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| WO2001053350A1 | 2001-07-26 |
| CN101892264A | 2010-11-24 | |||
| CN1906211A | 2007-01-31 | |||
| CN102021201A | 2011-04-20 |
DATABASE GENBANK 20 September 2007 (2007-09-20), KHANAM, T. ET AL.: "Mus musculus transgenic enhanced green fluorescent protein mRNA, complete cds.", accession no. U056363
GUAN, XUEMIN ET AL.: "Development of research on porcine myostatin gene", SWINE PRODUCTION, 14 February 2004 (2004-02-14), pages 28 - 29
LI, HONGHUI ET AL.: "Construction of a Myostatin Gene-Targeting Vector and Myostatin Gene Knockout of Porcine Fetal Fibroblasts Cells", LETTERS IN BIOTECHNOLOGY, vol. 21, no. 5, 30 September 2010 (2010-09-30), pages 699 - 704
北京纪凯知识产权代理有限公司 (CN)
| 权利要求 1、 一种表达盒， 由启动子、 外源基因和如下权利要求 6 所述终止子 组成； 所述启动子为如下 1 ) -4 ) 中任一所述的 DNA分子： 1 ) 序列表的序列 1 自 5 ' 末端第 2642-3778位核苷酸； 2 ) 序列表的序列 1所示的核苷酸； 3 ) 在严格条件下与 1 ) 或 2 ) 限定的 DNA序列杂交且具有相同功能的 DNA分子； 4 ) 与 1 ) 或 2 ) 限定的 DNA分子序列至少具有 70%、 至少具有 75%、 至少具有 80%、至少具有 85%、至少具有 90%、至少具有 95%、至少具有 96%、 至少具有 97%、 至少具有 98%或至少具有 99%同源性且具有相同功能的 DNA 分子； 所述终止子的核苷酸序列为序列表的序列 3。 2、 根据权利要求 1所述的表达盒， 其特征在于： 所述外源基因为猪肌抑素基因或绿色荧光蛋白编码基因； 所述猪肌抑素基因的核苷酸序列为序列表的序列 2 ; 所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列 5 ; 所述绿色荧光蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列 4。 3、 含有权利要求 1或 2所述表达盒的重组载体、 重组菌、 转基因细 胞系、 转基因动物胚胎或转基因动物。 4、 根据权利要求 3所述的重组载体或转基因细胞系， 其特征在于： 所述重组载体为将权利要求 1或 2所述表达盒插入 pUC19载体的多克 隆位点得到的重组载体； 所述转基因细胞系为将所述重组载体导入宿主细胞中， 得到的转基因 细胞系， 所述宿主细胞具体为 C2C12细胞。 5、 权利要求 1或 2所述的表达盒或权利要求 3或 4所述的重组载体 在促进外源基因在离体细胞或者离体动物中表达的应用。 6、 一种终止子， 为如下 1 ) -3 ) 中任一所述的 DNA分子： 1 ) 序列表的序列 3所示的 DNA分子； 2 )在严格条件下与 1 ) 限定的 DNA序列杂交且具有相同功能的 DNA分 子； 3 ) 与 1 ) 限定的 DNA分子序列至少具有 70%、 至少具有 75%、 至少具 有 80%、 至少具有 85%、 至少具有 90%、 至少具有 95%、 至少具有 96%、 至 少具有 97%、至少具有 98%或至少具有 99%同源性且具有相同功能的 DNA分 子。 7、 权利要求 6所述的终止子在终止外源目的基因表达中的应用。 |
本发明涉及生物技术领域， 尤其涉及一种猪肌抑素基因座位及其应 用。
背景技术
近十年来， 转基因技术得到迅猛发展和广泛应用， 特别是基因打靶与 体细胞克隆技术的结合， 使得转基因动物的基因定点修饰成为现实。 该技 术的关键是使外源基因在转基因动物基因组的 特定位置定点整合并且稳 定表达。 该 "特定位置" 需满足如下条件： （1)该处基因序列的缺失或突 变不引起宿主动物死亡； （2) 该处基因序列的缺失或突变不引起宿主动物 生长和发育异常或畸形； （3) 该处基因序列的缺失或突变不引起宿主动物 的不育； （4)该处基因序列受 DNA甲基化水平的影响较小， 特别是不存在印 记修饰， 以保证外源基因能够有效表达。 因此， 找到满足上述条件的理想 "特定位置" 是基因打靶和体细胞克隆成功应用的先决条件 。
肌抑素基因最早于 1997年由 McPherron等人从小鼠肌肉组织 cDNA文库 中克隆。 该基因属于 TGF- β家族， 是一种转化生长因子。 基因敲除证明此 基因的失活引起小鼠肌肉组织增生， 体重增大； 而且小鼠可以正常存活， 也具有生育能力。 随后在牛、 羊等动物中发现， 肌抑素基因的主要功能是 负调控肌肉生长发育， 而且肌抑素的失活并未导致上述动物的生理功 能出 现异常。
发明公开
本发明的一个目的是提供一种表达盒。
本发明提供的表达盒， 由启动子、 外源基因和如下所述终止子组成； 所述启动子为如下 1 ) -4 ) 中任一所述的 DNA分子：
1 ) 序列表的序列 1 自 5 ' 末端第 2642-3778位核苷酸；
2 ) 序列表的序列 1所示的核苷酸；
3 ) 在严格条件下与 1 ) 或 2 ) 限定的 DNA序列杂交且具有相同功能的 DNA分子；
4 ) 与 1 ) 或 2 ) 限定的 DNA分子序列至少具有 70%、 至少具有 75%、 至少具有 80%、至少具有 85%、至少具有 90%、至少具有 95%、至少具有 96%、 至少具有 97%、 至少具有 98%或至少具有 99%同源性且具有相同功能的 DNA 分子；
所述终止子的核苷酸序列为序列表的序列 3。
所述严格条件为在 6 X SSC, 0. 5% SDS的溶液中， 在 65°C下杂交，然后用 2
X SSC, 0. 1% SDS和 1 X SSC, 0. 1% SDS各洗膜一次。
所述外源基因为猪肌抑素基因或绿色荧光蛋白 编码基因；
所述猪肌抑素基因的核苷酸序列为序列表的序 列 2 ;
所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列为序列表中的 序列 5 ;
所述绿色荧光蛋白的编码基因的核苷酸序列为 序列表中的序列 4。 含有所述表达盒的重组载体、 重组菌、 转基因细胞系、 转基因动物胚 胎或转基因动物也是本发明保护的范围。
所述重组载体为将所述表达盒插入 PUC19载体的 Kpnl和 Hindi l l酶 切位点间得到的重组载体；
所述转基因细胞系为将所述重组载体导入宿主 细胞中， 得到的转基因 细胞系， 所述宿主细胞具体为 C2C12细胞。
本发明的另一个目的是提供一种终止子。
本发明提供的终止子， 为如下 1 ) -3 ) 中任一所述的 DNA分子： 1 ) 序列表的序列 3所示的 DNA分子；
2 )在严格条件下与 1 ) 限定的 DNA序列杂交且具有相同功能的 DNA分 子；
3 ) 与 1 ) 限定的 DNA分子序列至少具有 70%、 至少具有 75%、 至少具 有 80%、 至少具有 85%、 至少具有 90%、 至少具有 95%、 至少具有 96%、 至 少具有 97%、至少具有 98%或至少具有 99%同源性且具有相同功能的 DNA分 子。
所述的终止子在终止外源目的基因表达中的应 用。 也是本发明保护的 范围。
除非特别指出或是单独定义， 本文所使用的科学和技术术语具有本 发明所属领域技术人员共知的、 无歧义的相同含义。 另外， 本文所述的材 料、 方法以及实施案例本意在于说明和阐述而非限 制或限定。
附图说明 图 1为猪肌抑素基因座位 5 ' 端序列扩增
图 2 为猪肌抑素基因座位 5 ' 端序列克隆
图 3 为猪肌抑素基因座位 5 ' 端序列转录活性检测
图 4为猪肌抑素基因座位 3 ' 端序列扩增
图 5为猪肌抑素基因座位 3 ' 端序列克隆
图 6为猪肌抑素基因座位 3 ' 端序列转录活性检测
图 7为扩增猪肌抑素基因编码区 PCR产物电泳图
图 8为猪肌抑素基因座位载体 pUC19-3酶切鉴定图
图 9为猪肌抑素基因座位载体 pUC19-53酶切鉴定图
图 10为猪肌抑素基因座位载体 pUC19-5MSTN3酶切鉴定图
图 1 1 为猪肌抑素基因座位组织结构示意图
图 12为绿色荧光蛋白编码区 PCR扩增产物电泳图
图 13 为 pUC19-5EGFP3载体的酶切鉴定图
图 14 为 pUC19-5EGFP3载体的表达检测
图 15 为 pUC19-5EGFP3绿色荧光蛋白的相对表达强度
实施发明的最佳方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明 ， 均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径 得到。
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应当理解， 这些实施例仅 用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护 的范围， 下列实施例中未注 明具体实验条件和方法， 通常按照常规条件如 J. 萨姆布鲁克， D. W. 拉塞 尔等著， 黄培堂等译， 科学出版社， 2002， 分子克隆实验指南第三版所建 议的条件。
实施例 1、 猪肌抑素基因座位调控区域的克隆与活性鉴定
一、 猪肌抑素基因座位 5 ' 非翻译区的克隆及活性验证
1、 猪肌抑素基因座位 5 ' 非翻译区的克隆
表 1实验材料
主要材料 来源 说明 湖北白猪耳组织 湖北省农科院畜牧兽医 液氮速冻， -8CTC冻存 研究所实验猪场初生仔
猪
pGL3 - bas ic pGL3-promoter > 均购自 Promega (USA) pGL3 - bas ic pGL3 - promoter表 pRL-TK报告载体 达萤火虫荧光素酶， 而 pRL-TK 报告载体表达海肾荧光素酶报 告基因
高保真聚合酶 KOD plus Toyobo (Japan) 扩增猪肌抑素基因座位 5 ' 非 翻译区
Tag DNA聚合酶、 dNTP 上海申能博彩 鉴定阳性转化子
MSTN- 5F上游引物（5 ' →3' ) 上海英骏合成 TTCA ACGCGT
TCACGACAACGCCGGATCCTTAACCC
(Μΐυϊ) (序列 5 )
MSTN- 5R下游引物（5 →3' ) 上海英骏合成 CATG CTCGAG
CGCCAAGCAAAATTTTAATGCC
{Xhol) (序列 6 )
测序引物 GLprimer2 (5 →3 ' ) 上海英骏合成 CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCC XhoI、 /Ww/限制性内切酶 Takara (Japan) 酶切 DNA片段
DNA割胶回收试剂盒 北京天根 割胶回收 PCR产物 超纯质粒提取试剂盒 北京天根 制备无内毒素质粒 T4 DNA连接酶 Fermentas 载体与插入片段连接 SeaKem琼脂糖 美国 FMC 电泳检测与分析 溴化乙口定 (ethidium bromide) S igma 核酸染色
Tris饱和酚、 氯仿、 异戊醇、 无 国药集团（分析纯) 核酸提取
水乙醇、 醋酸钠
lkb DNA分子量标准 广州东盛 核酸片段大小识别 蛋白酶 K S igma 核酸提取过程中去除蛋 白质
核糖核酸酶 Rnase Amr sco 去除 RNA
氨苄抗生素 Amp Amr sco 转化与筛选
1 ) 猪基因组 DNA提取 取仔猪的离体猪耳肌肉组织样 0.1 克， 洗净， 剪碎， 提取猪基因组
2) 猪肌抑素基因座位 5' 非翻译区片段的 PCR扩增
以上述得到的基因组 匪 为模板， 带有预设酶切位点的特异引物 (MSTN-5F和 MSTN-5R) 扩增猪肌抑素基因座位 5' 非翻译区， 反应结束 后， 以 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物， 结果如图 1所示， M为 lkb DNA 分子量标准， 长度大小依次为 0.5kb， lkb, 1.5kb， 2kb， 3kb， 4kb， 5kb， 6kb， 8kb， 10kb， PCR扩增得到 3778bp片段。
将该 PCR产物送至华大基因测序， 测序引物为 Glprimer2， 结果为该 PCR产物具有序列表中序列 1所示的核苷酸， 将该 PCR产物命名为 DNA片 段 A， 即为猪肌抑素基因座位 5' 非翻译区序列。 根据真核生物基因转录 的普遍特征， 可知从该序列 5' 末端第 3646-3650位为 5' 端转录必需元 件 CAAT盒（5， 端 CAAT盒），从 5' 末端第 3687-3693位为上游转录必需元 件 TATA盒， 从 5' 末端第 3710-3716位为下游转录必需元件 TATA盒。
序列 1也可人工合成。
3) 猪肌抑素基因座位 5' 非翻译区的克隆与鉴定
将上述 2)得到的 PCR产物经 Mlu 和 ¾ 0 /酶切得到的片段与经过同样 酶切得到的报告载体 pGL3-basi C 片段以下述体系做连接， 将连接产物转 化大肠杆菌 DH5a， 37°C培养过夜， 得到转化子。 以 MSTN-5F和 MSTN-5R 引物对上述获得的转化子进行菌落 PCR鉴定， 能够得到 3778bp扩增产物 的重组子即为阳性质粒， 将阳性质粒送去测序， 结果为该质粒为将序列表 的序列 1插入 pGL3-baisc的 Mlul和 ¾ 0 /酶切位点得到的质粒， 将该质 粒命名为 pGL3-5' MSTN, 序列 1插入 pGL3-bais C 的萤火虫荧光素酶的上 游。
在所克隆的猪肌抑素基因座位 5' 非翻译区内部有一个天然的 Bglll 酶切位点， 而在基础载体 pGL3-basi C 的多克隆位点处有另外一个 Bglll 酶切位点。用限制性内切酶 Bglll单酶切 pGL3-5' MSTN，结果如图 2所示， "-" 表示未酶切的 pGL3-5' MSTN, " Bglll " 表示 Bgll 单酶切 PGL3-5' MSTNo可以看出， 经¾ 11酶切后， 该载体释放出 2.7kb的片段， 与理论分析完全吻合， 证明该载体含有猪肌抑素基因 5' 非翻译区序列。 2、 猪肌抑素基因座位 5 ' 非翻译区的转录活性鉴定
表 2实验材料
主要材料 来源 说明
Lipof ectamine2000 Invitrogen 细胞转染
小鼠成肌细胞 C2C12 ATCC 细胞系 肌肉细胞模型
编号为 CRL-1772
双荧光素酶试剂盒 Promega 用于报告基因酶活测:
DLR M Assay
超纯质粒提取试剂盒 北京天根 制备无内毒素质粒 用于细胞转染
Opt i -MEM Gibco 细胞转染辅助试剂
24孔细胞培养板 Corning 细胞培养
1 ) 、 细胞转染
转染前一天， 将 4 X 10 4 C2C12细胞铺到 24孔板中，隔夜生长后按照 表中所列体系配制转染复合物， 滴于 24孔板中， 补加 400μ1完全培养 基， 置于 37 °C，5% C0 2 的条件下培养。 在转染 48h 后收集细胞。 按照 Promega公司的 DLR M Assay试剂盒说明书进行荧光素酶活性测定。
转染体系如下：
表 3转染体系 o 质粒 用量 Opt i -MEM Lipof ectamine
2000
pGL3-basic lOOng ΙΟΟμΙ 0. 5μ1
PGL3 - promoter lOOng ΙΟΟμΙ 0. 5μ1
pGL3-5 ' MSTN lOOng ΙΟΟμΙ 0. 5μ1
pRL- TK (内对照） lOOng ΙΟΟμΙ 0. 5μ1
实验设置三个生物学重复， 结果取平均值， 结果如表 4和图 3所示。
表 4报告载体的酶活绝对值与相对比值
萤火虫荧 母 冃 火 ？ C
光素酶（Flue) 素酶（Rluc)
pGL3 - promoter 25823 208944 0. 1236 85796 402409 0. 2132
51815 383733 0. 135
1325 249998 0. 0053 pGL3-bas ic 956 246479 0. 0039
867 222630 0. 0039
8511 438967 0. 0194 pGL3-5 ' MSTN 12605 447943 0. 0281
9158 354874 0. 0258 如表 4及图 3所示， 本发明所克隆的猪肌抑素基因座位 5 ' 非翻译区 因含有真核生物转录所需的转录起始元件， 经荧光素酶报告基因测试， 证 明其确实具有一定的转录活性； 其活性相比于阳性对照质粒 pGL3-promoter的 SV40启动子较弱，但是相对于无启动子的阴性 照质粒 pGL3-bas ic , 其活性仍然较强。 *， p〈0. 05，差异显著。 这一方面说明本发 明得到的猪肌抑素基因座位 5 ' 非翻译区包含了猪肌抑素基因的启动子元 件， 另一方面也说明该非翻译区可作为基因打靶的 靶点， 用于失活猪肌抑 素基因的转录和表达； 再者， 该序列也可作为基因打靶的同源臂， 在发挥 同源重组作用的同时， 驱动外源基因的原位表达。 5 ' 非翻译区即为启动 子。
二、 猪肌抑素基因座位 3 ' 非翻译区的克隆及活性鉴定
1、 猪肌抑素基因座位 3 ' 非翻译区的克隆
表 5 实验材料
主要材料 来源 说明
MSTN-UTR-F上游引物（5， — 上海英骏合成 TTCA GTTAAC
3 ' ) GGTTCATTACTTCCTAAAACATGG
(Npal)
MSTN- UTR- R下游引物（5， — 上海英骏合成 CATG GTCGAC
3 ' ) GTTTCTACACATTAGATGTAAG
(Sail)
测序引物 UTR-S 上海英骏合成 GGAAAGATCGCCGTGTAAT
Hpal、 限制性内切酶 Takara (Japan) 酶切 DNA片段
1 ) 猪基因组 DNA提取 提取仔猪的离体猪耳肌肉组织的基因组 DNA。
2) 猪肌抑素基因座位 3' 非翻译区片段的 PCR扩增
以上述得到的基因组 匪 为模板， 带有预设酶切位点的特异引物 (MSTN-UTR-F和 MSTN-UTR-R)扩增猪肌抑素基因座位 3' 非翻译区， 反应 结束后，以 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物，结果如图 4所示， M为 lkb DNA 分子量标准， 长度大小依次为 0.5kb， lkb， 1.5kb， 2kb， 3kb， 4kb， 5kb， 6kb， 8kb， 10kb， PCR扩增得到 1446bp片段。
将该 PCR产物送至华大基因测序， 测序引物为 UTR-S, 结果为该 PCR 产物具有序列表中序列 3所示的核苷酸， 将该 PCR产物命名薩片段 C， 即为猪肌抑素基因座位 3' 非翻译区序列。 根据真核生物基因转录终止的 普遍特征， 可知从该序列 5' 末端第 183-188 位、 597-602、 921-926、 1282-1287为猪肌抑素基因信使 mRNA多聚腺苷化所必需的 AATAAA信号序 列。
序列 3也可人工合成。
3) 猪肌抑素基因座位 3' 非翻译区的克隆与鉴定
将上述 2)得到的 PCR产物经 Hpal和 Sail酶切得到的片段与经过同样 酶切得到的报告载体 pGL3-p r0 mot er 片段以下述体系做连接， 将连接产物 转化大肠杆菌 DH5 d， 37°C培养过夜， 得到转化子。 以 MSTN-UTR-F 和 MSTN-UTR-R引物对上述获得的转化子进行菌落 PCR鉴定，能够得到 1446bp 扩增产物的重组子即为阳性质粒， 将阳性质粒送去测序， 结果为该质粒为 将序列表中的序列 3插入 pGL3-prom 0 ter的 Hpal和 S a R酶切位点间得到 的质粒， 将该质粒命名为 pGL3-3' MSTN, 序列 3插入 pGL3-promoter的萤 火虫荧光素酶的下游。
在所克隆的猪肌抑素基因座位 3' 非翻译区内部有一个天然的 酶 切位点， 而在基础载体 pGL3-pr 0 m 0 ter的海肾荧光素酶基因末端有另外一 个 /^I酶切位点。用限制性内切酶 /^I单酶切 pGL3-3' MSTN， 结果如图 5所示， "- " 为质粒， " ¾al" 为酶切后的质粒， 可以看出， 经 /^I酶 切后， pGL3-3' MSTN释放出 0.75kb的片段， 与理论分析完全吻合， 证明 该载体含有猪肌抑素基因 3' 非翻译区序列。
2、 猪肌抑素基因座位 3' 非翻译区的转录活性鉴定 1 ) 、 细胞转染
转染前一天， 将 4 X 10 4 C2C12细胞铺到 24孔板中，隔夜生长后按照 表中所列体系配制转染复合物， 滴于 24孔板中， 补加 400μ1完全培养 基， 置于 37 °C，5% C0 2 的条件下培养。 在转染 48h 后收集细胞。 按照 Promega公司的 DLRM Assay试剂盒说明书进行荧光素酶活性测定。
转染体系同上述表 3， 实验设置三个生物学重复， 结果取平均值， 如 表 6和图 6所示。
表 6报告载体的酶活绝对值与相对比值
如表 6及图 6所示， 本发明所克隆的猪肌抑素基因座位 3 ' 非翻译区 因含有真核生物转录所需的转录终止元件， 经荧光素酶报告基因测试， 证 明其确实具有一定的转录终止活性。 *， p〈0. 05，差异显著。 这一方面说明 本发明得到的猪肌抑素基因座位 3 ' 非翻译区包含了猪肌抑素基因的终止 元件， 另一方面也说明该非翻译区可作为基因打靶的 靶点， 用于失活猪肌 抑素基因的转录和表达； 再者， 该序列也可作为基因打靶的同源臂， 在发 挥同源重组作用的同时， 用于终止外源基因的转录和促进翻译。 3 ' 非翻 译区即为终止子。
实施例 2、 猪肌抑素基因座位全序列的获得及其功能研究
一、 猪肌抑素基因座位全序列的获得
1、 实验材料
表 7 实验材料 —— —— j —— PUC19克隆载体 购自 Takara 原核表达载体， 常用于基因克
PIRES2-EGFP 购自 Invitroge 绿色荧光蛋白 EGFP表达载体 高保真聚合酶醫 plus Toyobo (Japan) 扩增猪肌抑素基因座位的 DNA 片段
Tag DNA聚合酶、 dNTP 上海申能博彩 鉴定阳性转化子
5' 非翻译区上游引物 上海英骏合成 ATCGGTACCATCATTAAACTTCTGAC MSTN- 5' F(5' →3' ) AAGCC (Kpnl)
5' 非翻译区下游引物 上海英骏合成 ATCGGATCCGCCAAGCAAAATTTTAA MSTN- 5' R(5' →3' ) TGCC (Bam Hi)
3' 非翻译区上游引物 上海英骏合成 ATCGTCGACGGTTCATTACTTCCTAA MSTN- 3' F(5' →3' ) AACATGG(^il)
3' 非翻译区下游引物 上海英骏合成 ATCAAGCTTGTTTCTACACATTAGAT MSTN- 3' R(5' →3' ) GTAAG (：〃floTII)
猪肌抑素基因上游引物 上海英骏合成 ATCGGATCCTTACTCAAAAGCAAAAG MSTN-F(5， →3' ) TAAAAGGA(fe慮） 猪肌抑素基因下游引物 上海英骏合成 ATCAAGCTTAAATATAAATCTCATGA MSTN-R(5， →3' ) GCACCC(^il)
绿色荧光蛋白上游引物 上海英骏合成 ATCGGATCCACCATGGTGAGCAA (Ba EGFP-F(5， →3， ) mHl)
绿色荧光蛋白下游引物 上海英骏合成 ATCGTCGACTTACTTGTACAGCT (Sa EGFP-R(5， →3， ) ID
测序引物 MSTN-S1(5， — 上海英骏合成 CATTGTGGAGCAAGAGCC
3' )
测序引物 MSTN-S2(5， — 上海英骏合成 CTGTAGCATACTCCAGGCA
3' )
BamHI、 Kpnl、 Pstl、 Hindi II, Takara (Japan) 酶切 DNA片段
限制性内切酶 DL2000 DNA分子量标准 Takara 核酸片段大小识别
lkb DNA分子量标准 广州东盛 核酸片段大小识别
Lamda DNA/Eco91I分子量标 Fermentas 核酸片段大小识别
准
lkb plus DNA分子量标准 Invitrogen 核酸片段大小识别
2、 实验方法
1)猪肌抑素基因座位 5' 非翻译区、 猪肌抑素基因、 猪肌抑素基因座 位 3' 非翻译区的获得
提取仔猪的离体猪耳肌肉组织样的基因组 DNA; 以上述得到的基因组 DNA为模板， 用 MSTN-F和 MSTN-R为引物进行 PCR扩增， 结果如图 7所示， 得到 5kb的 PCR产物为 DNA片段 B， 经过测序， 其核苷酸序列为序列 2， 与理论分析相符， 证明本发明获得了猪肌抑素基因 MSTN的编码区全序列。
提取仔猪的离体猪耳肌肉组织样的基因组 DNA; 以上述得到的基因组 DNA为模板， 用 MSTN- 5' F禾卩 MSTN- 5' R为引物进行 PCR扩增， 得到 PCR 产物为 DNA片段 A，即为猪肌抑素基因座位 5' 非翻译区（序列 1，启动子）； 以上述得到的基因组 DNA为模板，用 MSTN-3' F和 MSTN-3' R为引物 进行 PCR扩增， 得到 PCR产物为 DNA片段 C， 即为猪肌抑素基因座位 3' 非翻译区 （序列 3， 终止子） 。
2) 将 3' 非翻译区插入 pUC19载体
将上述 1 ) 得到的 3， 非翻译区 DNA片段 C经 Pstl和 Hindill酶切， 与经相同酶切 PUC19载体连接， 将连接产物转化大肠杆菌 DH5 α， 37°C培 养过夜， 得到转化子。 以 MSTN-3' F和 MSTN-3' R引物对上述获得的转化 子进行菌落 PCR鉴定， 能够得到 1446bp扩增产物的重组子即为阳性质粒， 将阳性质粒用 ¾ l与 双酶切， 结果如图 8所示， 其中 " + " 为酶 切后质粒， "-" 为质粒， 可以看出得到 1446bp， 与理论分析相符。 M 为 Lamda DNA/Eco91I分子量标准， 片段长度从小到大依次为 702bp， 1264bp， 1371bp， 1929bp， 2323bp， 3675bp， 4324bp， 4822bp， 6369bp， 7242bp, 14140bp。 经过测序， 该质粒为将序列表中的序列 3插入将 pUC19的 ¾ l 和 Hindil 位点得到的载体， 该质粒命名为 pUC19-3。
3) 将 5' 非翻译区插入 pUC19-3载体 将上述 1 ) 得到的 5， 非翻译区 DNA片段 A经 Kpnl和 BamHi酶切， 与 经相同酶切的步骤 2) 得到的 PUC19-3载体连接， 将连接产物转化大肠杆 菌 DH5a， 37°C培养过夜， 得到转化子。 以 MSTN- 5， F禾 D MSTN- 5， R引物 对上述获得的转化子进行菌落 PCR鉴定， 能够得到 3778bp扩增产物的重 组子即为阳性质粒。将阳性质粒用 BamHY与 Kpnl双酶切， 释放出 3778bp， 结果如图 9所示， 其中 " + " 为酶切后质粒， "- " 为质粒， 与理论分析相 符。 将该质粒命名为 pUC19-53。 M为 lkb DNA分子量标准， 长度大小依次 为 0.5kb， lkb, 1· 5kb， 2kb， 3kb， 4kb， 5kb， 6kb， 8kb， 10kb。
4) 猪肌抑素基因表达框克隆进 PUC19-53载体
将上述 1) 得到的猪肌抑素基表达框 PCR产物 （DNA片段 B) 经 BamHV 和 ¾ l酶切， 与经过同样酶切的 PUC19-53载体片段连接， 将连接产物转 化大肠杆菌 DH5 α， 37°C培养过夜， 得到转化子。 以 MSTN-F和 MSTN-R引 物对上述获得的转化子进行菌落 PCR鉴定， 能够得到 5Kb扩增产物的重组 子即为阳性质粒。 将该质粒用 BainHi和 Pstl双酶切， 载体释放出 5kb的 片段， 结果如图 10 所示， 其中 "+ " 为酶切后质粒， "-" 为质粒， 与理 论分析相符，命名为 pUC19-5MSTN3。将该质粒测序发现，其含有依次由 5' 非翻译区 DNA片段 A (序列 1) 、 猪肌抑素基因 DNA片段 B (序列 2) 、 3' 非翻译区 DNA片段 C (序列 3) 组成的 DNA分子， 即为猪肌抑素基因座位， 且该 DNA分子插入 pUC19的 Kpn 和 Hindill酶切位点间。
该猪肌抑素基因座位示意图为图 11。可以看出， 猪肌抑素基因座位包 含三个部分： 5' 非翻译区， 肌抑素基因编码区， 3' 非翻译区。 本发明确 定猪肌抑素基因座位 5' 非翻译区的长度为 3776bp， 该序列包含了猪肌抑 素基因的所有转录起始元件， 如 TATA 盒（2 个）与 CAAT 盒（1 个）， 以及 MEF (myocyte enhancer factor, 肌肉细胞增强因子）结合序列等。 肌抑素 基因编码区包含三个外显子和两个内含子， 全长 3789bp。 外显子长度分别 为 373bp、 374bp和 381bp; 内含子长度分别为 1809bp和 1980bp。 本发明 确定 3' 非翻译区的长度为 1446bp， 该序列包含了肌抑素信使 RNA (messenger RNA， mRNA)翻译所必需的多聚腺苷化信号（polyA signal)。
也可人工合成该基因座。
二、 利用猪肌抑素基因座位离体表达外源基因 1、 报告载体 PUC19-5EGFP3的获得
1 ) 绿色荧光蛋白表达框的获得
以 pIRES2- EGFP为模板， 用 EGFP- F和 EGFP- R为引物， 进行 PCR， 得 到 PCR产物经过测序， 以 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物， 结果如图 12 所示， M为 DL2000 DNA分子量标准，长度大小依次为 0. lkb，0. 25kb，0. 5kb， 0. 75kb， lkb， 2kb。 PCR扩增得到绿色荧光蛋白 720bp的片段， 经测序， 其核苷酸序列为序列 4 (绿色荧光蛋白表达框） ， 其氨基酸序列为序列 5。
2 ) pUC19-5EGFP3的获得
将上述 1 ) 得到的绿色荧光蛋白表达框 （序列 4 ) 经 BamHi和 Sail酶 切， 与经过同样酶切的由上述一得到的 pUC19-5MSTN3 载体片段连接， 将 连接产物转化大肠杆菌 DH5 a， 37 °C培养过夜， 得到转化子。 以 EGFP-F和 EGFP-R引物对上述获得的转化子进行菌落 PCR鉴定，能够得到 720bp扩增 产物的重组子即为阳性质粒， 将该阳性质粒利用 femHI与 Sail双酶切， 结果如图 13 所示， 其中 " + " 为酶切后质粒， " -" 为质粒， 可以看出， 酶切后该载体释放出 720bp的片段， 与理论分析相符。 M为 lkb plus DNA 分子量标准，各条片段的长度分别为 100bp， 200bp， 300bp， 400bp， 500bp， 650bp， 850bp， lOOObp, 1650bp， 2000bp, 3000bp, 4000bp , 5000bp, 6000bp, 7000bp, 8000bp， 9000bp， l OOOObp , 12000bp。 再将该阳性质粒送去测序， 该质粒为将序列表中的序列 4插入 pUC19-5MSTN3的 BanM和 S a ll酶切位 点得到的质粒， 且替换掉 MSTN (序列 2 )， 将该质粒命名为 pUC19-5EGFP3， 即为将启动子、 绿色荧光蛋白表达框和终止子插入 PUC19 的 Kpnl 和 Hindi l l酶切位点间。
2、 报告载体 PUC19-5EGFP3的表达检测
转染前一天， 将 4 X 10 4 C2C12细胞铺到 24孔板中，隔夜生长后按照 表中所列体系配制转染复合物， 滴于 24孔板中， 补加 400μ1完全培养 基， 置于 37 °C，5% C0 2 的条件下培养。 24小时后用德国 Le ika显微镜 观察绿色荧光蛋白的表达情况。
转染体系如下：
表 8转染体系
用 Opt i— MEM Lipofectamine2000 PIRES2-EGFP (阳性对照） lOOng Ιθθμΐ 0. 5μ1
pUC19-5MSTN3 ( 阴性对照) lOOng Ιθθμΐ 0. 5μ1
PUC19-5EGFP3 lOOng Ιθθμΐ 0. 5μ1
结果如图 14所示， 可以看出， 阳性对照 pIRES2-EGFP表达较强的绿 色荧光蛋白， 阴性对照 PUC19-5MSTN3不表达绿色荧光蛋白， pUC19_5EGFP3 转染肌肉细胞后， 能够观察到该载体表达较强的绿色荧光蛋白。
米用 Image J (http： / / rsbweb. nih. gov/ i j/ download, html)软件分析 上述图 14 中 pIRES2-EGFP (阳性对照） 、 pUC19- 5MSTN3 ( 阴性对照）和 PUC19-5EGFP3的荧光强度， 结果如图 15所示 （以 pUC19-5MSTN3 ( 阴性对 照）为基础） ， 说明本发明提供的猪肌抑素基因座位在离体实 验条件下能 够表达外源基因。
工业应用
本发明提供了猪肌抑素基因座位， 包含了肌抑素基因编码区上游
3778bp的 5 ' 非翻译区、 4916bp的编码区和下游 1446bp的 3 ' 非翻译区。 通 过荧光素酶报告基因测试证明， 猪肌抑素基因座位 5 ' 非翻译区具有起始 转录的活性， 3 ' 非翻译区具有终止转录的活性， 二者与肌抑素基因编码 区构成一个完整的表达单元， 即基因座位。 同时， 本发明以该基因座位为 基础构建了绿色荧光蛋白报告载体， 证明在离体实验条件下， 该基因座位 能够有效启动外源基因的表达。 该基因座位具有如下用途： （1)将外源基 因插入到该基因座位肌抑素基因编码区， 利用 5 ' 非翻译区和 3 ' 非翻译区 调控其表达， 构成相应的重组质粒、 重组菌、 转基因细胞系或是转基因动 物； （2)以 5 ' 非翻译区或 3 ' 非翻译区为打靶位点失活肌抑素， 或是失活 肌抑素的同时插入外源基因， 构成相应的重组质粒、 重组菌、 转基因细胞 系或是转基因动物； （3)以 5 ' 非翻译区、 编码区、 3 ' 非翻译区的任意二 者的部分或全部序列为打靶位点， 失活肌抑素， 或是失活肌抑素的同时转 入外源基因， 构成相应的重组质粒、 重组菌、 转基因细胞系或是转基因动 物； （4)以整个猪肌抑素基因座位为打靶位点， 失活肌抑素， 或是失活肌 抑素的同时转入外源基因， 构成相应的重组质粒、 重组菌、 转基因细胞系 或是转基因动物。 本发明为解决转基因猪外源基因表达不稳定性 以及位置 效应的不可预知性等问题， 提供了可靠、 有价值的基因资源。