Comme on le sait également, des micro-orga¬ nismes symbiotiques peuvent favoriser la croissance et le développement des plantes par fixation biologique de 1 'azote. Les Rhizobiacées sont des bactéries du sol

Gram-négatives qui fixent généralement l'azote en asso¬ ciation symbiotique avec des végétaux : l'établissement d'une telle symbiose avec des bactéries fixatrices d'azote permet à de nombreuses espèces végétales de croître sur des sols pauvres en azote assimilable. Grâce à la photosynthèse, le partenaire végétal fournit à la bactérie l'énergie nécessaire à la réduction de l'azote moléculaire en ammoniaque. En retour, l'ammoniaque fixé par le microsymbionte est fourni à la plante-hôte qui l'intègre dans son métabolisme azoté. L'association sym¬ biotique qui s'établit entre des bactéries fixatrices d'azote, telles que les Rhizobiacées, et des plantes de la famille des Légumineuses est la plus importante sur le plan écologique et agronomique. Cette association se tra- duit par la formation de nodosités, ou nodules, essen¬ tiellement sur les racines des plantes-hôtes. A l'intérieur de ces nodosités, les bactéries réduisent l'azote atmosphérique en ammoniaque par l'intermédiaire du complexe enzymatique de la nitrogénase.

La symbiose entre les bactéries fixatrices d'azote de la famille des Rhizobiacées (genres R izoJbiui ^*** , Bradyrhizobium, Sinorhizobium, et Azorhizobium) et les plantes de la famille des Légumineuses joue donc un rôle très important en agriculture tempérée et tropicale. Parmi ces plantes on citera notamment des oléoprotéagi- neux comme le soja et l'arachide, des fourrages comme la luzerne et le trèfle, des protéagineux comme le pois et la féverole, des plantes vivrières comme les haricots, pois, lentilles et pois chiches, des engrais verts comme Sesbania etc... Grâce à ces symbioses la culture des Légumineuses est souvent moins coûteuse en engrais azotés que la culture des plantes appartenant à d'autres familles. A cet égard, il convient de rappeler que l'utilisation massive des engrais azotés présente un certain nombre d'inconvénients. Tout d'abord la synthèse, le transport et l'épandage des engrais, est coûteuse en énergie fossile, ce qui a plusieurs conséquences : au niveau de 1'exploitation agricole elle augmente les coûts de production des agriculteurs et au niveau de l'environnement elle contribue à l'effet de serre par accroissement de la teneur en CC>2. Par ailleurs, une fer¬ tilisation azotée non raisonnée ou excessive entraîne une pollution des eaux continentales avec une eutrophisation des eaux de surface et une augmentation de la teneur en nitrates des nappes phréatiques. Ces diverses raisons militent en faveur d'une utilisation accrue de la fixa¬ tion biologique de l'azote.

Etant donné les conséquences très préjudi- ciables de l'utilisation excessive d'engrais azotés, il convient donc d'accroître la contribution de la fixation biologique d'azote par les plantes et notamment par les espèces cultivées qui interviennent pour une part impor¬ tante dans l'alimentation humaine et animale. La solution la plus acceptable, tant du point de vue écologique que

du point de vue économique, est l'amélioration de la symbiose Rhizobiacées-Légumineuses.

Il a été proposé de réaliser cette améliora¬ tion par un apport de Rhizobiacées (notamment Rhizobium ou Bradyrhizobium) au moment du semis, soit par enrobage des graines, soit à l'aide de granulés mélangés aux graines, soit a l'aide d'une culture en milieu liquide. Ces apports bactériens ne sont cependant efficaces que dans les cas, relativement rares, où les bactéries symbiotiques appropriées sont naturellement absentes ou peu abondantes dans les sols. Dans les cas contraires, c'est à dire dans les sols contenant déjà ces bactéries, il est pratiquement impossible d'imposer une souche introduite volontairement, en raison de la compétition avec les bactéries indigènes contenues dans les sols, qui, même si elles ne sont pas forcément efficaces pour la fixation de l'azote, n'en constituent pas moins un facteur limitant pour l'introduction de bactéries sélec¬ tionnées. II a également été proposé de favoriser la symbiose Rhizobium-Légumineuses en traitant les plantes par un exopolysaccharide dérivé de bactéries du genre Rhizobium ou par un oligosaccharide contenant un ou plusieurs motifs d'un tel exopolysaccharide (EPS) - cf. la demande internationale PCT publiée sous le N ^* WO 87/06796 déposée au nom de THE AUSTRALIAN NATIONAL UNIVERSITY et mentionnant comme Inventeurs : B.G.ROLFE, S.P. DJORDJEVIC, J.W. REDMOND et M. BATLEY -. Toutefois, cet EPS est un produit codé par des gènes non symbio- tiques. En effet la biosynthèse de ces exopolysaccharides n'est pas sous le contrôle direct des gènes nod qui contrôlent l'infection et la nodulation. Ces exopoly¬ saccharides sont synthétisés par des souches de Rhizobium qui ont été guéries de leur plasmide pSym, plasmide qui porte l'essentiel des gènes symbiotiques et notamment les gènes nod.

Les gènes impliqués dans le processus de for¬ mation des nodules ont été localisés et plusieurs gènes de nodulation (gènes nod) communs et spécifiques ont été identifiés et caractérisés (voir Long, S. R., Cell, 1989,££,203-214) . Alors que les gènes nodA, B, C sont des gènes de nodulation communs aux différentes espèces de Rhizobiacées symbiotiques, il existe des gènes nod spéci¬ fiques qui déterminent le spectre d'hôte et qui varient, de ce fait, chez les différentes espèces, et des gènes régulateurs, de type nσdD, qui contrôlent l'expression de l'ensemble des gènes nod.

Les gènes communs nodA,B,C ont été mis en évidence dans les quatre genres bactériens capables d'établir une symbiose fixatrice d'azote avec les Légumi- neuses : hizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, et

Azorhizobium. Pour le genre Rhizobium la séquence nucléo- tidique de ces gènes a été réalisée chez R .meliloti

(Tôrôk et al., Nucleic Acids Res., 1984,12.,9509-9522 ;

Jacobs et al., J. Bactériol., 1985.162.469-476 ; Egelhoff et al., DNA, 1985,1,241-242), i?.2egι_j_.i_ιosaruπ ^* (Rossen et al., Nucl. Acids Res., 1984,12.,9497-9508) , R. trifolii (Schofield et al., Nucl. Acids Res., 1986,11,2891-2903).

Pour Bradyrhizobium sp. (Scott, Nucl. Acids Res., 1986,11,2905-2919). Pour Azorhizobium caulinodans (Goethals et al., Mol. Gen. Genêt., 1989.219.289-298) .

Une équipe de Chercheurs comprenant plusieurs des Inventeurs de la présente Invention a montré que chez Rhizobium meliloti , les gènes communs nodA,B,C induisent, conjointement avec les gènes spécifiques πodH et nodQ, la production de signaux Nod extra-cellulaires hôte-spéci¬ fiques, présents dans les surnageants de culture de ces bactéries : cf FAUCHER et al., J. BACTERIOL (1988), 172. 5489-5429 et FAUCHER et al. Molec. Plant-Microbe Interact. (1989), 2., 291-300, entre autres. La seconde de ces deux Publications rend compte, en outre, d'un frac-

tionnement du surnageant stérile par ultrafiltration, qui a permis de mettre en évidence la présence de deux facteurs Nod de masse moléculaire apparente inférieure à 5 000 Da. La spécificité d'infection et de nodulation est déterminée, chez R .meliloti , sur deux plans, à savoir : - les gènes nodD activent l'expression d'autres opérons nod en fonction de la présence de signaux spécifiques produits par les plantes (Gyorgypal et al., Molec. Gen. Genêt., 1988.212.85-92) et, - des gènes spécifiques tels que nodH et nodQ, lorsqu'ils sont activés, déterminent la production de signaux extra¬ cellulaires bactériens (facteurs Nod) , qui permettent la reconnaissance et la stimulation d'une légumineuse-hôte comme la luzerne (Faucher et al., J. Bactériol, 1988.172.5489-5499 ; Faucher et al., Molec. Plant-Microbe Interact., 1989,2,291-300). Toutefois, la structure chi¬ mique des signaux bactériens n'était pas connue.

La présente Invention s'est donné pour but de définir la structure chimique de signaux Nod symbio¬ tiques, et de pourvoir à des substances présentant une telle structure chimique, de pourvoir également à des procédés de production de substances aptes à jouer le rôle de tels signaux Nod symbiotiques et de proposer des applications de ces substances pour le traitement d'organismes appartenant tant au règne végétal qu'au règne animal (y compris l'Homme).

La présente Invention a pour objet une substance sensiblement pure présentant la structure d'un facteur Nod ou de l'un de ses analogues, lequel facteur Nod se caractérise par le fait que sa biosynthèse est sous le contrôle d'au moins un gène de nodulation (nodA, B, C) commun aux Rhizobiacées, en particulier aux genres Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium et Azorhizobium, laquelle substance est caractérisée en ce

qu'elle est constituée par un lipo-oligosaccharide non dérivé des exopolysaccharides.

On entend par "facteur Nod", au sens de la présente Invention, une molécule-signal produite sous le contrôle direct de gènes nod, qui est un signal grâce au¬ quel les bactéries symbiotiques sont capables d'infecter les plantes et d'induire la formation de nodosités.

Selon un mode de réalisation avantageux de la¬ dite substance sensiblement pure, le facteur Nod, dont elle présente la structure, est caractérisé en ce qu'il est un signal symbiotique plante-spécifique et est apte à amplifier la capacité de la bactérie à infecter la plante-hôte à laquelle il est associé et/ou à accélérer la formation de nodules sur la plante-hôte à laquelle il est associé et/ou à induire la transcription de gènes symbiotiques de Légumineuses.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite substance sensiblement pure conforme à 1'Invention, le facteur Nod dont elle présente la struc¬ ture, a les propriétés structurelles d'un ligand de lec- tine.

La présente Invention a également pour objet une substance lipo-oligosaccharidique caractérisée en ce qu'elle répond à la formule générale I ci-après :

FORMULE I

dans laquelle :

G est une hexosamine diversement substituée, par exemple, par un groupe acetyl sur l'azote, un groupe sulfate, un groupe acetyl et/ou un groupe éther sur un oxygène,

- R-_ , R2, R3, R5, R5, R7, qui peuvent être identiques ou différents, représentent H, CH3CO-, C _χ HγCO- où x est un nombre entier compris entre 0 et 17, et y est un nombre entier compris entre 1 et 35, ou tout autre groupe acyl, tel que par exemple un carbamyl

- R représente une chaîne aliphatique saturée ou mono-, di-, ou tri-insaturée comportant au moins 12 atomes de carbone, et

- n est un nombre entier compris entre 1 et . Selon un mode de réalisation préféré de la présente Invention, G représente :

. Chez R . meliloti une N-acétyl-D-glucosamine 6-sulfate . Chez R . leguminosarum b . v. viciae une N-acétyl-D- glucosamine. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le lipo-oligosaccharide conforme à l'Invention est caractérisé en ce qu'il répond à la formule (II) ci-après :

dans laquelle R représente H ou CH3CO- et n est égal à 2 ou 3.

Les lipo-oligosaccharides de J?. meliloti répondant à la formule générale (II) dans laquelle R représente H sont désignés ci-après sous le terme général NodRm ; lorsque n = 2, le lipo-oligosaccharide correspondant est dénommé NodRm-1 ; lorsque n = 3, le lipo-oligosaccharide correspondant est dénommé NodRm-3.

Les lipo-oligosaccharides répondant à la formule générale (II) dans laquelle R représente CH3CO- sont désignés ci-après sous le terme général Ac-NodRm ; lorsque n = 2, le lipo-oligosaccharide correspondant est dénommé Ac-NodRm-1 ; lorsque n = 3, le lipo-oligosaccha¬ ride correspondant est dénommé Ac-NodRm-3. La présente Invention a également pour but de pourvoir à des procédés de production des substances sen¬ siblement pures conformes à la présente Invention, les¬ quels procédés incluent les procédés de purification à partir de surnageants de culture de Rhizobiacées, les procédés par voie de synthèse séquentielle ou convergente usuels dans les synthèses osidiques et les procédés de production desdites substances par génie génétique, à partir de gènes nod clones dans des microorganismes appartenant ou non à la famille des Rhizobiacées, éven- tuellement sous le contrôle d'un promoteur approprié et/ou en présence de gènes régulateurs ayant fait l'objet de mutations appropriées.

Selon un mode de réalisation avantageux d'un procédé de production de la substance sensiblement pure conforme à la présente Invention, au cours d'une première étape on produit un plasmide recombinant résultant du clonage dans un plasmide capable de se répliquer dans une bactérie Rhizobiacée ou tout autre bactérie appropriée,

(1) soit d'un fragment qui contient des gènes nod communs et spécifiques, ainsi que des gènes régulateurs d'une bactérie Rhizobiacée donnée, soit (2) des gènes

régulateurs de l'expression des gènes nod. Les bactéries Rhizobiacées ou toutes autres bactéries appropriées sont ensuite modifiées par introduction dudit plasmide recom¬ binant, pour obtenir une souche mutante très surpro- ductrice de facteurs Nod, et on cultive ladite souche mutante dans un milieu de culture approprié ; - au cours d'une deuxième étape, on recueille le surnageant de cul¬ ture que l'on purifie par extraction par un alcool infé¬ rieur approprié, ou par extraction solide-liquide suivie d'une chromatographie HPLC en phase inverse du résidu d'extraction, d'une chromatographie par perméation de gel, d'une chromatographie par échange d'ions et d'une chromatographie HPLC analytique en phase inverse.

Selon un mode de réalisation avantageux de ce procédé, le plasmide surproducteur de facteur Nod est introduit dans une bactérie Rhizobiacée mutante non- productrice d'exopolysaccharides.

Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de production de la substance sensiblement pure conforme à la présente Invention, on part d'une souche sauvage de bactéries Rhizobiacées fortement productrice de facteurs Nod, que l'on cultive dans un milieu de culture approprié, après quoi l'on recueille le surnageant de culture que l'on traite selon les modalités indiquées plus haut.

La présente Invention a également pour objet un agent de traitement de plantes dont le ou un consti¬ tuant actif est une substance sensiblement pure telle que définie plus haut, et en particulier : - un agent de stimulation des mécanismes de défense des plantes contre les pathogènes, - un agent de stimulation des propriétés symbiotiques des Légumineuses, notamment à l'égard de la fixation d'azote. Selon un mode de réalisation avantageux de l'agent de traitement de plantes conforme à la présente

Invention, celui-ci est formulé sous la forme d'une composition d'enrobage de graines ou d'une solution ou suspension aqueuse pour pulvérisation, dans laquelle ladite substance est présente seule ou associée à d'autres constituants actifs.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'agent de traitement de plantes conforme à la pré¬ sente Invention, ladite substance est présente dans les compositions d'enrobage ou les solutions ou suspensions aqueuses, à une concentration comprise entre 10 ^~ ° M et ÎO ^-*** ^ M, lorsque l'agent de traitement de plantes est destiné à être utilisé comme agent de stimulation des mé¬ canismes de défense ou des propriétés symbiotiques.

La présente Invention a en outre pour objet un agent thérapeutique, dont le ou un constituant actif est une substance sensiblement pure telle que définie plus haut.

Selon un mode de réalisation avantageux de cet agent thérapeutique, ladite substance est présente dans l'agent thérapeutique à une concentration comprise entre 10 ^"5 M et 10 ^"8 M.

Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre. L'Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère aux exemples qui vont suivre.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples ainsi que les dessins annexés, sont donnés uni- quement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLES Exemple 1 - Préparation des composés conformes à l'Invention par purification à partir d'un milieu de culture de Rhizobium meliloti . A. Production du composé

La production de facteurs Nod extracellulaires par Rhizobium est sous le contrôle d'une part des gènes com¬ muns nodA, B, C (van Brussel et al., J. Bacteriol, 1986.165.517-522: Zaat et al., J. Bacteriol., 1987.169.3388-3391: Faucher et al., J. Bacteriol., 1988.170.5489-5499) et d'autre part des gènes nod de spécifité d'hôte, par exemple chez J?.iτιeIi2oti, les gènes nodH et nodQ (Faucher et al., J. Bacteriol, 1988.170.5489-5499 ; Faucher et al., Molec. Plant-Microbe Interact., 1989,2 _/ 291-300).

La régulation de la transcription des gènes communs nodA, B, C est sous le contrôle de protéines régulatrices codées par les gènes nodDl , nodD2, nodD3 et syrM (Mulligan et al., PNAS, 1985,£2., 6609-6613 ; Gyorgypal et al., Mol. Gen. Genêt., 1988.212.85-92) . La protéine NodDl n'est active qu'en présence de certains flavonoides inducteurs, présents dans les exsudâts raci- naires de Légumineuses, comme la lutéoline (Mulligan et al., PNAS, 1985,£2.,6609-6613 ; Peters et al., Science, 1986.233.977-980) . La présence des gènes nodD3 et syrM sur un plasmide multicopie provoque une activation constitutive des gènes nodA, B, C même en l'absence de flavonoides inducteurs (Mulligan et al., Genetics, 1989,122,7-18) . Pour déterminer la régulation des autres gènes nod les Inventeurs ont construit des fusions entre les gènes de spécificité d'hôte nodE, nodG et nodH et le gène lacZ d ' E. coli codant pour la β-galactosidase. Ces fusions ont permis de montrer que chez R.meliloti les gènes nod de spécificité d'hôte sont régulés de la même façon que les gènes communs nodA, B, C: (i) leur transcription est

activée par nodDl , nodD3 et syrM, (ii) la lutéoline est nécessaire pour l'activation par nodDl , (iii) 1'activa- tion de la transcription est beaucoup plus forte quand les gènes régulateurs et les gènes de structure sont sur un plasmide du groupe d'incompatibilité Inc-Pl (présents à 5-10 exemplaires par cellule) .

Ces indications ont incité les Inventeurs à choisir un plasmide dérivé du pRK2, le pRK290, dans le¬ quel a été clone un fragment de 30kb de la région nod du megaplasmide pSym de R .meliloti . Ce plasmide recombinant, le pGMI149 contient l'ensemble des gènes nod communs et spécifiques, ainsi que les gènes régulateurs nodDl , , nodD3 et syrM (Debellé et al., J. Bacteriol., 1986,1£&,1075-1086 ; Faucher et al., J. Bacteriol, 1988.170.5489-5499.. ils ont montré que des souches de R.meliloti contenant le plasmide pGMI149 sont surproduc¬ trices de facteurs iVod : en effet, leur production est supérieure d'au moins cent fois par rapport à des souches de R .meliloti sauvages. Pour la production à grande échelle des fac¬ teurs Nod, par exemple pour des cultures en fermenteur, la forte production d'exopolysaccharides peut présenter des inconvénients pour la filtration des cultures et pour la purification des molécules-signal. Les Inventeurs ont donc jugé préférable d'introduire le plasmide surproduc¬ teur pGMI149 dans le mutant EJ355 de R .meliloti qui ne produit pas d'exopolysaccharides. La souche EJ355 (pGMI149) produit en abondance les facteurs Nod mais pas d'exopolysaccharides. En utilisant des fusions de gènes entre les gènes nod de f..jπeiiloti et le gène lacZ d' Escherichia coli (fusions nod: : lac) pour mesurer le niveau d'expression des gènes nod, les Inventeurs ont mis au point un milieu de culture qui permet une bonne exprès- sion des gènes nod et une production élevée de facteurs Nod. Un milieu satisfaisant est un milieu minéral qui

contient du succinate comme source de carbone et du glu¬ tamate comme source d'azote et de carbone. En effet, dans un milieu riche, contenant des lysats de protéines et des extraits de levures, l'activation de la transcription des gènes nod est moins bonne ; en outre la purification des facteurs Nod est plus facile à partir de surnageants de cultures préparés à partir de milieux simples. La com¬ position de ce milieu est, par exemple, la suivante :

- Sels minéraux : KH ₂ P0 ₄ 14,7 mM ; K ₂ HP0 ₄ 11,5 M ; MgS0 ₄ 1 mM ; CaCl ₂ 0,46 mM; FeCl ₃ 37 μM,

- Composés organiques :

L-glutamate de sodium 5,3 mM ; succinate de sodium 7,4 mM ; biotine 2 μM ; lutéoline 10 μM. B.l. Purification du composé

B.l.l. Le composé est extrait du milieu de culture de Rhizobium meliloti (15 1) par du butanol (2 extractions de 3 litres de BuOH) . La phase butanolique est lavée à l'eau (1 litre) puis concentrée sous vide. Le résidu ob- tenu est dissous dans l'eau (500 ml) et extrait 2 fois par l'acétate d'éthyle (2 fois 300 ml). La phase aqueuse est enfin concentrée puis lyophilisée. B.l.2. Chromatographie HPLC en phase inverse Le résidu obtenu par extraction butanolique est chromato- graphie par HPLC en phase inverse sur une colonne μ Bondapak ^Q , 10 μm - Water Associates -, 7,5X250 mm, avec un débit de 2 ml/mn et en utilisant un gradient linéaire à partir d'un mélange A eau-éthanol,80-20 jusqu'à l'ethanol pur B (Fig. 1.1) ; la détection est effectuée à 220 nm. La zone présentant une activité biologique est collectée pour purifications complémentaires. B.l.3. Chromatographie par perméation de gel La fraction est purifiée par perméation de gel sur co¬ lonne Sephadex LH20 (colonne 1x20 cm ; phase LH20 Pharmacia) dans un solvant tel que l'ethanol, à un débit de 4 ml/heure. La détection est effectuée à 220 nm. La

colonne a été préalablement calibrée par rapport à des témoins de polyéthylèneglycols (PEG) (cf. Fig. 1.2). La fraction hachurée active est collectée. B.1.4. Chromatographie par échange d'ions Sur colonne d'échange d'ions (colonne DEAE-Trisacryl 1X2 cm ; IBF) , le composé actif (zone hachurée) est élue par un gradient linéaire de NaCl entre 0 et 0,1 N dans un tampon Tris-HCl 5X10 ^"3 N, pH=8,2 (Fig. 1.3). B.1.5. Chromatographie HPLC analytique en phase inverse L'ultime étape de purification est une chromatographie HPLC en phase inverse sur colonne analytique (4,5x250 mm ; phase Spherisorb/C^g 5 μm) avec, comme solvant, un mélange eau-acétonitrile 80-20 à un débit de lml/mn ; 300 μg sont injectés (Fig. 1.4a). Deux pics absorbant à 220 nm sont ainsi détectés et présentent une activité biologique. L'étude structurale montrera qu'il s'agit en fait du même composé apparaissant sous deux formes en équilibre (formes anomériques α et β libres) . B.2. Analyse des constituants B.2.1. Analyse des monosaccharides

Après hydrolyse poussée du composé (HCl 3N; 3h; 100 ^* C), puis dérivation en glycoside de méthyle péracétylé, on observe en chromatographie en phase vapeur (CPV) un seul monosaccharide identifié comme étant du déoxy-2-acé- tamido-2 glucose ou de l'acetyl glucosamine (NAc Glc). La série D de ce sucre a été établie après préparation du glycoside peracétate avec un alcool chiral et comparaison en CPV avec des témoins de (-) butanol-2-N-acétyl- glucosamine des séries D et L dérivés de façon analogue. La réduction du composé au borodeuterure de sodium (NaBD ₄ /H2θ lN;18h; 20 ^* C) est suivie d'une méthano- lyse douce (MeOH/HCl IN; 80 ^* C; Ih) puis d'un partage eau-dichlorométhane. La phase aqueuse contient du GlnNac-1-O-Me et du deoxy-2-acétamido-2-glucitol, identifiés en CPV (Fig. 2.1) ; l'identification en CPV est réalisée sur une colonne OV1 0,32 mmX30m, en utili-

sant l'hélium et un détecteur FID. La phase organique renferme le méthylglycoside de la glucosamine N-acylée par un acide gras C _] _g _: 2 identifiée par son spectre de masse en impact électronique du dérivé pertriméthylsilylé selon les données de la littérature (Demary, M. et al., Nouv. J. Chimie, 1977,2#373-378) ; le spectre de masse impact électronique (EI-MS) de la glucosamine 1-OMe amidifiée sur l'atome d'azote par un acide gras et pertriméthylsilylée est représenté à la figure 2.3. Après hydrogénation catalytique de la chaîne latérale, méthanolyse (MeOH, HCl 3N; 2h; 100'C), puis acétylation, l'analyse en CPV - réalisée sur colonne OV1 0,32mmX30m à l'aide d'hélium et d'un détecteur FID - des dérivés peracétylés permet de confirmer la structure de ce N-acyl-sucre en visualisant du Glc-NAc-1-OMe et du palmitate de méthyle (accompagné de stéarate de méthyle en quantité moindre) (Fig. 2.2).

Cette analyse permet d'établir la présence de trois types de glucosamine: NAcGlc, NacGlc réductrice et N-acyl Glc, selon un cheminement analytique résumé à la Fig. 3 annexée.

B.2.2. Composition en acides gras

Les acides gras présents dans le composé ont pu être iso¬ lés après saponification (KOH 5%;18h; 80"O puis analysés en CPV - sur colonne OV1 0,32mmX30m à l'aide d'hélium et d'un détecteur FID - sous la forme d'esters de méthyle (Fig. 2.4). Cette étude a permis d'identifier outre un acide gras majoritaire en C^g^, d'autres entités minori¬ taires: C _16:0 , ^c lg _: l/ 18:0 ^{e c} 18:l* ^La osition des deux double-liaisons de l'acide gras en C]_ _: 2 ^a P ^u être précisée à partir du spectre de masse MS-MS du carboxylate formé à partir de son ester de perfluoro- benzyle (J.C. Pro é et al., Rapid Comm. Mass spectrom. , 1987,1,80-82) et localisée en 2 et 9 sur la chaîne.

B.2.3. Mise en évidence d'une fonction sulfate

Après culture des bactéries en présence de sulfate de so¬ dium marqué au ³ ^S, puis purification du composé, la cor¬ respondance observée entre le profil d'absorption UV et 1'incorporation de ³ ^S permet de conclure à la présence d'une fonction sulfate dans ce composé. La figure 1.4b représente ladite correspondance obtenue par incorpora¬ tion de --'-'S, après culture sur (*- ^,* *'S) Na2S0 ₄ puis fractionnement selon le profil représenté à la figure 1.4a et comptage de la radioactivité par scintillation liquide.

B.2.4. Détermination du mode de liaison interglycosidique Le mode de liaison entre les différentes glucosamines a été établi après permethylation du composé réduit par NaBD ₄ , hydrolyse et préparation des alditols acétates selon les méthodes précédemment décrites (K. Stellner et al., Arch. Biochem. Biophys. , 1973.155.464-472) , suivies d'une analyse par CPV-SM ; le spectre de masse impact électronique des alditols acétates issus de la permethylation du composé réduit est représenté à la figure 2.5. Cette étude a permis d'identifier des alditols acétates tetra-méthylés en 1,2,3,5 (spectre a) et 2,3,4,6 (spectre b) et tri-O-méthylés 2,3,6 (spectre c) provenant respectivement d'une glucosamine réductrice substituée en 4 et 6, d'une glucosamine terminale et d'une glucosamine liée en 1 et 4. B.3. Spectrométrie de masse

B.3.1. Spectrométrie de masse FAB mode positif Le spectre de masse FAB mode positif du composé (Fig. 4.1, balayage de m/z 4 000 à m/z 100 (masse nominale)) montre un ion pseudomoléculaire M+H ⁺ m/z=1103, accompagné de l'ion sodé correspondant à m/z=1125. Des ions fragmen¬ taires sont aussi observés à m/z=1023 et 802 attribués respectivement aux pertes de sulfate et de NAcGlucosamine sulfate. La décomposition de l'ion m/z=802 est observée en spectrométrie MS-MS (Fig. 4.2; balayage en B/E) et

conduit à deux fragments glycosilyle à m/z=599 et 396 consécutifs aux cassures entre les différents monosaccha- rides. Ces deux spectres permettent d'établir une structure tétrasaccharidique linéaire dont le sucre réducteur est substitué par une fonction sulfate et le sucre terminal par un acide gras en C _] _g _: 2- B.3.2. Spectrométrie de masse FAB mode négatif Hormis l'ion pseudomoléculaire M-H ^~ à m/z=1101, le spectre FAB mode négatif présente des fragments attri- buables aux coupures glycosidiques. L'analyse de ces ions conduit à des conclusions structurales analogues à celles décrites plus haut : cf. la figure 4.3 qui montre le spectre de masse d'ionisation FAB négatif, en utilisant le thioglycérol comme matrice. B.4. RMN

B.4.1. RMN ¹ H et RMN-2D-homonucléaire proton (COSY) Les données relatives aux spectres RMN ^** Η et RMN-COSY per¬ mettent d'établir les éléments structuraux suivants : a) La chaîne latérale présente en RMN-'-H deux types de protons vinyliques correspondant aux deux double-liai¬ sons. Deux signaux à bas champ (δ=5, 95ppm;lH et δ=6,80ppm;lH) sont attribués à une double liaison conju¬ guée à la fonction carbonyle et présentent une grande constante de couplage (J=15Hz) caractéristique d'une géo- metrie E ; la figure 5.1 représente le spectre RMN-'-H susdit ; on utilise comme solvant le CD3OD et une fréquence de 300MHz (Appareil "Bruker"). Les deux protons de la double-liai-son interne à la chaîne, magnétiquement équivalents, apparaissent en un seul signal (δ=5,35ppm) . Les protons de ces deux double-liaisons présentent en 2D-COSY une cascade de corrélations avec les autres protons aliphatiques caractéristique d'une chaîne li¬ néaire ; la figure 5.2 représente le spectre RMN-2D-COSY homonucléaire ^*** H obtenu en utilisant le CD3OD comme solvant et une fréquence de 300MHz (Appareil "Bruker").

b) Protons anomeriques : Le spectre RMN---H-2D-C0SY homonu- cléaire de la région saccharidique est représenté à la figure 5.3 ; ce spectre qui a été obtenu en utilisant comme solvant le CD3OD et une fréquence de 300MHz (Appareil "Bruker") montre dans la région des protons saccharidiques de 3,4 à 5,2 ppm 5 signaux n'ayant qu'une corrélation, attribués aux protons anomeriques. De plus, aucun signal n'est masqué par le massif de l'eau comme 1'indique 1'absence de corrélation de cette région du spectre. Ces signaux anomeriques correspondent à trois doublets de liaisons β (δ=4,40 à 4,55ppm; 3H; J=8,5Hz) et deux doublets attribués aux protons anomeriques des formes α et β du sucre réducteur (δ(α)=5,05ppm;J=3,4Hz et δ(β)=4,60ppm; J=8,5Hz). c) Protons des cycles : Les cycles saccharidiques sont caractérisés par les signaux méthyle des groupements acé- tamide, dédoublés par la coexistence des formes α et β libres de 1'oligosaccharide (δ=2,0 à 2,15ppm; 6s; 9H) . Les autres protons du cycle résonnent entre 3,2 et 3,9 ppm. Seuls trois signaux plus déblindés sont attribués aux hy¬ drogènes situés à proximité du groupement sulfate. Le mode de corrélation observé en 2D-COSY (Fig. 5.3) entre ces trois signaux est caractéristique de protons 5 et 6 (corrélation H5/H6b, H5/H6a et H6a/H6b) . Ce résultat permet de situer la fonction sulfate en position 6. B.4.2. RMN ¹³ C

L'attribution des différents signaux du spectre RMN- ^* ---'C découplé du proton (Fig. 5.4), a permis de confirmer la présence d'une chaîne d'acide gras di-insaturé, le mode de liaison β l->4 entre les glucosamines ainsi que la position en 6 du sulfate à partir des éléments suivants ; La figure 5.4 représente le spectre RMN ^1* -'C obtenu à 50,4MHz (Appareil "Bruker"), en utilisant comme solvant le D ₂ 0: a) Chaîne d'acide gras : Les déplacements chimiques des carbones de la chaîne latérale (C2 • à C _] _ 1 ) sont caracté-

ristiques d'un acide gras possédant une double-liaison conjuguée (C2 • et et 155 ppm) et une double liaison interne (C91 et Cι_o > ;δ=133 ppm) . b) Carbones anomeriques : Un signal prépondérant (δ=103,7ppm) attribué aux carbones anomeriques des mono- saccharides non réducteurs, présente un déplacement chi¬ mique analogue au C^ du glucopyranoside de méthyle du GlcNAc. Deux signaux d'intensités plus faibles sont attribués au C _] _ de la glucosamine réductrice apparaissant sous ces deux formes anomeriques libres (δC^α=93, lppm et δC ₁ β=97,8ppm) . c) Cycle : A partir des données de la littérature, l'attribution des différents signaux conduit à confirmer l'enchaînement β l->4 dans le tétrasaccharide. Cette attribution est compliquée par la séparation en deux groupes de signaux des carbones de la glucosamine réduc¬ trice. La présence de la fonction sulfate en 6 est confortée par le déblindage observé du carbone 6 porteur de cette fonction (δCg_^=68,7ppm) . Exemple 2 - Mise en évidence de l'activité biologique du facteur NodRm-1

Les activités biologiques mises en évidence

(i) par le test d'activité spécifique de déformation des poils racinaires (Had) sur la vesce décrit par Zaat et al., (J. Bacteriol., 1987.169.3388-3391) . (ii) et par les tests de déformation et de ramification des poils racinaires de luzerne décrits par Faucher et al. (J. Bacteriol, 1988.170.5489-5499 ; Molec. Plant-Microbe Interact., 1989,2 _/ 291-300) ont prouvé que la substance conforme à l'Invention est un signal symbiotique plante- spécifique dont la production est sous le contrôle des gènes nod.

En effet :

1) après trois types de purifications basés sur des propriétés physico-chimiques différentes, échange d'ions, filtration en gel et la chromatographie en phase

inverse, on observe dans tous les cas une corrélation absolue entre la présence de cette molécule caractérisée par son profil HPLC, par spectrométrie de masse et par spectrométrie RNM- ^* ' ^* H- et son activité Had spécifique sur la luzerne ;

2) une augmentation de 1'activité des gènes nod soit par induction de la transcription, soit par l'augmentation du nombre de copies de ces gènes, est corrélée avec une augmentation de la production de la molécule, alors qu'une mutation due au transposon Tn5 dans les gènes nodA ou nodC a pour effet de supprimer sa production ;

3) L'activité biologique du composé NodRm-1, telle que détectée par les bio-essais de ramification des poils racinaires est très élevée et spécifique.

Une solution NodRm-1 à une concentration de l'ordre de 10 ^~* -'-10 ^~ -'- ^< -' M provoque des réactions Had sur la luzerne, hôte homologue, mais pas sur la vesce, qui est un hôte hétérologue. Le composé NodRm-1 (voir formule II) est encore actif vis-à-vis de la luzerne, à une concentration de ÎO-- ^**1 M.

Le spectre RNM ^* " ^* H indique pour le composé NodRm-1 une pureté d'au moins 95 % (cf. Fig. 5.1) .

Il n'a pas été détecté, dans la fraction active, de molécules comportant un noyau aromatique caractéristique des hormones végétales telles que l'auxine et la cytokinine. C'est pourquoi les conta¬ minants hormonaux éventuels devraient être présents à des concentrations inférieures à 10 ^"****3 M, c'est-à-dire à des concentrations environ 100 000 fois inférieures au seuil (10 ^~7 M) auquel ces phythormones agissent lorsqu'elles sont ajoutées par voie exogène, ce qui signifie que l'on ne peut pas attribuer à de tels conta¬ minants les effets observés. L'étude des mutants de R .meliloti affectés dans des gènes hôtes-spécifiques fait apparaître une

corrélation absolue entre la spécificité du comportement symbiotique de cellules vivantes de Rhizobium et la spécificité du bio-essai Had de leurs surnageants stériles, ce qui indique que les signaux Nod sont impliqués dans l'induction de l'infection spécifique et de la nodulation.

Le composé NodRm-1 a à la fois une très forte activité biologique et une très forte spécificité. En effet, il provoque des réactions détectables sur la plante-hôte à des concentrations très faibles, de l'ordre de ÎO-- ^* -- ^* ' M, alors que les hormones végétales connues, comme les auxines et cytokinines, agissent à des concen¬ trations nettement supérieures (10 ^~7 -10 ^~ ° M) . D'autre part, les oligosaccharides de type "éliciteurs" qui ont été décrits dans l'Art Antérieur et qui agissent à des concentrations faibles (10 ^""* ' M) ne sont pas spécifiques, alors que la molécule-signal NodRm-1 conforme à l'Invention a une grande spécificité d'action : alors qu'elle agit à une concentration de 10 ^~12 sur la luzerne, plante homologue, elle n'est toujours pas active à une concentration de 10 ^~ ° M sur une plante non-hôte comme la vesce. Cette molécule présente donc des propriétés originales et importantes quant à son activité sur les plantes. En l'absence de bactéries et à de faible concentrations (10 ^~7 M-IO-"-* M) la molécule-signal NodRm-1 provoque l'induction d'abondantes divisions mitotiques dans le cortex racinaire de la luzerne : NodRm-1 présente donc un fort effet mitogène. En l'absence de bactéries et à de faible concentrations (10 ^~7 M-10-*' M) la molécule-signal NodRm-1 provoque 1'induction de la formation de nodosités sur les racines de la luzerne, nodosités qui présentent des caractéristiques ontologiques, morphologiques et anatomiques des nodosités de luzerne induites par les

bactéries symbiotiques. NodRm-1 a donc un effet organogène sur les racines de luzerne.

En 1'absence de bactéries et à de très faibles concentrations (ÎO ^-* - ¹ M ÎO ^-1 ' ^* ' M) , le composé NodRm-1 provoque des déformations de poils absorbants sur la luzerne et une induction de la transcription de gènes symbiotiques de Légumineuses. A ces mêmes doses en présence de R .meliloti , l'addition de composé NodRm-1 provoque une accélération de 1'infection et de la formation des nodosités racinaires. Son addition à des Légumineuses, par exemple par enrobage de graines au moment du semis, est apte à accélérer la formation des nodosités et l'établissement de la fixation d'azote.

Il est important de souligner que c'est la première fois qu'on isole à partir d'une bactérie des oligomères d' exosamines sulfatés. En effet, des sucres sulfatés ont été isolés chez l'animal mais n'avaient été ni détectés ni a fortiori isolés jusqu'à ce jour ni chez les plantes ni chez les bactéries. De plus, les oligomères d'hexosamines sulfatés et acylés conformes à la présente Invention présentent une activité biologique exceptionnelle en ce qu'ils ont une activité à des doses infinitésimales ; en effet, ils sont au moins 100 000 fois plus actifs que les hormones végétales. On n'a jamais proposé jusqu'à présent l'utilisation de substances naturelles ayant une telle activité à des doses aussi faibles, dans le domaine végétal. Cette activité exceptionnelle laisse à penser que les substances conformes à l'Invention ont une affi- nité considérable pour certains récepteurs - affinité très supérieure à celle des produits décrits jusqu'à pré¬ sent y compris les hormones végétales -. Les récepteurs qui ont une affinité pour les sucres présentent générale¬ ment la structure de glycoprotéines et notamment de lectines ; or de tels récepteurs existent aussi dans le règne animal ; les substances conformes à 1'Invention

doivent donc être considérées comme pouvant être dotées d'une activité thérapeutique importante. En particulier, l'agent thérapeutique conforme à l'Invention est propre, entre autres, à stimuler les mécanismes de défense contre les pathogènes chez l'Homme et chez l'animal.

Exemple 3 - Préparation des substances Ac-NodRm-1 et Ac-NodRM-3 par purification à partir d'un milieu de culture de Rhizobium meliloti

A. Production des composés Si au lieu d'introduire le plasmide

"surproducteur" pGMH49 dans la souche de ^' JR. meliloti 2011, on introduit le plasmide pMH682 qui contient seulement le couple de gènes régulateurs syrM/NodD3 , on provoque également une forte augmentation de la transcription des gènes nod communs et spécifiques et une augmentation de la production de facteurs Nod. Les extraits butanoliques du surnageant d'une telle souche, lorsqu'ils sont fractionnés par chromatographie HPLC, présentent un profil différent de celui des extraits de la souche R . meliloti 2011 (pGM1149), ce qui implique la production de nouveaux composés.

B. Détermination de la structure des composés

1. Purification

Les composés sont purifiés selon le protocole décrit dans l'exemple 1. L'ultime étape de chromatrogra- phie HPLC analytique en phase inverse permet de séparer le composé Ac-NodRMm-1 du composé Ac-NodRm-3.

2. Etudes structurales

2.1. Structure du composé AC-NodRm-1 2.1.1. Traitement au méthanolate de sodium

Par traitement au méthanolate de sodium, le composé Ac-NodRm-1 est converti en NodRm-1 dont la struc¬ ture est déterminée comme dans 1'exemple 1. 2.1.2. SOectrométrie de masse Le spectre de masse FAB mode positif du com¬ posé Ac-NodRm-1 (Fig 6A) montre un ion moléculaire

24 protonné à m/z 1145, ainsi que les ions (M+Na) ⁺ à m/z 1167 et (M+2N _a -H) ⁺ à m/z = 1189. La décomposition de 1'ion moléculaire protonné par spectrométrie MS/MS (Fig. 6B : balayage B/E) conduit à des ions fragmentaires 5 à m/z 1065, m/z 844, m/z 641 et m/z 438. Les ions fragments à m/z 1065 et m/z 844 sont attribués respectivement à la perte de SO3 et de N-acétyl-D-glucosamine sulfate. Les fragments à m/z 641 et m/z 438 correspondent aux ions glycosylium obtenus par 10 rupture des liaisons interglycosidiques. Ces deux spectres montrent que le composé Ac-NodRm-1 ne diffère du ^' composé NodRm-1 que par la présence d'un groupement acétate sur la glucosamine terminale non réductrice. 2.1.3. RMNJ-H 15 Le spectre RMN-'-H du composé Ac-NodRm-1 permet d'établir les éléments structuraux décrits dans l'exemple 1 (paragraphe B.4.1.) pour le composé NodRm-1. (i) deux doubles liaisons dont une conjuguée de géométrie E ; 20 (ii) signaux anomeriques caractéristiques de liaison β

(iii) signaux caractéristiques d'un groupe sulfate en position 6.

De plus, deux signaux à δ = 4,16 ppm et δ = 4,46 ppm, absents dans le spectre du composé NodRm-1

25 et disparaissant après O-déacétylation, permettent de localiser le groupement acétate en position 6 du sucre terminal non réducteur

2.2. Structure du composé Ac-NodRm-3

La structure du composé Ac-NodRm-3 a été

30 établie par spectrométrie de masse FAB mode positif

(Fig.). On observe un ion moléculaire protonné à m/z = 1348 ainsi que des ions sodés (M+Na) ⁺ à m/z = 1370 et (M+2Na-H) ⁺ à m/z = 1392. Les ions à m/z = 1268 et m/z = 1047 sont attribués respectivement à la perte de

35 S03 et d'une N-acétyl-glucosamine sulfate à partir de

(M+H) ⁺ . Les ions à m/z = 844, m/z = 641 et m/z = 438 sont

attribués aux ions glycosylium obtenus par coupures interglycosidiques. Ce spectre indique qu'Ac-NodRm-3 : (i) est constitué d'un enchaînement linéaire de cinq dérivés de D-glucosamine ; (ii) possède une chaîne N-acyl diinsaturée de 16 carbones et un groupement O-acétate sur le résidu glucosamine terminal non réducteur ;

(iii) possède une fonction sulfate sur le résidu N-acétyl-D-glucosamine réducteur. L'incubation du composé Ac-NodRm-3 en présence d'une exochitinase (extraite de Streptococcus griseus , Sigma) libère notamment un dimère de N-acétyl-D- glucosamine et de N-acyl-O-acétyl-D-glucosamine, ce qui montre que les liaisons entre les trois premiers résidus N-acétyl-D-glucosamine sont de type β-1,4. La digestion d'Ac-NodRm-3 par une endochitinase (également extraite de Streptococcus griseus, Boeringer) conduit à la formation d'une N-acyl-O-acétyl-D-glucosamine montrant que la liaison avec le résidu terminal non réducteur est également de type β-1,4.

Exemple 4 - Préparation de facteurs Nod à partir d'un milieu de culture de Rhizobium leguminosarvim biovar viciae

A. Production des facteurs Nod Dans les pays européens la culture de protéa- gineux, comme le Pois et le Féverole, s'est beaucoup développée au cours de la dernière décennie. Les Inventeurs ont donc entrepris d'étudier la production de facteur Nod par Rhizobium leguminosarum b.v. viciae, la bactérie symbiotique de ces protéagineux.

Dans le but de provoquer une augmentation de la production de ces signaux, les Inventeurs ont introduit dans la souche R . leguminosarum 248, le plasmide pU1089. Ce plasmide, dérivé du vecteur pLAFRl, contient l'ensemble de la région Nod de R . leguminosarum,

c'est-à-dire les opérons nodD, nodABCIJ, nodFEL, nodMNT, nodO (Do nie et al., EMBO J., 1983, 2/ 947-952).

La souclie 248(plJ1089) est cultivée dans le même milieu que R . meliloti , mais pour l'induction de la transcription des gènes nod, une flavanone, la naringénine, a été utilisée à la place de la lutéoline.

Après induction des gènes nod le surnageant des cultures présente une forte activité de déformation de poils absorbants d'une espèce de vesce appropriée ( Vicia sativa subsp. nigra) . Cette activité n'est pas détectable dans les surnageants de culture d'une souche

R . leguminosarum 248 mutée dans les gènes communs nodABC.

B. j-uyjfjçatjop

Les composés Nod sont extraits du milieu de culture selon le procédé décrit dans 1'exemple 1 (B.l.l.). L'extrait est lyophilisé puis chromâtrographié en HPLC phase inverse selon le procédé décrit dans l'exemple 1 (B.l.2.). Les composés Nod sont ensuite purifiés sur une cartouche Sep-Pak QMA (Waters Millipore) forme acétate. Les composés sont élues avec 5 ml d'éthanol absolu.

C. Détermination de la structure

Le spectre de masse FAB en mode positif montre majoritairement trois ions moléculaires protonnés à m/z = 1067, m/z = 1069 et m/z = 1095, accompagnés de leurs ions sodés (M+Na) ⁺ respectivement à m/z = 1089, m/z = 1091 et m/z = 1117. La décomposition par spectrométrie MS/MS de l'ion à m/z = 1089 (respectivement m/z = 1091 et m/z = 1117) fournit des ions fragments à m/z = 868 (respectivement m/z = 870 et m/z = 896) , m/z = 665 (respectivement m/z = 667 et m/z = 693) et m/z = 462 (respectivement m/z = 464 et m/z = 490) . Ces ions sont obtenus par rupture interglycosidique, avec perte successive de fragments d'une masse de 203 correspondant à un résidu N-acétyl-glucosamine. Ces spectres montrent que les composés NodRl sont constitués

d'un enchaînement linéaire de N-acétyl-hexosamine. Les ions de m/z = 462, 464 et 490 correspondent à des O-acétyl-hexosamines diversement N-acylées.

L'analyse des acides gras portés par le résidu terminal non-réducteur a été réalisée par GC/MS après saponification selon le protocole décrit dans le para¬ graphe B.2.2. Cette étude a permis d'identifier les acides gras majoritaires suivants : Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'Invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente Invention.