Los partidores fueron desarrollados usando como referencia el gen 16S rRNA de acuerdo a las secuencias disponibles de lactobacterias ( Lactobacillus y Bifídobacterium ) en el GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Los partidores fueron diseñados usando el programa AmplifX 1.5.4 (http://crn2m.univ-mrs.fr/pub/amplifx-dist) tomando en cuenta el tamaño del fragmento esperado, la estabilidad de los partidores, temperatura de alineamiento y la no presencia de dímeros durante la reacción de PCR. Para confirmar la calidad de partidores sintetizados, éstos fueron evaluados in vitro pava confirmar y/o descartar cada uno de ellos en la detección e identificación de lactobacterias. Así, del total de lactobacterias identificadas a nivel género (n = 489), la mayoría de estas fueron identificadas dentro de las especies Lactobacillus kunkeei (n = 250) y Bifídobacterium asteroides (n = 148). De hecho, todas las cepas identificadas dentro del género de Bifídobacterium correspondieron a B. asteroides. Por otra parte, de las cepas identificadas dentro del género de Lactobacillus (n= 320), un 52% de ellas correspondió a L. kunkeei y un 3% fueron identificadas dentro de la especies L. piantarum, L. heisingbongensis, L. insectis y L murinus. Las especies restantes (10%) de Lactobacillus no fue posible identificarlas a nivel de especies. Igualmente, se identificaron otras especies de lactobacterias, entre ellas están Weisseiia bombi, W. heiienica, Lactococcus iactis, Leuconostoc mesenteroides y L. citrium, las cuales suman en su conjunto no más del 3%.

Para seleccionar cepas dentro de una especie, por ejemplo de L. kunkeei B. asteroides y así, poder trabajar con número adecuado de cepas y evitar incluir en ensayos biológicos (incluyendo consorcios bacterianos) cepas genéticamente idénticas dentro de una especie, se realizaron Box PCR, la cual consiste una estandarización de la concentración bacteriana a una densidad óptima de 1 (espectrofometría) para que el proceso de patrones de bandas en el gel de agarosa sea también estandarizado y comparativo entre cepas. Cada cepa es preparada dentro de una reacción de PCR con el partidor BoxlAR para determinar las similitudes y/o diferencias entre cada cepa en evaluación, lo cual es visualizado en un gel de agarosa (2%) bajo un tranilumindor con luz ultravioleta (Figura 3A). Posteriormente se genera una matriz binaria con las bandas observadas con fin de generar un cladograma que permita en forma más precisa estimar el grado de relación que pueda existir entre cada cepa (Figura 3B). Según el ejemplo mostrado en la Figura 3B, se puede observar que cepas 4.1L y 2.3L se encuentran distantes dentro del ciado, por lo tanto, pueden ser seleccionadas ya que probablemente, genéticamente son distintas y por lo tanto, también puede tener un comportamiento biológico diferente a las otras cepas que están más cercanas en el centro del ciado (ejemplo cepas 3.8 R y 24.5 R). Conformación de los consorcios bacterianos

Datos actualizados muestran un universo de 489 cepas, que se agruparon en 22 consorcios bacterianos según aspectos genéticos (cepa y/o especie) y agroclimáticos. A estos consorcios se les realizaron test de compatibilidad entre cepas con el objetivo de descartar/confirmar competencias entre ellas.

Estos consorcios fueron conformados por 6 cepas de lactobacterias, las cuales fueron testeadas todas contra todas con respecto a la compatibilidad entre ellas (Figura 4). Para ello, se realizaron siembras de cada cepa bacteriana con método de siembra por estría en placas Petri con agar nutritivo previamente esterilizado y cada césped bacterial se agregó una gota 10pL de las bacterias restantes, a las 48 horas (25°C) se observaron la ausencia (A) de halo de inhibición lo cual sugiere que dichas bacterias son compatibles ó la presencia de halo inhibición (B) lo demuestran que dichas cepas son incompatibles y por lo tanto, no pueden pertenecer al mismo consorcio. En la Figura 4 se presenta un ejemplo de esta prueba. Después del test de compatibilidad, 17 consorcios fueron finalmente seleccionados para realizar ensayos biológicos en condiciones controladas, estos consorcios están descritos en la tabla 3.

Tabla 3: Lista de consorcios finales compatibles de acuerdo a las cepas evaluadas dentro de cada especie de lactobacteria.

Zona Agroclimática

Consorcio Especie Cepa (Región)

Bifidobacterium asteroides LR4.4; LR24.1

Los RÍOS LR18.2; LR17.7; LR14.1; Lactobacillus kunkeei _ LR15.4 _

Bifidobacterium asteroides LR6.5; LR24.3

Los Ríos Lactobacillus kunkeei LR10.2; LR8.3; LR2.8; LR5.4 Bifidobacterium asteroides LR3.5 Weisella bombi LR13.5

Los Ríos

LR10.4; LR10.5; LR10.12;

Lactobacillus kunkeei LR3.4

Los Lagos Bifidobacterium asteroides LL2.3 ^ Weisella bombi LR13.26

Los Ríos LR8.7; LR13.1; LR13.18;

Lactobacillus kunkeei _ LR14.3 _

Bifidobacterium asteroides LL2.7; LL4.5

Los Lagos 5 Weisella sp. SN

Los Ríos Lactobacillus kunkeei LR14.3; LR15.1; LR17.4 Los Lagos 6 Bifidobacterium asteroides LL6.1; LL7.1 Lactobacillus kunkeei LL13.9

Los Ríos Lactobacillus kunkeei LR17.12; LR13.34; LR20.4 Bifidobacterium asteroides LL5.5; LL5.7

Los Lagos Lactobacillus kunkeei LL14.4; LL15.1; LL20.4 Los Ríos Lactobacillus kunkeei LR13.27

Los Lagos 10 Bifidobacterium asteroides LL6.5

Rapa Nui Bifidobacterium asteroides 17.3 Los Ríos Lactococcus lactis LR15.5 Los Lagos Lactobacillus kunkeei LL20.3; LL14.12; LL20.10 Bifidobacterium asteroides BB18a; BB21b

BioBío 11 BBla; BB18.2; BB17a;

Lactobacillus kunkeei BB17e

Bifidobacterium asteroides 62.3

Valparaíso/Coquimbo 12 Lactobacillus kunkeei 68.2; 54.2; 68.2; 68.3; 73.6; Bifidobacterium asteroides 4.4; 4.3 Fructobacillus fructosus RN1.8

Rapa Nui 13 Leucnostoc mesenteroides RN9.1 Lactobacillus kunkeei 1.3; 3.2 Bifidobacterium asteroides 13.4 Leucnostoc citrium RN3.3

Rapa Nui 14 Lactobacillus plantarum RN4.1 Leucnostoc citrium RN3.3 Lactobacillus kunkeei _ 9.4; 11.2 _ Bifidobacterium asteroides 7.4; 15.4

Rapa Nui 17 Lactobacillus kunkeei 11.5; 14.5; 16.1; 18.1

Valparaíso/Coquimbo Lactobacillus kunkeei 93.3

Valparaíso/Coquimbo Bifidobacterium asteroides 69.2

BioBío 19 Lactobacillus kunkeei 1K

Los Ríos Lactobacillus kunkeei 5.7R; 10.3R Los Lagos Lactobacillus kunkeei L5L Los Lagos Bifidobacterium asteroides LL17.4

Los RÍOS 18 Lactobacillus kunkeei 2. IR; 13.8

Valparaíso/Coquimbo Lactobacillus kunkeei 69.2; 90.4; 99.3 Bifidobacterium asteroides 6.2; 11.6

Rapa Nui 20 L adobad II us h elsingborgensis 2.1RN Lactobacillus kunkeei 15.5; 19.3; 19.4 Bifidobacterium asteroides 15.5; 18.4

Rapa Nui 21 Lactobacillus kunkeei 20.1; 20.2; 21.4 L adobad II us h elsingborgensis 4.10RN Bifidobacterium asteroides 13.4 Bifidobacterium asteroides 6.4

Rapa Nui 22 Lactobacillus kunkeei 5.2RN; 15.4;21.3 L adobad II us h elsingborgensis 10.2RN Ejemplo 2: Aumento de sobreviviencia de abejas infectadas y tratadas con lactobacterias seleccionadas en condiciones controladas

Se determinó el efecto del consorcio lactobacterias seleccionado sobre el desarrollo/replicación de N. ceranaey DWV, como también, sobre el potencial biológico (sobrevivencia) de A. mellifera e condiciones controladas de laboratorio.

Para los ensayos de sobrevivencia, las abejas fueron inoculadas oralmente y de forma preventiva (48 h antes) con el consorcio (100.000 UFC/abeja). Posteriormente, las abejas fueron infectadas (vía oral) con esporas de N. ceranae (60.000 esporas/abeja) y DWV (1 x 10 ⁷ - 1 x 10 ⁸ copias por abejas) ó co-infectado con ambos patógenos. La sobrevivencia fue medida periódicamente retirando las abejas muertas de las jaulas durante 20 días. El ensayo fue desarrollado considerando los siguientes tratamientos: (1) Control (abejas sanas), (2) Consorcio (abejas sanas tratadas con el Consorcio), (3) Consorcio + N. ceranae + DWV (abejas inoculadas con los patógenos y tratadas con un consorcio), (4) N. ceranae + DWV (abejas co-infectadas N. ceranae + DWV y no tratadas con el consorcio), (5) Consorcio + N. ceranae (abejas infectadas con N. ceranae y tratadas con el consorcio), (6) Consorcio + DWV (abejas infectadas con DWV y tratadas con el consorcio), (7) N. ceranae (abejas infectadas con N. ceranaey no tratadas con el consorcio) y (8) (abejas infectadas con DWV y no tratadas con el consorcio). Los resultados del consorcio seleccionado (Figura 5) demuestra que sobrevivencia de las abejas tratadas fue mayor (85%) si se compara con aquellas que no fueron inoculadas con estas lactobacterias (tratamiento control, 75%) (Figura 5). Estos antecedentes podrían estar asociados a que abejas nuevas, recién emergidas, en general presentan una baja carga y diversidad de microbiota bacterial, la cuales se incrementan en el transcurso de un tiempo cuando estas abejas toman contacto directo con el resto de los individuos de la colonia y medio ambiente que las rodea (Rayman y Moran, 2018. Current Opinión in Insect Science 26:97-104). Por lo tanto, no es de extrañar que el solo hecho de agregar un consorcio de bacterias pueda tener impacto positivo en variables como la sobrevivencia. Por ello, estos consorcios igualmente podrían ser útil, por ejemplo, cuando se realizan tratamientos con antibióticos para controlar problemas como Loque americano e inclusive el control N. ceranae con Fumagilina, lo cual a posteriori, podrían recuperar o restablecer la flora microbiana intestinal de las abejas tratadas con estos antibióticos. De forma similar, la respuesta en las abejas infectadas con patógenos y previamente tratadas con el consorcio, alcanzó entre 74 a 77% de sobrevivencia, sobrepasando la meta del indicador (50%) al final del ensayo. Por ejemplo, las abejas infectadas sólo con N. ceranae y/o co-infectadas con DWV, las cuales fueron tratadas con este consorcio cada 5 días después de la infección, un 24 - 35% de estas abejas vivieron más días, comparado con aquellas que no fueron tratadas (Figura 5). En forma práctica, una colonia con una población de 10 mil abejas, cerca de un tercio de ellas (3 mil abejas) podría vivir más días y con ello, reducir el despoblamiento de dicha colonia. Para confirmar esta hipótesis, será necesario realizar ensayos de campo.

Reducción de la infección por N. ceranaeen abejas tratadas con lactobacterias

Similar a los ensayos de sobrevivencia, abejas recién emergidas fueron tratadas primero con el consorcio, suministrando 100.000 UFC/abeja 48 h antes del ensayo. El consorcio fue suministrados ad Ubitum de nuevo a los 5, 10 y 15 días después que estas abejas fueran infectadas con esporas de N. ceranae (60.000 esporas/abejas) y DWV (1 x 10 ⁷ - 1 x 10 ⁸ copias por abejas) o co-infectadas con ambos patógenos, considerando los siguientes tratamientos: (1) abejas infectadas sólo con N. ceranae (Nc), (3) abejas co infectadas con N. ceranae + DWV, (4) infectadas con N. ceranae y tratadas con el consorcio y (5) abejas co-infectadas con N. ceranae + DWV y tratadas con el consorcio. Para determinar la carga de N. ceranaeen el tiempo, se colectaron muestras de abejas tratadas e infectadas a los 5, 10 y 15 días post-infección. A estas abejas se les realizaron extracción de DNA y PCR cuantitativa (qPCR) con partidores específicos para la determinar la carga de N. ceranae. Para determinar diferencias estadísticas entre tratamientos, fue necesario realizar un análisis de varianza de medidas en tiempo (ANOVA de medidas repetidas) seguido de una separación de medias a posteriori. En cuyo caso, los tratamientos con el consorcio e infectados con N. ceranae (Nc), DWV y co-infectados con ambos patógenos (Nc + DWV) fueron todos comparados con el tratamiento control infectado (abejas infectadas con N. ceranae ) utilizando el test de Dunnett (p < 0,05). Basado en este análisis, no fue posible determinar diferencia significativas entre tratamientos, a pesar que abejas infectadas y tratadas con el consorcio presentan en general, una reducción cerca del 22% de la carga de N. ceranae, especialmente cuando se encuentra co-infectado con DWV (Consorcio + Nc + DWV) y cuando se realiza la comparación con aquellas abejas co-infectadas y no tratadas (Nc + DWV) (Figura 6A). Dicha tendencia es similar cuando se evalúa a los 5, 10 y 15 post- infección (Figura 6B), en donde los tratamientos que incluye estos consorcios en abejas co-infectadas con N. ceranaey DWV (Consorcio + Nc + DWV), tienden a reducir la carga de N. ceranae, pero la alta variabilidad de los datos en los tratamientos que incluyen abejas infectadas y no tratadas, no permite determinar diferencias estadísticas entre estos tratamientos. No obstante aquello, estos antecedentes no invalidan analizar la carga de DWV en abejas infectadas y tratadas con este consorcio.

Reducción de la infección por DWV en abejas tratadas con lactobacterias

Para determinar la carga del virus de las alas deformadas (DWV) en abejas tratadas con el consorcio lactobacterial, los ensayos de infección fueron similar a N. ceranae. Así, las abejas fueron tratadas primero con las bacterias del consorcio, suministrando 100.000 UFC/abeja 48 h antes del ensayo. Estas lactobacterias fueron suministrados de nuevo a los 5, 10 y 15 días después que las abejas sanas fueran infectadas con esporas de N. ceranae (60.000 esporas/abejas) y DWV o co-infectadas con ambos patógenos. Para determinar la carga del DWV en el tiempo, se colectaron muestras de abejas tratadas e infectadas a los 5, 10 y 15 días post-infección. Posteriormente, a estas abejas se les realizaron extracción de RNA, síntesis de cDNA y PCR cuantitativa (qPCR) con partidores específicos para DWV. Para determinar la diferencia estadística entre tratamientos, se realizó un análisis de varianza de medidas en tiempo (ANOVA de medidas repetidas) seguido de una separación de medias a posteriori. En este caso, los tratamientos con consorcios bacteriales e infectados con DWV, N. ceranae e) y co-infectados con ambos patógenos (DWV + Nc) fueron todos comparados con el tratamiento control (abejas sólo infectadas con DWV) utilizando el test de Dunnett (p < 0,05). Basado en estos análisis, abejas infectadas y tratadas con el consorcio lactobacterial, presentaron significativamente una menor carga viral y al ser comparada con aquellas no tratadas con este consorcio. De hecho, tanto abejas infectadas sólo con DWV y co-infectadas con N. ceranae, ambas grupos tratados con el consorcio presentaron una reducción viral cercanas entre 58 y 84%, respectivamente (Figura 7A). Aún más, dichas diferencias se presentaron en forma marcada a los 5, 10 y 15 post-infección viral, indicando que este consorcio tiene un efecto en la reducción de DWV en las abejas infectadas, actividad que se prolongó durante todo el período del ensayo (Figura 7B). Esto podría explicar por una parte, una mayor sobrevivencia de las abejas infectadas con este virus y tratadas con este consorcio, en cuyo caso, las abejas infectadas con DWV o co-ínfectadas con N. ceranae presentaron una mayor sobrevivencia que aquellas no tratadas con el Consorcio.

Aumento en la expresión relativa de péptidos antimicrobiales en abejas infectadas con N. ceranae y tratadas con lactobacterias

Actualmente se sabe que ciertas bacterias intestinales de las abejas tienen el potencial de estimular el sistema inmune de éstas frente a la presencia de agentes patogénicos. Por lo tanto, un aspecto importante fue evaluar el posible efecto que puedan tener los consorcios lactobacterianos como estimuladores del sistema inmune utilizando como indicadores los genes GB18323 y GB10036, los cuales codifican para péptidos antimicrobianos como lo son abaecina y defensina, los cuales han sido utilizados como indicadores frente a las infecciones provocadas N. ceranaey DWV.

Para determinar los cambios de expresión de abaecina y defensina en abejas tratadas con el consorcio seleccioando, se utilizaron las muestras de los ensayos de infecciones con N. ceranaey DWV, considerando los siguientes tratamientos: : (1) Control (abejas sanas), (2) Consorcio (abejas sanas tratadas con un Consorcio), (3) Consorcio + N. ceranae + DWV (abejas sanas inoculadas con los patógenos y tratadas con un consorcio), (4) N. ceranae + DWV (abejas co-infectadas con N. ceranae DWV), (5) Consorcio + N. ceranae (abejas infectadas con N. ceranaey tratadas con un consorcio), (6) Consorcio + DWV (abejas infectadas con DWV y tratadas con un consorcio), (7) N. ceranae (abejas infectadas sólo N. ceranae ) y (8) (abejas infectadas sólo DWV). Se realizaron extracción de RNA, síntesis de cDNA y PCR cuantitativa (qPCR) a muestras de abejas sanas, tratadas e infectadas a los 5, 10 y 15 días post-infección. Además, para determinar la diferencia estadística entre tratamientos, se realizó un análisis de varianza de medidas en tiempo (ANOVA de medidas repetidas) seguido de una separación de medias a posteriori útil izando el test de Tukey HSD (p < 0,05). Basado en estos análisis, no presentó una expresión de abaecina con cambios estadísticamente significativos dentro del modelo general de evaluación, a pesar que este péptido presenta un incremento considerable (>60%) los primeros 5 días de evaluación, especialmente en abejas tratadas con este consorcio e infectadas con DWV y comparadas con aquellas no tratadas (Figura 8A). Contrariamente, la expresión de defensina se incrementó en forma significativa en abejas tratadas e infectadas con N. ceranae, en cuyo caso, hubo un incremento cercano al 300% al comparar este parámetro con abejas no tratadas e infectadas a los 5 días post-infección (Figura 8B). Este incremento continuó a los 10 días post-infección, el cual fue casi el doble en abejas tratadas e infectadas con N. ceranae. Los cambios de expresión en abejas tratadas e infectadas con DWV, no fueron claramente significativos, aunque se pueden observar alguna tendencia positiva, especialmente los primeros 5 días posterior al inicio de la infección viral.

Ejemplo 3: Evaluación de consorcio seleccionado en condiciones campo

El consorcio compuesto por cepas de L kunkeei {LL1 A,- LL15.1; LL20.4; LR13.27) y B. asteroides (LL5.5; LL5.7) fue evaluado también en colmenas infectadas con N. ceranae y DWV. Este ensayo se realizó en otoño-invierno (2019) en colmenas de abejas en régimen productivo cerca de la comuna de Lago Raneo, Región de los Ríos. Antes de iniciar el ensayo en dichas colmenas, se realizó un muestreo para determinar el estado sanitario, pero también, para poder seleccionar las colonias que posteriormente serían utilizadas para el ensayo. Se realizó una extracción de ADN y ARN de muestras de abejas, para detectar y cuantificar la carga de N. ceranae y DWV, a través de PCR-tiempo real, respectivamente. Con la información del estado sanitario a la mano, fue posible entonces, seleccionar colonias homogéneas en función en la cantidad de cría y población de abejas (fortaleza). Una vez seleccionadas las colonias infectadas (con N. ceranae y DWV, n = colonias), la mitad de ellas fueron tratadas con el consorcio de lactobacterias y otra la mitad se dejaron sin tratar (control infectado). A cada colonia en tratamiento se les colocó un alimentador plástico interno el cual sirvió como contenedor para mantener los consorcios (~200000 UFC/abeja) de lactobacterias mesclados con jarabe de azúcar 60% (p/v). Dicho consorcio fue suministrado tres veces con un intervalo de tiempo de dos semanas. A las colonias infectadas (y no tratadas) sólo se les suministró jarabe 60% en los períodos antes mencionados. También, se realizaron otros dos muéstreos de abejas (a la mitad (junio, 45 días post-aplicación) y al final del ensayo (agosto, 135 días post-aplicación) para determinar la carga de N. ceranae, DWV y cuantificar la expresión de genes asociados al sistema inmune (Abaecina y defensina). Para cuantificar la carga patógenos y expresión de genes antes, durante y final del ensayo, se realizaron extracciones de ADN, RNA y síntesis de cDNA (según el caso) de muestras de abejas de colonias infectadas que fueron tratadas y no tratadas con el consorcio. Basado en este ensayo se pudo observar que el consorcio antes mecnionado, redujo significativamente, un 36% la carga (número esporas por abeja) de Nosema ceranae después de los 45 días de las primeras aplicaciones (Figura 9A). De igual forma, la carga (número de copias de DWV por abeja) de DWV se redujo cerca del 31% durante (45 días post-aplicación) y al final de ensayo (135 días post-aplicación) (Figura 9B). Además, el consorcio lactobacteriano, indujo un incremento significativo de la expresión relativa de péptidos antimicrobiales como abaecina (30%) y defensina (21%) al final del ensayo (Figura lOAy 10B), lo confirma la capacidad bioestimuladora del sistema inmune de las colonias de abejas tratadas con el consorcio en estudio. Estos resultados también están directamente relacionados con la mortalidad de abejas medido con trampas de caídas en "piquera" de cada colonia tratada y no tratada con el consorcio. Para medir este parámetro, inmediatamente después de la suministración (aplicación) del consorcio de lactobacterias, a cada colonia en tratamiento, se le colocó en la piquera una jaula de caídas para "capturar" abejas muertas que las mismas abejas vivas de la colonia eliminan, lo cual indirectamente permite estimar el grado de higiene y/o mortalidad de abejas durante el desarrollo del ensayo. Como resultado de este experimento, fue posible determinar que la mortalidad abejas observada en la piquera y estimada mediante trampas de caídas, fue variable en el tiempo, produciéndose un incremento notorio en los primeros 15 días post-tratamiento, tanto en colonias infectadas no tratadas y tratadas con el consorcio (Fig. 11). Después de ese período, la distribución de abejas de muertas capturada en la piquera tiende a estabilizarse, pero con diferencias clara entre tratamientos. Aquellas colonias infectadas con los patógenos N. ceranae DWV, y que además, no fueron tratadas con el consorcio lactobacteriano, presenta una mayor mortalidad que aquellas que sí fueron tratadas, es más, las colonias tratadas presentan cerca de 63% menos caídas (abejas muertas) en la piquera al final de ensayo (Fig. 11).

También se evaluó el efecto del consorcio lactobacteriano en el cambio poblacional dentro de la colonia en función con marcos crías (abierta + operculada) y abejas adultas de las colonias tratadas con el consorcio al inicio (antes de la aplicación del consorcio), durante (45 días post-aplicación) y al final del ensayo de campo (135 días post-aplicación). Para ello, estimó visualmente la cantidad de marcos cubierto con crías y también cubierto con abejas en colonias bajo tratamiento. Como resultado de este análisis, al inicio del ensayo, no se observaron cambios significativos en la cantidad poblacional, lo cual era esperable considerando que uno de los requisitos iniciales del ensayo era contar con colonias homogéneas en crías y en población de abejas adultas con el fin reducir el error experimental por efecto del tamaño de las colonias. A partir del segundo muestreo (junio, 45 días post-aplicación), en general todas las colonias (tratadas y no tratadas con el consorcio) redujeron población de cría, lo cual era esperable debido a las condiciones ambientales, considerando que las abejas entran en un estado de invernación en donde la actividad reproductiva se reduce drásticamente en forma normal (Fig. 12A). Al final del ensayo (agosto, 135 días post-aplicación), se observaron los cambios más significativos en este parámetro, de hecho, colonias tratadas con el consorcio, presentaron un aumento significativo en el número de marcos de crías, siendo un 109%, respectivamente, comparado con colonias no tratadas (Fig. 12A). En forma similar, el aumento de población de abejas adultas en colonias tratadas también fue favorecida significativamente desde junio hasta final ensayo (agosto), logrando un incremento poblacional desde 40 hasta 160%, comparado con aquellas que no fueron tratadas con el consorcio (Fig. 12B). Basado en estos resultados se puede concluir en forma general, que el consorcio seleccionado tiene efectos positivos en reducir la carga parasitaria, aumentar la respuesta inmune y mejorar la fortaleza de la colonia desde punto de vista poblacional.