本発明の徐放性製剤は、bFGF及び/又はそ� �同族体を担持させたアガロースハイドロゲ� �を含有することを特徴とする。本発明にお� �て「徐放性製剤」とは、徐放性担体として� �ガロースハイドロゲルを用いてbFGF及び/又は その同族体を長期間に亘って放出可能な製剤 をいう。

 bFGF及びその同族体は、天然に存在するも のであってもよく、遺伝子組換え技術により 微生物もしくは培養細胞に産生させたものか ら単離精製することにより、又はそれらを化 学的修飾もしくは生物的修飾することにより 得られたものであってもよい。

 天然のbFGFとしては、哺乳動物由来のもの があげられる。哺乳動物としては、ヒト、サ ル、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ等があ げられる。bFGFはこれら哺乳動物から公知の� �法により得ることができ、また、市販のも� �を用いることもできる。本発明で用いるbFGF� ��しては特にヒトbFGF又はその同族体が好まし い。

 また本発明の徐放性製剤においては、有� ��成分としてbFGFの同族体を用いてもよい。こ こで、bFGFの同族体とは、下記〔I〕又は〔II� �のポリペプチドを意味する。

〔I〕特定の哺乳動物で産生されるbFGFと実� ��的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプ� ��ド。実質的に同一のアミノ酸配列とは、ア� ��ノ酸配列中の1~6個のアミノ酸が別種のアミ� ��酸により置換されたものでbFGFの生物活性を 有するものを意味する。

〔II〕特定の哺乳動物で産生されるbFGFのN� �端及び/又はC末端、あるいは上記〔I〕のポ� �ペプチドのN末端及び/又はC末端に、追加の� �ミノ酸セグメントが付加されたポリペプチ� �。追加のアミノ酸セグメントとは、1~12個の� ��ミノ酸からなり、bFGFの生物活性又は上記〔 I〕のポリペプチドの生物活性を損なわない� �のを意味する。

 ヒトbFGFはアミノ酸146個のポリペプチドで あるが、本発明の徐放性製剤においては、ヒ トbFGFの同族体(前記〔I〕の同族体)として、� �えば特表平2-504468号公報に記載のアミノ酸146 個のポリペプチドを用いてもよい。このポリ ペプチドは、ヒトbFGFのアミノ酸配列を構成� �る69位のシステイン(Cys)及び87位のシステイ� �(Cys)がそれぞれセリン(Ser)により置換された� ��のである。

 また、前記〔II〕の同族体として、例え� �特表昭63-500843号公報に記載のアミノ酸155個� �ポリペプチドを用いてもよい。このポリペ� �チドは、ヒトbFGFのN末端にアミノ酸9個のセ� �メントが付加されたものである。

 また、N末端にメチオニン(Met)が付加され� ��アミノ酸147個のポリペプチドや、特表昭63-5 01953号公報に記載のN末端にアミノ酸11個から� ��るセグメントが付加されたアミノ酸157個の� ��リペプチドを用いてもよい。

 特に好ましいbFGFとしては、トラフェルミ ン(遺伝子組換え)(科研製薬製)があげられる� �

 本発明の徐放性製剤においては、一種類� ��bFGFを単独で使用してもよいし、複数種を併 用してもよい。さらに、前述したように、bFG Fの同族体は複数種あるが、これらの同族体� �ついても、それぞれを単独で使用してもよ� �し、併用してもよい。

 なお、生体内におけるbFGFの存在量は極微 量であるため、本発明の徐放性製剤を商業的 に安定して供給するためには、遺伝子組換え 技術により大腸菌等の微生物又は培養細胞に 産生させたbFGF又はその同族体を使用するこ� �が特に好ましい。bFGF又はその同族体(この場 合は一般に前記〔I〕のポリペプチド)を産生� ��せるための遺伝子を微生物又は培養細胞に� ��み込んだ場合、この微生物又は培養細胞か� ��産生されるものは、一般に、bFGFのN末端及� �/又はC末端、又は上記〔I〕のポリペプチド� �N末端及び/又はC末端に、追加のアミノ酸セ� �メントが付加したもの、すなわち前述した� �II〕のポリペプチドである。

 本発明において「アガロースハイドロゲ� ��」とは、アガロースを原料とし、水分を多� ��に含む性質を有するゲルをいう。

 アガロースハイドロゲルは、bFGF又はその 同族体の保持性及び放出特性が良好なことか ら、アガロースのみから調製されるものが好 ましい。

 アガロースとは、1,3位で結合したβ-d-ガ� �クトピラノース及び1,4位で結合した3,6-アン� ��ドロ-α-l-ガラクトピラノースの繰り返し構� ��からなる多糖をいい、β-d-ガラクトピラノ� �スの2位及び6位に少量のスルホン酸エステル 、硫酸エステル、ピルビン酸ケタール、カル ボキシル基などが存在するといわれている(El ectrophoresis 1999, 20, 1455-1461)。本発明におい� �は、市販のアガロースを好適に使用するこ� �ができる。

 アガロースハイドロゲルの形状は特に制� ��はなく、例えば、円柱(ディスク)状、角柱� �、シート状、粒子状、ペースト状などがあ� �られる。注入可能な製剤として用いる場合� �は、粒子状が好ましい。

 アガロースハイドロゲルの大きさは、投与� ��る部位に適合するように任意に設定するこ� ��ができる。前記形状が粒子状の場合、アガ� ��ースハイドロゲルが吸水したときの粒子の� ��均粒子径は、通常1.0~1000μmであり、注射投� �の観点から、1~100μmが好ましく、10~100μmがよ り好ましい。
 吸水したアガロースハイドロゲルの粒子径� ��布および平均粒子径は、各種微粒子50mgを蒸 留水10mL中に分散させ、1時間経過後に日機装� ��式会社製 MICROTRAC Full Range Analyzer (FRAR)に� ��り測定した値である。

 本発明の徐放性製剤に含まれるbFGF及び/� �はその同族体の量は、bFGFをその薬効が発揮� ��れる限度で目的の組織に長期に亘って供給� ��能な量であればよく、治療目的、対象とす� ��組織の大きさ等により適宜設定することが� ��きる。例えば、ヒトの下肢の血管新生を目� ��とする場合、本発明の徐放性製剤に担体と� ��て含まれるアガロースハイドロゲルの乾燥� ��量1mg当り、0.1μg~10mg、好ましくは0.2~100μgが� ��示される。

 本発明の徐放性製剤は、bFGF及び/又はそ� �同族体を担持させたアガロースハイドロゲ� �そのものであってもよい。この場合、本発� �の徐放性製剤は、減圧乾燥製剤又は凍結乾� �製剤であることが好ましい。

 あるいは、本発明の徐放性製剤は、さら� ��医薬上許容されうる担体を含有するもので� ��ってもよい。医薬上許容されうる担体とし� ��は、本発明の徐放性製剤が注入可能な製剤� ��ある場合には、注射用精製水、生理食塩水� ��緩衝液(例、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ク エン酸緩衝液)などの媒体があげられ、さら� �必要に応じ、分散剤、界面活性剤、等張化� �、pH調整剤、無痛化剤、安定化剤、保存剤、 着色剤などを用いてもよい。

 また、本発明の徐放性製剤は、bFGF及び/� �はその同族体を担持させたアガロースハイ� �ロゲルと、医薬上許容されうる担体とを別� �の容器に格納したキットの形式であっても� �い。

 本発明の徐放性製剤は、生体内に投与し� ��場合、有効成分であるbFGF及び/又はその同� �体が長期に亘って持続的に放出されるもの� �あることから、bFGFの作用効果が期待される� ��々な治療用途に用いられうる。治療用途と� ��ては、bFGFの公知の用途が限定なくあげられ 、例えば、血管新生促進、組織再生、創傷、 骨疾患、歯周疾患、軟骨疾患が例示されるが 、ゼラチン徐放性製剤と同等の効果が発揮さ れる血管新生促進又は組織再生が好ましい。

 本発明において、血管新生促進及び/又は 組織再生により症状が改善されることが期待 される疾患としては、血管閉塞性疾患及び該 血管閉塞に伴う虚血性疾患全般であり、具体 的には、慢性動脈閉塞性疾患一般であり、例 えば、閉塞性動脈硬化症、バージャー病、糖 尿病性壊疽、心筋梗塞、狭心症などが挙げら れる。

 また、本発明の徐放性製剤は、当該徐放� ��製剤を血管新生促進又は組織再生に使用す� ��ことができること又は使用すべきであるこ� ��を記載した当該徐放性製剤に関する記載物� ��共に含む商業パッケージとしても提供する� ��とができる。

 本発明の徐放性製剤の製造方法は、塩基� ��線維芽細胞増殖因子及び/又はその同族体と アガロースハイドロゲルを使用することを特 徴とする。以下、製造方法について詳述する 。

アガロースハイドロゲルの調製方法
 アガロースハイドロゲルは、一般的には、� ��ガロースと水を混合し、加熱してアガロー� ��を溶解した後、成型、冷却することによっ� ��調製される。アガロースの濃度は、溶液が� ��ル化する濃度以上であって、ゲルからのbFGF の放出速度を制御しうる濃度であればよく、 通常、0.5~10w/v%であり、好ましくは1~5w/v%であ� ��。加熱条件は、通常90~120℃程度であり、常� ��下で加熱又は高圧蒸気滅菌により行うこと� ��できる。加熱時間はアガロースが完全に溶� ��するまでの時間であれば特に限定されない� ��
 溶解したアガロースの成型及び冷却は、ア� ��ロース水溶液を所望の形状の鋳型に流し込� ��、室温で一定時間放置するか、0~10℃程度の 冷蔵庫内又は氷上にて冷却することによりゲ ル化され、鋳型の形状に応じて成型される。 成型されたゲルをさらに、所定の大きさに切 断することも可能である。ペースト状のアガ ロースハイドロゲルも同様の方法で調製する ことができる。

粒子状のアガロースハイドロゲルの調製方法
 粒子状のゲルの調製法としては、例えば、E mulsification/internal gelation法、すなわち、上記� ��ようにして溶解したアガロース溶液を加温� ��た油相に加え、攪拌してW/Oエマルションと� ��る方法などが挙げられる。
 用いられる油としては、ヒマシ油、オリー� ��油、大豆油、綿実油、テレビン油などがあ� ��られる。油の加温条件としては、通常、40~8 0℃である。80℃を超えると、ゲルの凝集が起 こりやすくなる。攪拌条件としては、200~2000r pmが例示され、ゲルの粒子サイズの微調整が� ��能なことから、1200~1800rpm程度が好ましい。� ��た、油の粘度と得られるゲルの平均粒子径� ��の関係は、ヒマシ油等の粘度が高い油を用� ��ると平均粒子径の小さいゲルが得られ、テ� ��ビン油等の粘度が低い油を用いると平均粒� ��径の大きいゲルが得られる傾向がある。ま� ��、油の粘度を約10~20mPa・s(60℃で、E型回転粘 度計を用いて測定した値)の範囲に設定した� �合、攪拌条件の影響を受けずに数十μmの平� �粒子径のゲルを安定して得ることができる� �また、アガロース溶液の粘度と油の粘度と� �差もゲルの平均粒子径に影響する。

 その後、ゲル溶液の分散状態を保つため� ��攪拌を続けながらエマルションを冷却する� ��アセトン、エタノール、酢酸エチル等の有� ��溶媒を加えて粘度を下げた後に吸引ろ過に� ��り油相から粒子を分離し、アセトン、エタ� ��ール、酢酸エチル等の有機溶媒で洗浄して� ��ル粒子を採取する。

 上記のようにして得られたアガロースハ� ��ドロゲルは減圧乾燥又は凍結乾燥させるこ� ��ができる。凍結乾燥は、風乾させたゲルを- 20℃で1時間凍結させた後に凍結乾燥機で1~3日 間乾燥させることにより行う。

 上記のようにして調製したアガロースハ� ��ドロゲルにbFGFを担持させるには、bFGF水溶� �をアガロースハイドロゲルに滴下して含浸� �せるか、アガロースハイドロゲルをbFGF水溶� ��中に懸濁して再吸水させる。

 アガロースハイドロゲルに担持させるこ� ��ができるbFGFの量は、アガロースハイドロゲ ル乾燥重量1mg当たり0.1μg~10mgであり、0.2~100μg が好ましい。

 なお、徐放期間、bFGFの放出量等は、アガ ロースハイドロゲルの含水率、用いたアガロ ースの物性、製剤に担持されるbFGFの量、投� �される部位などの種々の条件により異なる� �、当業者であれば、本発明に開示された記� �を考慮して適宜条件設定をすることができ� �。

 上記のようにして得られた本発明の徐放� ��製剤は、凍結乾燥することもできる。凍結� ��燥する場合には、例えば、液体窒素中で30� �以上又は80℃で1時間以上凍結させた後に、� �結乾燥機で1~3日間乾燥させることにより行� �。

 本発明の徐放性製剤を注入可能な製剤と� ��る場合には、注射用精製水、生理食塩水、� ��衝液などの媒体に適宜懸濁する。緩衝液と� ��ては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン� ��緩衝液などがあげられる。さらに必要に応� ��、注射可能な製剤の製造に通常使用される� ��分散剤、界面活性剤、等張化剤、pH調整剤� �無痛化剤、安定化剤、保存剤、着色剤など� �適宜配合することができる。

 本発明の徐放性製剤は、ヒトのみならず� ��の他の哺乳動物(例えば、マウス、ラット、 ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒ ツジ、サル等)にも投与可能である。

 本発明の徐放性製剤の投与方法は、特に� ��定されないが、治療対象部位への局所投与� ��好ましい。例えば、18~27G程度の太さの注射� ��を取り付けた注射筒で本発明の徐放性製剤� ��適量取り、治療対象部位へ筋肉内投与、皮� ��投与、静脈内投与する方法等があげられる� ��また、簡易型注射器具のようなキット製品� ��リザーバー部分に予め本発明の徐放性製剤� ��充填しておき、投与することも可能である� ��

 本発明の徐放性製剤の投与量は、対象や� ��症度、対象の体重や年齢等により適宜変更� ��ることができるが、一般的には、ヒトの場� ��には、bFGF及び/又はその同族体量で1箇所の� ��置部位に対して1回の処置あたり、10μg~10mg� �例示される。投与回数は症例、1回の処置あ� ��りの投与量にもよるが、通常1~2回程度から� ��回が好ましい。