La présente invention a pour objet des oligomannosides de synthèse, leur préparation et leur utilisation à la détection d'anticorps et à la prévention d'infections.

Chez la levure opportuniste Candida albicans, comme chez tous les champignons, une partie considérable du métabolisme est dérivée vers la synthèse des polysaccharides pariétaux dont l'organisation module finement l'adaptation de la cellule au milieu. De nombreux groupes ont établi l'importance prépondérante du mannane de C. albicans dans la physiopathologie des candidoses. Il a ainsi été montré que les diverses interactions du mannane avec les composants humoraux et cellulaires de l'hôte reposent sur une spécificité dépendante des séquences oligomannosidiques synthétisées par la levure. C'est l'anomérie de liaison des résidus mannose et la longueur de la chaîne oligomannosidique qui détermine la nature de l'interaction qui conditionne l'issue de l'infection. Les travaux de recherche concernant les propriétés biologiques et la structure de ces oligomannosides, de mme que bien entendu la mise au point de méthode diagnostic ou de prévention de ces infections, nécessitent de disposer de quantités importantes d'oligomannosides. Or, la production d'oligomannosides naturels à partir de souches de C. albicans est compliquée et coûteuse. Il s'agit bien entendu de disposer des souches et de les conserver, de les cultiver en fermenteur dans des conditions très standardisées car la nature des sucres dépend étroitement du milieu, de la température, de l'oxygénation, du temps de culture, etc.... La culture en fermenteur de C. albicans nécessite une grande expertise et de nombreuses précautions

d'ordre microbiologique. Les lots de mannane doivent tre ensuite récupérés de la culture et caractérisés pour leur propriétés antigéniques mais surtout chimiquement. Celle-ci nécessite une dépolymérisation du mannane et l'analyse en RMN des sucres libérés.

Ces oligomannosides naturels sont bien entendu utilisés pour la préparation de tests de diagnostic immunologique des infections par C. albicans. Or, la sensibilisation des plaques avec l'antigène mannane s'effectue avec des lots de production différents et selon un protocole qui ne permet aucun contrôle de la quantitée déposée. Ainsi, plusieurs tests utilisent des mannanes naturels de levures pour le diagnostic des candidoses (Sendid, B. et al., 1999, J. Clin. Microbiol. 37 (5) : 1510-7) et de la maladie de Crohn (Sendid, B. et al., 1996, Clin.

Diagn. Lab. Immunol. 3 (2) : 219 : 26). Ces tests détectent des anticorps dirigés contre les mélanges de séquences oligomannosidiques présentes dans les mannanes de C. albicans et de S. cerevisiae.

Afin de palier les inconvénients indiqués ci- dessus, les Inventeurs sont maintenant parvenus à produire par synthèse chimique en grande quantité et de manière reproductible des analogues des oligomannosides des enveloppes cellulaires des levures, ci-après désignés oligomannosides de synthèse, permettant de remplacer avantageusement les mannanes naturels. En effet, les travaux de recherche réalisés avec ces oligomannosides de synthèse ont montré qu'ils miment les propriétés biologiques des sucres naturels de C. albicans notamment en ce qui concerne l'antigénicité et l'adhérence aux cellules et molécules de mammifère et la stimulation cellulaire.

Ainsi, les Inventeurs ont mis en évidence que des oligomannosides de synthèse pouvaient tre utilisés avec succès pour la sensibilisation de plaques de microtitration

par couplage covalent en vue de la détection d'anticorps spécifiques de chaque structure dont la signification diagnostique et pronostique est différente (Jouault, T., 1997, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 4 (3) : 328-33).

En outre, les inventeurs ont mis en évidence que ces oligomannosides de synthèse présentaient des propriétés remarquables d'inhibition de la colonisation par C. albicans permettant de les utiliser pour la prévention et le traitement des candidoses.

La présente invention a donc pour objet un oligomannoside produit par synthèse chimique homologue à un oligomannoside de la paroi d'un organisme infectieux ou pathogène. Plus particulièrement ledit organisme est une levure, un champignon, un virus, une bactérie dont l'enveloppe cellulaire contient des oligomannosides. Par enveloppe cellulaire, on entend aussi bien la membrane, la paroi, la capsule cellulaire. L'invention concerne tout particulièrement les levures, et spécifiquement de Candida albicans ou Saccharomyces cerevisiae.

On entend par homologue, le fait que les oligomannosides de synthèse de l'invention présentent les mmes motifs de mannose selon le mme enchaînement de liaisons a ou , (1-2), (1-3), (1-6), que les oligomannosides naturels des levures, notamment de Candida albicans ou de Saccharomyces cerevisiae, mais sont dépourvus des autres composants cellulaires, notamment les protéines, les sucres, les lipides, qui sont inévitablement associés aux oligomannosides naturels décrits dans l'art antérieur.

On entend par dérivé d'un oligomannoside de synthèse de l'invention, un oligomannoside dans lequel un ou plusieurs des groupements fonctionnels sont substitués, par exemple par un groupe protecteur, ou encore des oligomannosides de synthèse conjugués à un groupement de

liaison, aussi désigné connecteur, pour le greffage sur un support comme une plaque de microtitration.

L'invention se rapporte plus particulièrement à des oligommanosides de synthèse répondant à la formule générale suivante : [Mana (1-3)] p [Mana (1-2)] q [Man (3 (1-2)] r (a ou P) Man-OR dans laquelle : -R représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C1 à C20, et de préférence en C15 à C20, un groupe connecteur, éventuellement marqué par exemple par un groupe chromophore ou fluorescent, ou encore, comme il sera décrit plus loin une substance capable de rendre l'oligommanoside de synthèse immunogène, -p, q, et r sont des nombres entiers entre 0 et 19 et de préférence entre 0 et 11 et la somme de p+q+r est comprise entre 1 et 19 et de préférence entre 1 et 11, -les trois parties du polymère [Mana (1- 3)] p [Mana (1-2)] q [Manp (1-2)] r peuvent tre inversées ou répétées.

Parmi les oligomannosides de synthèse ci- dessus, l'invention se rapporte plus particulièrement aux tétramannosides, et de manière toute spécifique aux tétramannosides de synthèse suivants : # D-Man ß (1-2) D-Man ß (1-2) D-Man p (1-2) D-Man, de C. albicans, également désigné ci-après M (3-1-2- tétramannosides, répondant à la formule (I) suivante :

dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un alkyle en C1 à C20, et de préférence en C15 à C20, ou un groupe connecteur, éventuellement marqué, ou encore une substance capable de rendre l'oligomannoside immunogène, ou un dérivé de celui-ci dont un ou plusieurs des groupes hydroxyles sont substitués.

D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) D-Man, de C. albicans, également désigné ci-après Mα-1-2- tétramannosides, répondant à la formule (II) suivante : dans laquelle R à la mme signification que dans la formule (I).

* D-Man a (l-3) D-Man a (l-2) D-Man a (l-2) D-Man a (1-2) de S. cerevisiae, répondant à la formule (III) suivante :

dans laquelle R à la mme signification que dans la formule (I).

La présence d'un groupe R représentant un connecteur est utile pour la préparation de tests de détection de la présence chez un sujet d'anticorps spécifiques de certains oligomannosides pour le diagnostic d'une infection par C. albicans ou de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin et notamment de la maladie de Crohn comme il sera décrit plus loin.

Le connecteur peut tre tout groupe chimique permettant de coupler, de préférence par covalence mais aussi par d'autres liaisons par exemple de type hydrophobe, les oligomannosides de synthèse sur un support comme une plaque de microtitration. Le couplage covalent offre l'avantage d'utiliser une surface robuste et adaptée au test d'immunoanalyse, il permet une meilleure orientation des oligomannosides de synthèse et aussi de disposer d'une densité plus élevée d'épitopes et évite les problèmes de

reconnaissance de l'anticorps car les sites antigéniques sont bien accessibles.

On préfère des connecteurs comportant une fonction acide carboxylique qui pourra tre activée pour le couplage sur une surface elle-mme activée pour réagir avec les oligomannosides de synthèse. A titre d'exemple de connecteur, on peut citer le connecteur de R. U. Lemieux (Lemieux, R. U. et al., 1975, J. Am. Chem. Soc. 97, 4076- 4083), où R représente un groupe de formule : -CH2- (CH2) 7-C°2H.

Les connecteurs portant un groupe acide carboxylique, comme le connecteur de R. U. Lemieux peuvent tre activés par un carbodiimide afin d'obtenir un ester activé qui permet la formation de liaisons amides avec des groupes amines primaires à la surface du support. La carbodiimide hydro-soluble (EDC : 1-ethyl-3- (3-dimethyl- aminopropyl) carbodiimide) est utilisée pour activer les groupements-COOH de l'oligomannoside de synthèse en présence de sulfo-N-hydroxy succinimide (sulfo-NHS : N- hydroxysuccinimidine). Le sulfo-NHS supprime de manière efficace l'hydrolyse du produit activé et permet la fixation de l'oligomannoside de synthèse à la surface de la plaque déjà sensibilisée par le groupement-NH2.

Les oligomannosides de synthèse de l'invention peuvent tre préparés par condensation de monosaccharides ou disaccharides protégés, de préférence, par condensation de dimannosides protégés selon une stratégie par dibloc.

Une forme de mise en oeuvre préférée d'une stratégie dibloc pour la préparation d'oligomannosides selon l'invention consiste à : a) préparer des diblocs dont : -l'un au moins des deux blocs est le bloc intermédiaire, où les fonctions hydroxyles libres de chaque monosaccharide sont substituées par un ou plusieurs groupes

protecteurs identiques ou différents, sauf celle nécessaire à la condensation avec un autre dibloc qui est activée par un groupe partant, -l'un des deux blocs est le bloc terminal, où les fonctions hydroxyles libres de chaque monosaccharide sont substituées par un ou plusieurs groupes protecteurs identiques ou différents, sauf celle nécessaire à la condensation avec un autre dibloc, et éventuellement celle substituée par un groupe de liaison pour la fixation de l'oligomannoside sur un support, b) à condenser lesdits diblocs, puis à déproteger l'oligomannoside ainsi préparé.

Un exemple de dimannosides Mana (1-2) Man pour la mise en oeuvre du procédé ci-dessus répond à la formule (IV) suivante : dans laquelle : -R est un groupe protecteur permanent. On entend par groupe protecteur permanent, un groupe protecteur qui est introduit en début de synthèse et retirer à la fin de la synthèse de l'oligomannoside. A titre d'exemple d'un tel groupe protecteur permanent, on peut citer un groupe benzyle.

-Rl est un groupe protecteur temporaire. On entend par groupe protecteur temporaire, un groupe protecteur qui est enlevé pour permettre la condensation.

A titre d'exemple d'un tel groupe protecteur temporaire, on peut citer le groupe acétate.

-R2 est : . dans le cas d'un bloc intermédiaire, un groupe partant et dans ce cas le bloc peut tre associé au reste du polymère en a ou P ; à titre d'exemple d'un tel groupe partant, on peut citer-0-C (NH)-CCl3 ou PhS, . dans le cas d'un bloc terminal, un groupe choisi parmi un groupe alkyle, benzyle, ou encore un connecteur, en a ou P.

Un exemple de dimannosides Man (1-2) Man pour la mise en oeuvre du procédé ci-dessus répond à la formule (V) suivante : dans laquelle : -R1 est un groupe protecteur temporaire ; à titre d'exemple d'un tel groupe protecteur temporaire, on peut citer un groupe terbutyl diméthyl silyl -R2 est : . dans le cas d'un bloc intermédiaire, un groupe partant et dans ce cas le bloc peut tre associé au reste du polymère en a ou ß ; à titre d'exemple d'un tel groupe partant, on peut citer SPh ou SOPh ; . dans le cas d'un bloc terminal, un groupe choisi parmi un groupe alkyle, benzyle, ou encore un connecteur, en a ou ß.

Un exemple de dimannosides Mana (1-3) Man pour la mise en oeuvre du procédé ci-dessus répond à la formule (VI) suivante :

dans laquelle : -R est un groupe protecteur permanent ; à titre d'exemple d'un tel groupe protecteur permanent, on peut citer le groupe benzyle, -R1 est un groupe protecteur temporaire ; à titre d'exemple d'un tel groupe protecteur, on peut citer le groupe acétate, -R2 est : . dans le cas d'un bloc intermédiaire, un groupe partant et dans ce cas le bloc peut tre associé au reste du polymère en a ; à titre d'exemple d'un tel groupe partant, on peut citer un groupe thiophényle (SPh), . dans le cas d'un bloc terminal, un groupe choisi parmi un groupe alkyle, benzyle, ou encore un connecteur, en a ou P.

Les dimannosides ci-dessus peuvent tre utilisés pour la préparation de tetramannosides de l'invention.

Le tétramanoside D-Man ß (1-2) D-Man ß (1-2) D- Man ß (1-2) D-Man de formule (I), peut tre préparé à partir de deux blocs Man (3 (1-2) de formule (V), dont l'un est un dibloc intermédiaire dans lequel R2 est un groupe partant, par exemple R2 =-SOPh, formant une liaison P, et l'autre un dibloc terminal dans lequel R2 par exemple un SPh.

Le tétramanoside D-Mana (1-2) D-Mana (1-2) D- Mana (1-2) D-Man, de formule (II) peut tre préparé à partir de blocs Mana (1-2) Man de formule (IV), dont l'un est un

dibloc intermédiaire dans lequel R2 est un groupe partant, par exemple R2 représente un groupe-C (NH)-CC13, et l'autre un dibloc terminal dans lequel R2 est-SPh.

Le tétramanoside D-Mana (1-3) D-Mana (1-2) D- Mana (1-2) D-Mana (1-2), de formule (III) peut tre préparé à partir d'un dibloc Mana (1-3) Man de formule (VI) et d'un dibloc Mana (1-2) Man de formule (IV), le dibloc intermédiaire est Mana (1-3) Man de formule (VI) dans lequel R2 est un groupe partant, par exemple R2 est-SPh, et le dibloc terminal est Mana (1-2) Man dans lequel R2 représente le groupe R défini dans la formule (III).

Comme indiqué précédemment, les oligomannosides de synthèse de l'invention sont utiles pour la détection in vitro sur un échantillon d'un patient de la présence d'une infection par un organisme infectieux ou pathogène, notamment une levure, un champignon, un virus, une bactérie dont l'enveloppe cellulaire contient des oligomannosides.

Un tel procédé consiste à mettre en contact au moins un oligomannoside de synthèse défini précédemment avantageusement préalablement fixé sur un support solide avec un échantillon biologique susceptible de contenir des anticorps dirigés contre l'organisme infectieux ou pathogène, puis la détection par tout moyen approprié d'un complexe antigène-anticorps. L'invention concerne plus particulièrement le diagnostic d'une infection par C. albicans et S. cerevisiae, ou dans le cas de la maladie de Crohn, la révélation d'anticorps anti-S. cerevisiae.

Ainsi, les inventeurs ont mis en évidence que les tetramannosides D-Manß (1-2) D-Manß (1-2) D-Manß (1-2) D-Man de formule (I) et D-Mana (1-2) D-Man a (1-2) D-Mana (1-2) D-Man, de formule (II) permettent une détection spécifique d'une infection par C. albicans, donc le diagnostic des candidoses.

De mme, les inventeurs ont mis en évidence que le tetramannoside D-Man a (1-3) D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) de formule (III) permet une détection spécifique d'anticorps anti-S. cerevisiae et peut avantageusement mis en oeuvre dans des tests ASCA pour le diagnostic de la maladie de Crohn.

Les inventeurs ont encore montré que de façon surprenante le tetramannoside D-Man (X (1-3) D-Man oc (1-2) D- Man a (1-2) D-Man a (1-2) de formule (III) pouvait tre utilisé dans le cadre des tests ASCA pour le diagnostic ou la prédiction des hépatites virales, de maladies autoimmunes ou encore de maladies inflammatoires.

L'invention a donc pour objet un procédé de détection d'anticorps anti-oligomannoside pour le diagnostic ou la prédiction d'une pathologie infectieuse et/ou inflammatoire, caractérisé en ce que l'on met en contact au moins un oligomannoside de synthèse décrit précédemment avec un échantillon biologique.

Plus particulièrement, l'invention se rapporte à un procédé de détection d'anticorps anti-S. cerevisiae pour le diagnostic de la maladie de Crohn ou d'une hépatite virale caractérisé en ce que l'on met en contact au moins un oligomannoside de synthèse décrit précédemment avec un échantillon biologique.

Avantageusement, l'oligomannoside de synthèse est le tetramannoside D-Man a (1-3) D-Man a (1-2) D-Man a (1- 2) D-Man a (1-2) de formule (III).

L'invention concerne encore un kit pour le diagnostic sur un échantillon biologique d'un patient d'une infection par un organisme infectieux ou pathogène, notamment une levure, un champignon, un virus, une bactérie dont l'enveloppe cellulaire contient des oligomannosides. Un tel kit comprend au moins un oligomannoside de synthèse défini précédemment, avantageusement fixé sur un support

solide, comme une plaque ELISA, des moyens pour détecter la formation de complexes antigène-anticorps, et éventuellement des réactif témoins.

Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention ont permis de découvrir que les oligomannosides de synthèse définis précédemment peuvent tre utilisés pour inhiber la colonisation par les agents infectieux ou pathogènes dont les membranes contiennent des oligomannosides. En effet, les levures du genre Candida utilisent des sucres de surface de leur paroi pour s'attacher aux cellules de leur hôte, cellules du vagin ou du tube digestif. Ainsi, les inventeurs sont parvenus à mettre en évidence que les sucres notamment de levures protègent des infections notamment celles déterminées par C. albicans, voire d'autres microbes exprimant les mmes sucres par exemple LPS des Salmonella, E. Coli) Plus particulièrement, les inventeurs ont montré, dans un modèle de candidose vaginale que le tetramannoside D-Manp (1-2) D-Man (1-2) D-Man (1-2) D-Man de formule (I) réduisait la colonisation par C. albicans de manière très significative. De mme le tetramannoside D- Manp (1-2) D-Man (1-2) D-Man (1-2) D-Man de formule (I) s'est avéré très protecteur dans des modèles expérimentaux de colonisation digestive par C. albicans.

En conséquence, l'invention concerne les applications thérapeutiques des oligomannosides de synthèse décrits précédemment ou des conjugués formés d'un oligomannoside de synthèse couplé à une substance capable de rendre les sucres immunogènes, comme par exemple l'anatoxine tétanique, ainsi que les anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés spécifiquement contre lesdits conjugués. Ces anticorps sont utiles comme outils de recherche mais aussi pour la mise au point d'outil de diagnostic.

Ainsi, l'invention concerne aussi les compositions pharmaceutiques comprenant à titre d'agent actif au moins un oligomannoside de synthèse défini précédemment, conjugué ou non, associé dans la composition à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions pharmaceutiques peuvent tre appliquées localement ou généralement de façon à induire une inhibition de la colonisation ou une protection par immunisation locale ou générale selon le type d'infection observée.

L'invention envisage plus spécifiquement les conjugués formés à partir de D-Manp (1-2) D-Man (1-2) D- Man (3 (1-2) D-Man.

Ainsi, de façon surprenante, les inventeurs ont mis en évidence les propriétés inhibitrices des oligomannosides non conjugués, notamment dans les cas de colonisations intestinales par C. albicans et dans les cas candidoses vaginales.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent concernant la préparation d'oligomannosides de l'invention et leur utilisation pour le diagnostic, la prévention et le traitement d'infections, et où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : La figure 1 représente le schéma réactionnel de la préparation de D-Man ß (1-2) D-Man ß (1-2) D-Man P (1-2) D- Man de formule (I).

La figure 2 représente le schéma réactionnel de la préparation de D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) D-Man de formule (II).

La figure 3 représente le schéma réactionnel de la préparation de D-Man a (1-3) D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) de formule (III).

La figure 4 représente le schéma réactionnel de la préparation de dimannosides Man (1-2) Man.

Les figures 5 et 6 rapportent les tests effectués respectivement avec le D-Man (X (1-2) D-Man (X (1-2) D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) et le D-Man ß (1-2) D-Man ß (1-2) D-Man (3 (1-2) D-Man sur le facteur 5 spécifique des (3-1, 2 oligomannosides et le facteur 1 réagissant avec les a-1, 2 oligomannosides vis à vis des mannotétraoses de synthèse d'anomérie a et ß-1, 2.

La figure 7 représente la réactivité du D-Man (3 (1-2) D-Man (3 (1-2) D-Man ß (1-2) D-Man avec plusieurs anticorps monoclonaux.

La figure 8 représente la réactivité antigénique du mannotetraose de synthèse D-Man a (1-3) D- Man a (1-2) D-Man oc (1-2) D-Man vis-à-vis du facteur antigénique 34.

La figure 9 représente la réactivité sérologique d'un pool de sérums de patients atteints de la maladie de Crohn vi-à-vis du mannotetraose de synthèse.

La figure 10 rapporte l'inhibition de la colonisation dans un modèle de candidose vaginale expérimentale de la rate par les tétramannosides de l'invention.

La figure 11 représente la comparaison de la colonisation digestive par la souche 10261 en fonction de l'administration préalable de sucre de synthèse. La colonisation digestive a été évaluée 7 jours après l'inoculation par la mesure des UFC/crotte pour des souriceaux ayant reçu de 1'eau (Témoin), 50 ug (50 (3) ou 150 pg (150 (3) de ßMan ou 150ut d'aMan (50a).

Exemple 1 : Préparation de D-Man ß (1-2) D-Man ß (1-2) D-Man 5 (1-2) D-Man de formule (I).

1-Schéma réactionnel.

La figure 1 en annexe représente le schéma réactionnel de la préparation de D-Man ß (1-2) D-Man ß (1-2) D-Man ß (1-2) D-Man de formule (I).

-le composé de formule 1 (Stutz, A. et al., 1985, Carbohydr. Res. 137, 282-290) est préparé par réaction de PhCH (OMe) 2 sur le phényl l-thio-a-D-mannopyranoside (Maity, S. K. et al., 1994, Tetrahedron, 50, 6965-6974) dans le DMF en présence de HBF4 Et20. Une benzylation sélective donne le composé 2. Ce dernier est silylé et oxydé pour donner le composé 4.

La réaction (a) est réalisée dans les conditions suivantes : BnBr, Bu2SnO, NBu4Br, toluène, 110°C.

La réaction (b) est réalisée dans les conditions suivantes : TBDMSOTf, Et3N, CH2C12.

La réaction (c) est réalisée dans les conditions suivantes : MCPBA, CH2Cl2,-40°C.

Les disaccharides et tétrasaccharides portant un thiophényl sont préparés tout d'abord en condensant les composés 2 et 4. La condensation entre 2 et 4 donne le disaccharide 5, celui ci peut tre activé en sulfoxyde pour donner le composé 7 ou déprotéger en position 2'pour donner l'accepteur 6. La condensation des composés 6 et 7 donne le tétrasaccharide clé 8.

La réaction (d) est réalisée dans les conditions suivantes : Tf20, 2, 6-diterbutyl-pyridine ou 2, 6-diterbutyl-4-methyl pyridine (DBMP), CH2Cl2,-78°C.

La réaction (e) est réalisée dans les conditions suivantes : b) NBu4F. 3H20, THF.

La réaction (f) est réalisée dans les conditions suivantes : MCPBA,-40°C, CH2Cl2.

La réaction (g) est réalisée dans les conditions suivantes : Tf20, DBMP, CH2Cl2,-0°c.

Le 8-methoxycarbonyloctanol a été choisi comme connecteur. Ce dernier peut tre préparé selon Lemieux (Lemieux, R. U. et al. 1975, J. Am. Chem. Soc., 97, 4076- 4083) à partir de l'acide azélaïque ou mieux par ozonolyse de l'oléate de méthyle et réduction in si tu de l'aldéhyde formé par NaBH4 (Gerlach, H. et al. 1978, Helv. Chim. Acta, 61, 1226-1231) Ce composé 8 est ensuite transformé en 9 par élimination du silyle par NBu4NF, réaction avec l'eau en présence de NBS, puis en le tétramannoside de formule (I) dans laquelle R est H par déprotection des benzyles et benzylidènes.

La glycosylation du composé 8 avec le 8- methoxycarbonyloctanol donne le composé 10 qui donne après déprotection le tétramannoside de formule (I) dans laquelle R est-(CH2) 8-CO2Me.

La réaction (h) est réalisée dans les conditions suivantes : NBu4F. 3H20, THF ; puis NBS, H20, acétone.

La réaction (i) est réalisée dans les conditions suivantes : NBS, TfOH, 8-methoxycarbonyloctanol, tamis moléculaire 4 Angstrom, CH2C12.

La réaction (j) est réalisée dans les conditions suivantes : H2, Pd/C, MeOH, AcOEt.

La réaction (k) est réalisée dans les conditions suivantes : 1-NBu4NF. 3H20, THF ; 2-H2, Pd/C, MeOH, AcOEt, 3-NaOH, THF, H2O.

II-Protocole expérimental.

1) Généralités.

Les points de fusion ont été mesurés sur un appareil capillaire Buchi 510 et n'ont pas été corrigés.

Les pouvoirs rotatoires ont été mesurés à température ambiante à l'aide d'un polarimètre Perkin-Elmer 241. Les spectres de masse en mode d'ionisation chimique (ammoniac) ont été obtenus avec un spectromètre Nermag R10-10. Les analyses élémentaires ont été effectuées par le Service de Micro Analyse de l'Université Pierre et Marie Curie (Paris VI). Les spectres RMN du proton ont été enregistrés sur des appareil Bruker à 250 ou 400 MHz en solution dans le chloroforme deutérié. Les déplacements chimiques sont donnés en ppm par rapport au TMS et les abréviations utilisées sont les suivantes : s (singulet) ; se (singulet élargi) ; d (doublet) ; de (doublet élargi) ; t (triplet) ; q (quadruplet) et m (multiplet) ; by (benzylidène). Les chromatographies sur couches minces ont été réalisées sur plaques de silice Merck 60 F254 et révélées par vaporisation d'une solution alcoolique d'acide sulfurique concentré (20% v/v) et chauffage. Les chromatographies sur colonne (flash) ont été faites sur gel de silice 60 (230- 400 mesh, Merck).

1) Phenyl 3-O-benzyl-4, 6-O-benzylidene-1-thio- a-D-mannopyranoside (2).

Ce composé est décrit dans la littérature : Z Szurmai, L Balatoni, A. Liptak, Carbohydr. Res. 254 (1994) 301-309 et T Oshitari, S Kobayashi, Tetrahedron Lett (1995) 1089-92. La description ci-après rapporte une synthèse utilisable sur de grandes quantités (avec deux variantes correspondant à deux solvants différents).

-Méthode 1 (le solvant est le toluène)

A une solution de 1 (composé connu : H Franzyk, M Medal, H Paulsen, K Bock J. Chem Soc. Perkin Trans I, (1995) 2883-98 avantageusement préparé selon R. Albert, K Dax, R. Pleschko, A Stütz, Carbohydr. Res. 137 (1985) 282- 290) (10g, 28 mmol) dans 295 mL de toluène anhydre, on ajoute 7. 59g d'oxyde de dibutylétain. Le mélange est porté à reflux du toluène avec un appareil de Dean Stark pendant une nuit. De l'iodure de tétrabutylammonium (6. 59g), puis du bromure de benzyle (4. 3mL) sont ajoutés. L'agitation est maintenue 3h sous reflux, puis on ramène à température ambiante (contrôle cyclohexane/acétate d'éthyle=3/1)) et concentre sous vide le mélange. On obtient un résidu, qui est purifié par chromatographie sur colonne (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=4/1) pour donner le produit 2 (llg, 89%).

-Méthode 2 (le solvant est l'acétonitrile) : On introduit dans un ballon, le composé 1 (9. 05 g, 25. 11 mmol) et 450 mL d'acétonitrile anhydre. On chauffe au reflux du CH3CN sous argon (le composé 1 se dissout dans l'acétonitrile à chaud). Quand la solution est limpide, on ajoute 23. 53 g de tamis 4 A en poudre, 7. 51 g de Bu2SnO. On laisse au reflux pendant 6 heures. On laisse revenir à température ambiante. On ajoute 8. 10 g de nBu4N+Br- (1 éq), 6. 3 mL de bromure de benzyle (2. 3 éq) et agite pendant la nuit à 45°C. On filtre à travers un entonnoir fritte recouvert de célite, on rince les solides avec du dichlorométhane et concentre sous vide. On obtient un résidu, qui est purifié par chromatographie sur colonne (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle= 3/1) pour donner le produit 2 (10. 2 g, 90%) 1H-RMN : (250 MHz, CDC13) : 8 : 5. 55 (s, 1H, By) ; 5. 52 (s, 1H, H-1) ; 4. 82 (d, 1H, J gem=11. 79 Hz, CHPh) ; 4. 67 (d, 1H, J gem=11. 75 Hz, CHPh) ; 4. 27 (ddd, 1H, H-5) ; 4. 21 (d, 1H, J 2-3=3. 54 Hz, H-2) ; 4. 14 (dd, 1H, J 6a-6b=9. 73 Hz

et J 6a-5=4. 80 Hz, H-6a) ; 4. 11 (t, 1H, H-4) ; 3. 89 (dd, 1H, J 3-4=9. 50 Hz et J 3-2=3. 37 Hz, H-3) ; 3. 78 (t, 1H, J 6b- 5=10. 18 Hz et J 6b-6a=10. 18 Hz, H-6b) ; 2. 79 (s, 1H, O-H).

2) Phenyl 2-0-tertbutyldimethylsilyl-3-0- benzyl-4, 6-benzylidene-1-thio-α-D- mannopyranoside (3).

On introduit dans un ballon, sous atmosphère d'argon, le composé 2 (5. 51 g, 12. 23 mmol) et 55 mL de dichlorométhane anhydre. On ajoute sous agitation : 5. 3 mL de triéthylamine (3. 1 éq), 4. 65 mL de triflate de terbutyldiméthylsilyle (1. 65 éq). On agite pendant une nuit à température ambiante. On contrôle l'état d'avancement de la réaction par CCM (élution : cyclohexane/acétate déthyle=3/1). On neutralise avec une solution aqueuse de NaHC03, La phase organique est concentrée sous vide pour donner un résidu, qui est purifié par chromatographie sur colonne (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=96/4), pour donner le produit 3 (6. 2 g, 90%). Rf : (cyclohexane/AcOEt= 96/4) : 0. 43. [α]D = +122 (c 1, 2 ; CHCl3) 1H-RMN (250 MHz, CDCl3) : 8 : 5. 55 (s, 1H, By) ; 5. 24 (d, 1H, J 1-2=1. 4 Hz, H-1) ; 4. 69 (dd, 2H, CHPh) ; 4. 26- 4. 08 (massif, 4H) ; 3. 83-3. 65 (massif, 2H) ; 0. 81 (s, 9H, Si- tBu) ; 0. 00 (s, 3H, Si-Me) ;-0. 4 (s, 3H, Si-Me).

Analyse pour C32H4005SSi (564. 821) : calculée C : 68. 04 H : 7. 14 trouvée C : 68. 15 H : 7. 27 3) Phenyl (2-O-tertbutyldimethylsilyl-3-O- benzyl-4, 6-O-benzylidene- α-D-mannopyranosyl) sulfoxide (4).

On introduit dans un ballon, sous atmosphère d'argon, le composé 3 (6. 2 g, 10. 97 mmol) et 125 mL de dichlorométhane anhydre. Dans le ballon refroidi à-78 °C, on ajoute de l'acide 3-chloro perbenzoique (12. 06 mmol) en solution dans 26 mL de dichlorométhane. On maintient la température à-78° C pendant 15 minutes puis laisse revenir doucement à-30°C. On ajoute (CH3) pour éliminer l'excès de peracide. On neutralise avec une solution saturée de NaHC03, lave avec une solution saturée de NaCl, extrait les phases aqueuses avec du dichlorométhane. La phase organique est séchée (MgS04), filtrée puis concentrée. On obtient un résidu, qui est purifié par chromatographie sur colonne (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=5/1), pour donner 4 (5. 04g, 79% en diastéréoisomère majoritaire). Lors de la chromatographie on récupère l'autre diastéréoisomère en proportion très minoritaire (<5%).

Caracteristiques de l'isomère majoritaire : [a] D =-67 (c 1, 0 ; CHC13) 1H-RMN : (400 MHz, CDCl3) : 87, 70-7, 20 (m, 15 H, arom) ; 5. 69 (s, 1H, By) ; 4. 93 et 4 ; 82 (2d, 2H, CHPh) ; 4. 73 (dd, 1H, J1, 2=1, 2, J2, 3 2. 3Hz, H-2) ; 4. 39 (d, 1H, H-1) ; 4. 30 (dd, 1H, J3, 4=9, 9 ; J4, 5 9, 9Hz ; H-4) ; 4. 28 (dd, 1H, H- 3) ; 4. 26 (dd, 1H, J6a, 6b 10. 3 ; J6b, 5=5, 8Hz, H-6b) ; 4. 14 ( ddd, 1H, J5, 6a=120, lHz, H-5) ; 3. 79 (dd, 1H, H-6a) ; 0. 88 (s, 9H, tBu) ; 0. 072 et-0. 046 (2s, 6H, MeSi) ; Spectre de masse : m/z 598 (M+NH4) +.

Analyse pour C32H4006SSi (564. 821) : calculée C : 66. 17 H : 6. 94 trouvée C : 66. 30 H : 7. 06 4) Phényl 2-0- (3-0-benzyl- 4, 6-0-benzylidène- <BR> <BR> 2-0-tertbutyldiméthylsilyl--D-mannopyranosyl)-3-O-benzyl- 4, 6-O-benzylidène-1-thio-α-D-mannopyranoside (5).

7. 1 g (12. 22 mmol, 1 éq) de 4 et 9. 06 mL (40. 3 mmol, 3. 3 éq) de 2, 6-ditertbutylpyridine sont dissous dans 200 mL de dichlorométhane anhydre et sont placés sous atmosphère d'argon. Après avoir refroidi la solution à -78°C, 2. 27 mL (13. 44 mmol, 1. 1 éq) d'anhydride de l'acide trifluorométhanesulfonique sont ajoutés. Après 5 mn d'agitation à-78°C, 11 g (24. 4 mmol, 2 éq) de 2 préalablement dilués dans 100mL de dichlorométhane anhydre sont additionnés goutte à goutte. La température est maintenue 1 heure à-78°C et laissée lentement remonter à 0°C. Le milieu reactionnel est alors neutralisé par une solution d'hydrogénocarbonate de sodium. La phase organique est ensuite lavée par une solution aqueuse de NaCl, séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous vide.

Une chromatographie sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=96/4) du brut permet d'obtenir 5 (7. 97 g, 72%) sous la forme d'une mousse blanche. pf : 81-83°C (hexane) ; [α]D +12. 5 (c 1. 02, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDCl3) : # 7. 58-7. 34m ( 25H, arom.), 5. 66 et 5. 65 (2s, 2H, by), 5. 56 (d, 1H, J 1-2=lHz, H-1A), 4. 85 (2d, 2H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 8 (d, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 75 (d, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 53 (dd, 1H, J 2-1=lHz et J 2-3=3. 3Hz, H-2A), 4. 52 (se, 1H, H-1B), 4. 45-4. 4 (m, 1H, H-5A), 4. 37 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9.5Hz, H-

4A), 4. 31 (dd, 1H, J 6b-6a=lOHz et J 6b-5=4. 3Hz, H-6Ab), 4. 26 (dd, 1H, J 6b-6a=10. 3Hz et J 6b-5=4. 8Hz, H-6Bb), 4. 21 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 5Hz, H-4B), 4. 19 (de, 1H, J 2- 3=2. 7Hz, H-2B), 4 (dd, 1H, J 3-2=2. 7Hz et J 3-4=9. 5Hz, H- 3A), 3. 91 (t, 1H, J 6a-6b=J 6a-5=lOHz, H-6Aa), 3. 84 (t, 1H, 6a-6b=J 6a-5=10. 2Hz, H-6Ba), 3. 59 (dd, 1H, J 3-2=2. 7Hz et J 3-4=9. 5Hz, H-3B), 3. 35 (dt, 1H, J 5-4=J 5-6a=10. 2Hz et J 5-6=4. 8Hz, H-5B), 1. 0 (s, 9H, SiC (CH3) 3), 0, 30 et 0, 23 (2s, 6H, Si (CH3) 2).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 138. 55, 138. 3, 137. 5, 137. 4, 133. 6 (5 C arom.), 131. 8-126. 06 (25 CH arom), 101. 6 (CH by), 101. 4 (CH by), 99. 8 (1JCH=157Hz, C-1B), 86. 7 (lJcH=166Hz, C-1A), 78. 7 (C-4B), 78. 2 (C-4A), 77. 5 (C-3B), 76. 4 (C-2A), 74 (C-3A), 72. 2 (CH2Ph), 71. 7 (C-2B), 70. 7 (CH2Ph), 68. 5 (C-6B), 68. 47 (C-6A), 67. 7 (C-5B), 65. 2 (C- 5A), 26 (C (CH3) 3), 18. 5 (C (CH3) 3),-4 (SiCH3),-4. 5 (SiCH3).

Spectre de masse : m/z 922 (M+NH4) +.

Analyse pour C52H60O10SSi (905. 199) : calculée C : 68. 99 H : 6. 68 trouvée C : 68. 82 H : 6. 69 5) Phényl 2-O-(3-O-benzyl-4,6-O-benzylidène-ß- <BR> <BR> <BR> <BR> D-mannopyranosyl)-3-O-benzyl-4, 6-0-benzylidène-1-thio-a-D- mannopyranoside (6).

3. 8 g (4. 2 mmol, 1 éq) du produit 5 et 6. 6 g (21 mmol, 5 éq) de fluorure de tetrabutylammonium trihydrate sont dissous dans 60 mL de tetrahydrofurane.

Après 1 heure à température ambiante, le milieu est dilué par du dichlorométhane et la phase organique est lavé par de l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous pression réduite. Une chromatographie sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=3/1) fournit 6 (3. 0 g, 90%) sous forme d'une poudre blanche. pf : 79- 81°C (hexane) ; I (XID +30 (c 0. 33, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDC13) 8 7. 54-7. 30m (, 25H, arom.), 5. 59 et 5. 51 (2s, 2H, by), 5. 54 (d, 1H, J 1-2=lHz, H-1A), 4. 89 (d, 1H, J gem=12. 2Hz, CHPh), 4. 86 (d, 1H, J gem=11. 8Hz, CHPh), 4. 82 (d, 1H, J gem=11. 8Hz, CHPh), 4. 8 (d, 1H, J gem=12. 2Hz, CHPh), 4. 77 (d, 1H, J 1-2=0. 8Hz, H- 1B), 4. 66 (dd, 1H, J 2-1=1Hz et J 2-3=3. 3Hz, H-2A), 4. 33 (dt, 1H, J 5-4=9. 7Hz et J 5-6a=J 5-6b=4.9Hz, H-5A), 4. 32 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 3Hz, H-4B), 4. 26 (dd, 1H, J 6b- 6a=10. 5Hz et J 6b-5=4.9Hz, H-6Bb), 4. 3 (dd, 1H, J 6b- 6a=10Hz et J 6b-5=5Hz, H-6Ab), 4. 24 (t, 1H, J 4_3=J 4_ 5=9. 7Hz, H-4A), 4. 19 (de, 1H, J 2-3=3. 9Hz, H-2B), 4. 04 (dd, 1H, J 3-2=3. 3Hz et J 3-4=9. 7Hz, H-3A), 3. 8 (m, 2H, H-6Aa et H-6Ba), 3. 72 (dd, 1H, J 3-2=3. 9Hz et J 3-4=9. 2Hz, H-3B), 3. 43 (dt, 1H, J 5-4=J'5-6a=9. 5Hz et J 5-6b=4. 9Hz, H-5B), 3. 2 (br, 1H, OH).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 138, 137. 8, 137. 3, 137. 29, 131. 7 (5 C arom.), 129. 2-127. 7 (25 CH arom), 101. 4 (CH by), 101. 2 (CH by), 97. 4 (1JcH=163Hz, C-1B), 86. 4 (1JCH=167Hz, C-1A), 78. 5 (C-4A), 78. 4 (C-4B), 76. 1 (C-3B), 74. 4 (C-3A), 74. 35 (C-2A), 72. 4 (CH2Ph), 72. 3 (CH2Ph), 69. 4 (C-2B), 68. 5 (C-6B), 68. 25 (C-6A), 66. 8 (C-5B), 65. 2 (C- 5A).

Spectre de masse : m/z 808 (M+NH4) +.

Analyse pour C46H4601oS (790. 93) : calculée C : 69. 85 H : 5. 86 trouvée C : 69. 76 H : 6. 01 6) Phényl [2-0- (3-0-benzyl-4, 6-0-benzylidène-2- 0-tertbutyldiméthylsilyl-p-D-mannopyranosyl)-3-O-benzyl- 4, 6-0-benzylidène a-D-mannopyranosyl] sulfoxyde (7).

3. 0 g (3. 31mmol, 1 éq) de 5 sont dissous dans 40 mL de dichlorométhane anhydre. Après avoir refroidi le milieu reactionnel à-78°C, 0. 97 g (5. 5 mmol, 1. 7 éq) d'acide 3-chloroperoxybenzoique à 85 % préalablement dissous dans 15mL de dichlorométhane sont ajoutés à l'aide d'une canule. Après 15 mn d'agitation à-78°C, la température est laissée remonter à-30°C et quelques gouttes de diméthylsulfure sont additionnées. La phase organique est alors lavée par une solution d'hydrogénocarbonate de sodium, une solution aqueuse de NaCl, séchée (MgS04), filtrée et évaporée sous vide. Une chromatographie sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=4/1, puis 3/1) du brut donne 2. 8 g (91%) d'un premier diastéréomère 7 sous forme d'une mousse blanche et 71 mg (2%) d'un deuxième diastéréomère sous forme également d'une mousse blanche.

Caracteristiques du diastéréomère majoritaire pf : 89-91°C (hexane) ; [a] D-99 (c 1, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDCl3) : # 7. 65-7. 4m ( 25H, arom.), 5. 63 et 5. 62 (2s, 2H, by), 4. 89 (1d, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 85 (d, 1H, J gem=12-4Hz, CHPh), 4. 81 (dd, 1H, J 2-1=1.1Hz et J 2-3=3. 4Hz, H-2A), 4. 78 (d, 1H, J gem=12. 4Hz, CHPh), 4. 76 (ld, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 42

(d, 1H, J 1-2=l. lHz, H-1A), 4. 37 (t, 1H, J 4-3=J 4- 5=10. 1Hz, H-4A), 4. 33 (dd, 1H, J 3-2=3. 4Hz et J 3-4=10. 1Hz, H-3A), 4. 28 (dd, 1H, J 6b-6a=10. 2Hz et J 6b-5=4. 8Hz, H- 6Ab), 4. 26 (se, 1H, H-1B), 4. 18-4. 10 (m, 3H, H-5A, H-6Bb et H-4B), 4. 08 (de, 1H, J 2-3=2. 8Hz, H-2B), 3. 75 (t, 1H, J 6a- 6b=J 6a-5=10. 1Hz, H-6Aa), 3. 74 (dd, 1H, J 6b-6a=J 6b- 5=10. 2Hz, H-6Ba), 3. 52 (dd, 1H, J 3-2=2. 8Hz et J 3-4=9. 7Hz, H-3B), 3. 18 (dt, 1H, J 5-4=J 5-6a=9. 8Hz et J 5-6=4. 8Hz, H- 5B), 1 (s, 9H, SiC (CH3) 3), 0. 22 et 0. 17 (2s, 6H, Si (CH3) 2).

13C R. M. N. (100 MHz) : 8 141. 3, 138. 4, 138. 3, 137. 5, 137 (5 C arom.), 131. 8-124. 3 (25 CH arom), 101. 7 (CH by), 101. 4 (CH by), 99. 8 (1JCH=156Hz, C-1B), 97. 5 (1JCH=163Hz, C-1A), 78. 7 (C-4B), 77. 5 (C-3B), 77. 1 (C-4A), 74. 2 (C-3A), 72. 4 (CH2Ph), 71. 7 (C-2B), 71. 4 (C-2A), 70. 9 (CH2Ph), 70. 1 (C-5A), 68. 4 (C-6B), 68. 1 (C-6A), 67. 5 (C- 5B), 26 (C (CH3) 3), 18. 5 (C (CH3) 3),-4 (SiCH3),-4. 5 (SiCH3).

Analyse pour C46H4601oS (921. 198). calculee C : 67. 8 H : 6. 56 trouvée C : 67. 68 H : 6. 90 7) Phényl 2-0- (2-0- (2-0- (3-0-benzyl-4, 6-0- <BR> <BR> <BR> benzylidène-2-O-tertbutyldiméthyl silyl-ß-D-mannopyranosyl) -3-O-benzyl-4, 6-O-benzylidène-ß-D-mannopyranosyl)-3-O- benzyl-4, 6-0-benzylidène-p-D-mannopyranosyl)-3-0-benzyl- 4, 6-O-benzylidène-1-thio-α-D-mannopyranoside (8).

Le protocole expérimental est le mme que celui de la synthèse du disaccharide 5. On obtient à partir de 6 (1. 140g, 2éq) et 7 (0. 664g, léq) le composé 8 (580 mg, 55%) d'une mousse blanche après une chromatographie sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=85/15). pf : 111-114°C (hexane) ; [α]D -53. 5 (c 0. 6, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDCl3) : 8 7. 5-7. 15m 45H, arom.), 5. 615*2, 5. 61 et 5. 6 (4s, 4H, by), 5. 53 (d, 1H, J 1-2=1. lHz, H-1A), 5. 35 (se, 1H, H-1B), 5. 03 (se, 1H, H-1C), 4. 82 (d, 1H, J gem=12. 8Hz, CHPh), 4. 76 (s, 2H, CH2Ph), 4. 73 (d, 1H, J gem=12. 8Hz, CHPh), 4. 72 (se, 1H, H-1D), 4. 72 (d, 1H, J gem=11.6Hz, CHPh), 4. 67 (d, 1H, J gem=17.7Hz, CHPh), 4. 57 (d, 1H, J gem=11. 6Hz, CHPh), 4. 58-4. 57 (m, 1H, H-2A), 4. 57 (de, 1H, J 2-3=3. 2Hz, H-2B), 4. 57 (2de, 2H, J 2- 3=3. 2Hz, H-2C et H-2D), 4. 42-4. 37 (m, 1H, H-5A), 4. 39-4. 35 (m, 2H, H-6Db et H-6Bb), 4. 38 (d, 1H, J gem=11. 7Hz, CHPh), 4. 29 (dd, 1H, J 6b-6a=10. 2 et J 6b-5=4. 8Hz, H-6Ab), 4. 24 (dd, 1H, J 4-3=10 et J 4-5=9. 6Hz, H-4B), 4. 16 (t, 1H, J 4- 3=J 4-5=9. 7Hz, H-4C), 4. 13 (dd, 1H, J 6b-6a=10. 2 et J 6b- 5=4. 7Hz, H-6Cb), 4. 05 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=lOHz, H-4A), 4. 02 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=lOHz, H-4D), 4. 05-4. 02 (m, 1H, H-3A), 4 (t, 1H, J 6a-6b=J 6a-5=10.3Hz, H-6Ba), 3. 89 (t, 1H, J 6a-

6b=J 6a-5=10. 2Hz, H-6Da), 3. 8 (t, 1H, J 6a-6b=J 6a- 5=10. 2Hz, H-6Aa), 3. 79 (t, 1H, J 6a-6b=J 6a-5=10. 2Hz, H- 6Ca), 3. 69 (dd, 1H, J 3-2=3. 2Hz et J 3-4=9. 9Hz, H-3D), 3. 58 (dd, 1H, J 3-2=2. 7Hz et J 3-4=9. 7Hz, H-3C), 3. 55 (dd, 1H, J 3-2=3. 2Hz et J 3-4=lOHz, H-3B), 3. 49 (ddd, 1H, J 5-4=9. 6Hz et J 5-6b=10. 3Hz et J 5-6a=4. 8Hz, H-5B), 3. 42 (ddd, 1H, J 5-4=9. 8Hz et J 5-6b=4. 8Hz et J 5-6a=10. 2Hz, H-5D), 3. 31 (ddd, 1H, J 5-4=9. 7Hz et J 5-6b=4.75Hz et J 5-6a=10. 1Hz, H- 5D), 0. 95 (s, 9H, SiC (CH3) 3), 0. 25 et 0. 14 (2s, 6H, Si (CH3) 2).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 138. 6, 138. 4, 138. 1, 138, 137. 7, 137. 4, 136. 95, 136. 93, 133. 2 (9 C arom.), 131. 65-126 (45 CH arom), 103. 1 (lJCH=159Hz, C-1C), 102. 05 (CH by), 102. 02 (CH by), 101. 6 (CH by), 101. 2 (CH by), 101.19 (1JCH=158.5Hz, C-1B), 99 (1JCH=167Hz, C-1A), 85. 4 (1JCH=159. 2Hz, C-1D), 79. 7 (C-3C), 79. 05 (C-4C), 78. 9 (C- 4A), 78. 5 (C-4D), 77. 6 (C-4B), 76. 9 (C-3B), 75. 8 (C-3D), 75. 3 (C-2B), 75. 2 (C-2A), 74. 4 (C-3A), 73. 1 (C-2C ou C-2D), 72. 8 (CH2Ph), 71. 9 (CH2Ph), 71. 2 (C-2C ou C-2D), 70. 9 (CH2Ph), 70. 1 (CH2Ph), 68. 8 (C-6A), 68. 7 (C-6D et C-6B), 68. 5 (C-6C), 68. 1 (C-5B), 67. 8 (C-5C), 67. 7 (C-5D), 65. 1 (C-5A), 26. 1 (C (CH3) 3), 18. 5 (C (CH3) 3),-3. 7 (SiCH3),-4. 7 (SiCH3).

Spectre de masse : m/z 1602 (M+NH4) +.

Analyse pour C92H100O20SSi (1585. 956) : calculée C : 69. 67 H : 6. 35 trouvée C : 69. 57 H : 6. 41 8) 8-méthoxycarbonyloctyl 2-0- (2-0- (2-0- (3-0- benzyl-4, 6-0-benzylidène-2-0-tertbutyldiméthyl silyl-p-D- mannopyranosyl)-3-0-benzyl-4, 6-0-benzylidène-p-D- mannopyranosyl)-3-0-benzyl-4, 6-O-benzylidène-ß-D- mannopyranosyl)-3-0-benzyl-4, 6-0-benzylidène-D- mannopyranoside (10).

562 mg (354 pmol, 1 éq) de 8, 166 mg (885 pmol, 2. 5 éq) du méthoxycarbonyloctan-1-ol (préparé selon H.

Gerlach, P. Künzler, K. Oertle, Helv Chim. Acta, 61 (1978), 1226-1231.) et 700 mg de tamis moléculaire 4A en poudre sont mis en suspension dans 10 mL de dichlorométhane anhydre. Le tout est mis sous atmosphère d'argon et agité durant 30mn. La solution est refroidie à-20°C et 126 mg (709 Rmol, 2 éq) de N-bromosuccinimide ainsi que 6. 3 RL (7. 08 J. mol, 0. 2 éq) d'acide trifluorométhanesulfonique y sont ajoutés. Après 1 heure à-20°C, une solution d'hydrogénocarbonate de sodium est additionnée. Le tout est filtré sur un lit de célite. La phase organique est lavée par une solution de thiosulfate de sodium et par une solution aqueuse de NaCl. Celle-ci est ensuite séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous vide. Le brut est chromatographié sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=3. 5/1) et fournit 412 mg (70%) du composé 10 (us=1/6) non séparables sous la forme d'une mousse blanche.

1H-R. M. N. (400MHz, CDCl3) du produit P-0- connecteur : 7. 48-7. 16m(, 40H, arom.), 5. 64, 5. 62 et 5. 6, 5. 34 (4s, 4H, by), 5. 34 (s, 1H, H-1A), 5. 16 (s, 1H, H-1B), 4. 86 (d, 1H, J gem=12-3Hz, CHPh), 4. 84 (s, 1H, H-1C), 4. 82 (d, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 79 (d, 1H, J gem=12. 4Hz,

CHPh), 4. 74 (d, 1H, J 2-3=3. 2Hz, H-2C), 4. 73 (d, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 68 (d, 1H, J gem=12-3Hz, CHPh), 4. 67 (d, 1H, J gem=11. 8Hz, CHPh), 4. 65 (d, 1H, J 2-3=3. 4Hz, H-2A), 4. 63 (d, 1H, J gem=12. 4Hz, CHPh), 4. 56 (d, 1H, J gem=11. 8Hz, CHPh), 4. 51 (d, 1H, J 2-3=3. 2Hz, H-2B), 4. 47 (s, 1H, H-1D), 4. 41 (dd, 1H, J 6b-6a=10.4Hz et J 6b- 5=4. 8Hz, H-6Cb), 4. 36 (dd, 1H, J 6b-6a=10.3Hz et J 6b- 5=4. 8Hz, H-6Ab), 4. 32 (dd, 1H, J 6b-6a=10.3Hz et J 6b- 5=4. 5Hz, H-6Db), 4. 28 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 6Hz, H-4A), 4. 23 (dd, 1H, J 6b-6a=10. 4Hz et J 6b-5=4. 6Hz, H-6Bb), 4. 21 (d, 1H, J 2-3=3. 15Hz, H-2D), 4. 17 (t, 1H, J 4-3=J 4- 5=9. 3Hz, H-4B), 4. 01 (t, 1H, J 6a-6b=J 6a-5=10. 3Hz, H-6Aa), 3. 99 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 5Hz, H-4C), 3. 91 (t, 1H, J 6a- 6b=J 6a-5=10. 4Hz, H-6Ca), 3. 95-3. 88 (m, 1H,-0-CH-CH2-), 3. 88 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 8Hz, H-4D), 3. 85 (t, 1H, J 6a- 6b=J 6a-5=10. 4Hz, H-6Ba), 3. 69 (s, 3H,-C : O-OCH3), 3. 64 (dd, 1H, J 3-2=3. 2Hz et J 3-4=9. 5Hz, H-3C), 3. 6 (dd, 1H, J 3-2=3. 4Hz et J 3-4=9. 6Hz, H-3A), 3. 59 (dd, 1H, J 3-2=3. 15Hz et J 3-4=9. 8Hz, H-3D), 3. 60-3. 57 (m, 1H, H-6Da), 3. 54 (dd, 1H, J 3-2=3. 2Hz et J 3-4=9. 3Hz, H-3B), 3. 5-3. 27 (m, 5H, H- 5A, H-5B, H-5C, H-5D et-0-CH-CH2-), 2. 31 (t, 2H, J 3_ 2=7. 5Hz,-CH2C : O-OCH3), 1. 64-1. 58, 1. 34-1. 31 (m, 12H,-CH2- ), 0. 94 (s, 9H, SiC (CH3) 3), 0. 25 et 0. 14 (2s, 6H, Si (CH3) 2).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 138. 5, 138. 4, 138. 39, 138. 2, 137. 7, 137. 5, 137. 1, 137. 08 (8 C arom.), 129-126 (40 CH arom), 103. 9 (159. 7C-1C), 102. 7 (1JCH=160Hz, C-1D), 101. 8 (CH by), 101. 6 (CH by), 101. 58 (lJCH=155Hz, C-1A), 101. 5 (CH by), 101. 35 (1JCH-158.5Hz, C-1B), 101. 2 (CH by), 79. 9 (C-3B), 78. 97 (C-4B), 78. 46 (C-4D), 78. 4 (C-4C), 77. 9 (C-4A), 77. 6 (C-2D), 76. 29 (C-3D), 76. 27 (C-3C), 76. 23 (C- 3A), 75. 22 (C-2A), 72. 83 (C-2C), 72. 8 (CH2Ph), 71. 9

(CH2Ph), 71. 16 (C-2B), 70. 62 (CH2Ph), 70. 14 (-O-CH2-), 69. 8 (CH2Ph), 68. 87, 68. 82*2, 68. 5 (C-6A, C-6B, C-6C et C-6D), 67. 88 (C-5B), 67. 83 (C-5C), 67. 7 (C-5A), 67. 4 (C-5D), 34 (- CH2-C : O-O-CH3), 29. 5, 29. 2, 29. 1, 29, 25. 5, 24. 8 (-CH2-), 25. 9 (C (CH3) 3), 18. 5 (C (CH3) 3),-3. 7 (SiCH3),-4. 7 (SiCH3).

Spectre de masse : m/z 1663. 7 (M+H) +.

Analyse pour C96Hn4023Si (1664. 03) : calculée C : 69. 29 H : 6. 905 trouvée C : 69. 13 H : 7. 06 9) 8-carboxyloctyl 2-O- (2-0- (2-0- (P-D- <BR> <BR> <BR> <BR> mannopyranosyl)-p-D-mannopyranosyl)-a-D-mannopyranosyl)-D- mannopyranoside (I, R=connecteur).

-Etape 1 : désilylation 305 mg (183 Rmol, 1 éq) du composé 10 et 405 mg (1. 28 mmol, 7 éq) de fluorure de tetrabutylammonium trihydrate sont mis en solution dans 10 mL de tetrahydrofurane. Après 12 heures de chauffage à 60°C, le milieu reactionnel est dilué par du dichlorométhane et lavé par de l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée sous pression réduite. La chromatographie du brut sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=2/1) fournit 230 mg (80%) du produit désilylé sous la forme d'une mousse blanche.

Etape 2 : saponification 140 mg (85 Rmol) du produit précédent sont dissous dans 5 mL de tetrahydrofurane. A cela sont ajoutés 4. 5 mL (0. 1N) d'hydroxyde de sodium. Le tout est chauffé à 60°C durant une nuit. La solution est alors acidifiée par une solution d'acide chlorhydrique (1M) et extraite 3 fois par du dichlorométhane. La phase organique est séchée sur MgS04, filtrée et évaporée sous vide. La chromatographie du brut sur gel de silice (élution : dichlorométhane/ méthanol=50/1) fournit 115 mg (82%) du produit sous la forme d'une mousse blanche.

Etape 3 : hydrogénolyse 66mg (42 Rmol) du produit précédent sont dissous dans 2 mL de méthanol et agités sous atmosphère de dihydrogène (1. 4bar) en présence de Pd/C (10 %) en quantité catalytique pour donner (I, R=connecteur) (29. 3 mg, 83%), après lyophilisation, sous forme d'une poudre blanche amorphe. (mélange axa 1/6 au niveau de l'aglycone) 1H-R. M. N. (400MHz, D20) du produit ß-O- connecteur : 84. 99 (se, 1H, H-1A), 4. 89 (se, 1H, H-1B), 4. 84 (se, 1H, H-1C), 4. 68 (se, 1H, H-1D), 4. 36 (d, 1H, J 2- 3=3Hz, H-2A), 4. 28 (d, 1H, J 2-3=3. 2Hz, H-2C), 4. 18 (d, 1H, J 2-3=3. 19Hz, H-2D), 4. 11 (d, 1H, J 2-3=3. 2Hz, H-2B), 3. 9- 3. 84 (m, 5H, H-6Ab, H-6Bb, H-6Cb, H-6Db et-O-CH-CH2), 3. 73-3. 65 (m, 4H, H-6Aa, H-6Ba, H-6Ca, H-6Da), 3. 63 (dd, 1H, J 3-2=3. 19Hz et J 3-4=9. 7Hz, H-3D), 3. 62-3. 57 (m, 2H,- O-CH-CH2 et H-3C), 3. 59 (dd, 1H, J 3-2=3Hz et J 3-4=10. 3Hz, H-3A), 3. 57 (dd, 1H, J 3-2=3. 2Hz et J 3-4=9. 7Hz, H-3B), 3.55 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=10. 3Hz, H-4A), 3. 51 (t, 1H, J 4_ 3=J 4-5=9. 7Hz, H-4B), 3. 46 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 7Hz, H- 4C), 3. 44 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 7Hz, H-4D), 3. 36-3. 3 (m, 4H, H-5A, H-5B, H-5C et H-5D), 2. 25 (t, 2H, J CH2-

CH2=7. 4Hz,-CH2-COOH), 1. 6-1. 52 et 1. 3-1. 28 (m, 12H,-CH2_ ).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 181. 7 (COOH), 101. 58, 101. 46, 101. 26, 100. 32 (C-1A, C-1B, C-1C, C-1D), 79. 5, 79. 3, 78. 7, 76. 6, 76. 5*3, 73. 2, 72. 6, 72. 3*2, 70. 7, 67. 8, 67. 4, 67. 2, 67. 1, 61. 5, 61. 06, 61. 02, 60. 9 (20 CH cycle), 70. 4 (-O-CH2-), 34 (-CH2-CO2H), 29, 28. 7, 28. 65, 28. 6, 25. 7, 25. 5 (6-CH2-).

Spectre de masse (FAB) m/z calculé C33H58O23Na : 845. 32. Trouvé 845. 24 10) 2-0- (2-0- (2-0- (3-0-benzyl-4, 6-0-benzylidène -p-D-mannopyranosyl)-3-0-benzyl-4, 6-O-benzylidène-ß-D-manno <BR> <BR> <BR> <BR> pyranosyl)-3-0-benzyl-4, 6-0-benzylidène-p-D-mannopyranosyl) -3-O-benzyl-4, 6-O-benzylidène-D-mannopyranose (9).

Etape 1 : désilylation Pour le protocole expérimental, voir l'étape 1 du composé I (R=connecteur).

8 (235 mg) traité par le fluorure de tetrabutylammonium donne du phényl 2-0- (2-0- (2-0- (3-0- benzyl-4, 6-0-benzylidène ß-D-mannopyranosyl)-3-O-benzyl- 4, 6-O-benzylidène-ß-D-mannopyranosyl)-3-O-benzyl-4, 6-0- benzylidène-p-D-mannopyranosyl)-3-0-benzyl-4, 6-O- benzylidène-1-thio-a-D-mannopyranoside (202 mg, 92%) sous

la forme d'une mousse blanche, après une chromatographie sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=2. 5/1) et après une recristallisation dans du méthanol. pf : 133-136°C (méthanol) ; [a] D-42 (c 0. 5, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDC13) 8 7. 57-7. 32m(, (, 45H, arom.), 5. 73, 5. 71, 5. 67 et 5. 66 (4s, 4H, by), 5. 64 (s, 1H, H-1A), 5. 36 (s, 1H, H-1B), 4. 92 (s, 1H, H-1D), 4. 86 (d, 1H, J gem=12. 1Hz, CHPh), 4. 83 (d, 1H, J gem=11.8Hz, CHPh), 4. 79 (s, 1H, H-1C), 4. 78 (s, 2H, CH2Ph), 4. 77 (2d, 2H, 2CHPh), 4. 71 (d, 1H, J 2-3=3. 2Hz, H-2A), 4. 69 (d, 1H, J gem=11. 8Hz, CHPh), 4. 64 (d, 1H, J gem=11. 8Hz, CHPh), 4. 61 (d, 1H, J 2- 3=3Hz, H-2B), 4. 53 (d, 1H, J 2-3=3. 4Hz, H-2C), 4. 51-4. 46 (m, 1H, H-5A), 4. 47 (dd, 1H, J 6b-6a=10.3Hz et J 6b- 5=4. 8Hz, H-6Bb), 4. 41-4. 36 (m, 4H, H-6Ab, H-6Cb, H-6Db, H- 2D), 4. 36 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 7Hz, H-4D), 4. 32 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 8Hz, H-4B), 4. 21 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 7Hz, H- 4C), 4. 13-4. 11 (m, 2H, H-4A et H-3A), 4. 08 (t, 1H, J 6a- 6b=J 6a-5=10Hz, H-6Ba), 3. 98 (dd, 1H, J 6a-6b=10. 4 et J 6a- 5=9. 7Hz, H-6Ca), 3. 95 (dd, 1H, J 6a-6b=10.1J 6a-5=9. 7Hz, H- 6Da), 3. 91 (t, 1H, J 6a-6b=J 6a-5=10. 2Hz, H-6Aa), 3. 75 (dd, 1H, J 3-2=3. 4Hz et J 3-4=9. 7Hz, H-3C), 3. 65 (dd, 1H, J 3- 2=3Hz et J 3-4=9. 8Hz, H-3B), 3. 56 (ddd, 1H, J 5-4=9. 8Hz et 5-6b=4.8Hz et J 5-6a=9.8Hz, H-5B), 3. 53 (dd, 1H, J 3- 2=3. lHz et J 3-4=9. 6Hz, H-3D), 3. 44 (ddd, 1H, J 5-4=9. 7Hz et J 5-6b=9. 7Hz et J 5-6a=4. 7Hz, H-5C), 3. 35 (ddd, 1H, J 5- 4=9. 7Hz et J 5-6b=9. 7Hz et J 5-6a=4. 9Hz, H-5D), 3. 28 (se, 1H, OH).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 138. 2*2, 137. 9, 137. 8, 137. 5, 137. 2, 137. 04, 136. 8, 133. 05 (9 C arom.), 131. 5- 125. 9 (45 CH arom), 102. 1 (CH by), 101. 5 (CH by), 101. 48 (C-1D), 101. 26 (CH by), 101. 15 (CH by), 101 (C-1B), 98. 2

(C-1C), 85. 14 (C-1A), 78. 98 (C-4A), 78. 4 (C-4D), 78 (C-4B), 77. 98 (C-4C), 77. 7 (C-3B), 76. 9 (C-3D), 75. 3 (C-3C), 74. 6 (C-3A), 74. 4 (C-2A), 74. 3 (C-2C), 74. 1 (C-2B), 72. 4 (CH2Ph), 71. 8*2 (CH2Ph), 71 (CH2Ph), 68. 9 (C-2D), 68. 6 (C- 6D), 68. 5 (C-6A), 68. 4 (C-6B), 68. 25 (C-6C), 67. 8 (C-5B et C-5C), 66. 8 (C-5D), 64. 9 (C-5A).

Spectre de masse : m/z 1488 (M+NH4) +.

Analyse pour C86Hs602oS. lCH30H (1503. 67) : calculée C : 69. 49 H : 6. 03 trouvée C : 69. 28 H : 5. 92 Etape 2 : hydrolyse du thiophényl 175 mg (119 pmol, 1 éq) du composé précédent sont dissous dans un mélange de solvants acétone/eau=4. 5mL/0. 5mL. Le tout est refroidi à 0°C. A cela sont ajoutés 106 mg (0. 595 mmol, 5 éq) de N- bromosuccinimide. Une solution d'hydrogénocarbonate de sodium est versée dans le ballon après 30 mn d'agitation à 0°C. L'acétone est alors évaporée sous vide. Le résidu est repris par du dichlorométhane, lavé par une solution de thiosulfate de sodium et par une solution aqueuse de NaCl.

La phase organique est ensuite séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et évaporée. Le brut est chromatographié sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=1. 8/1 puis 1. 5/1) et donne 138 mg (Rdt=84%) du composé 9 d'un mélange de configuration a/p (2. 6/1) sous forme d'une mousse blanche.

1H-R. M. N. (400MHz, CDC13) du produit a-OH : 85. 52 (s, 1H, H-1B), 5. 22 (de, 1H, J 1-OH=3Hz, H-1A), 4. 78 (s, 1H, H-1D), 4. 63 (s, 1H, H-1C).

13C R. M. N. (100 MHz) 101. 7 (C-1D), 101. 1 (C-1B), 99. 2 (C-1C), 92. 09 (C-1A) et disparition du pic caractéristique à 85. 14 ppm de C-1A possédant un thiophénol en tant qu'aglycone.

Spectre de masse : m/z 1396. 8 (M+NH4) +.

Analyse pour C8oH82021 (1379. 529) : calculée C : 69. 65 H : 5. 99 trouvée C : 69. 46 H : 6. 11 11) 2-O-(2-O-(2-O-(ß-D-mannopyranosyl)-ß-D- mannopyranosyl)-ß-D-mannopyranosyl)-D-mannopyranose (I, R=H).

Pour le protocole expérimental, voir l'étape 3 du composé I (R=connecteur).

111. 4 mg (80. 7 p, mol) du composé 9 donne 46 mg (85%) du composé I (R=H) après lyophilisation sous forme d'une poudre amorphe.

1H-R. M. N. (400MHz, D20) du produit a-OH : 85. 24 (d, 1H, J 1-2=1. 64Hz, H-1A), 4. 91 (s, 1H, H-1C), 4. 89 (s, 1H, H-1D), 4. 81 (se, 1H, H-1B), 4. 39 (d, 1H, J 2-3=3. 2Hz, H-2C), 4. 22 (d, 1H, J 2-3=3. 27Hz, H-2B), 4. 11 (d, 1H, J 2- 3=3. 1Hz, H-2D), 4. 08 (dd, 1H, J 2-1=1. 64Hz et J 2-3=3. 02Hz, H-2A).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 101. 53, 101. 29, 99. 46, 92. 4 (C-1A, C-1B, C-1C, C-1D), 79. 7, 79, 78. 7, 76. 6, 76. 5, 76. 4, 73. 2, 72. 67, 72. 5, 72. 2, 70. 7, 69. 4, 67. 7, 67. 4, 67. 26, 67. 1, 61. 5, 61. 1, 60. 84, 60. 7 (20 CH cycle).

Spectre de masse (FAB) m/z : calculée C24H42021Na : 689. 21 obtenue : 689. 32

Exemple 2 : Préparation de D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) D-Man, de formule (II).

1-Schéma réactionnel.

La figure 2 en annexe représente le schéma réactionnel de la préparation de D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) D-Man de formule (II). Comme dans 1'exemple 1 une stratégie par bloc a été utilisée. Un groupe thiophényl protège intermédiairement le carbone anomère. Le composé 11 conduit selon la réaction mise en oeuvre aux composés 12 ou 13, lesquels sont condensés en le disaccharide 14.

La réaction (a') est réalisée dans les conditions suivantes : CH3COOH, H2O (80/20) puis CC13CN, DBU, CH2C12, 0°C.

La réaction (b') est réalisée dans les conditions suivantes : PhSH, HgBr2, CH3CN, 80°C puis CHBONa, CH30H.

La réaction (c') est réalisée dans les conditions suivantes : TMSOTf, tamis moléculaire 4 Angstrom, CH2C12.

Le disaccharide 14 est transformé en disaccharides 15 et 16 lesquels sont condensés pour obtenir le tetrasaccharide clé 17.

La réaction (d') est réalisée dans les conditions suivantes : NBS, eau, acétone, puis CC13CN, DBU, CH2C12- La réaction (e') est réalisée dans les conditions suivantes : MeONa, MeOH.

La réaction (f') est réalisée dans les conditions suivantes : 1) BF3. Et20, tamis moléculaire 4 Angstrom, CH2C12 ; 2) MeONa/MeOH.

Le tetrasaccharide clé 17 peut tre ou non fonctionalisé en l'un des composés 18 ou 19 et donne après

déprotection le tétramannoside de formule (II) dans laquelle R est H ou-(CH2) 8-CO2Me.

La réaction (g') est réalisée dans les conditions suivantes : NBS, TfOH, 8-methoxycarbonyloctanol, tamis moléculaire 4 Angstrom, CH2Cl2,-15°C.

La réaction (h') est réalisée dans les conditions suivantes : NBS, eau, acétone.

La réaction (i') est réalisée dans les conditions suivantes : 1-NaOH, THF, eau, 2-H2, Pd/C, MeOH.

La réaction (j') est réalisée dans les conditions suivantes : H2, Pd/C, MeOH.

II-Protocole expérimental.

Les composés 12 (F Yamazaki, S Sato, T Nukuda, Y. Ito, T Ogawa, Carbohydr. Res. 201 (1990) 31-50) et 13 (Y-M. Zhang, J.-M. Mallet, P. Sinay. Carbohydr. Res. 236, (1992), 73-88.) sont préparés selon la littérature à partir de 1'orthoester 11 (N. E. Franks R Montgomery, Carbohydr. Res. 6 (1968) 286-98) 1) Phényl 2-0- (2-0-acétyl-3, 4, 6-tri-O-benzyl-a-D- mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl-1-thio-a-D- mannopyranoside (14).

Un mélange de 12 (F Yamazaki, S Sato, T Nukuda, Y. Ito, T Ogawa, Carbohydr. Res. 201 (1990) 31-50) (9. 7 g, 15. 24 mmol, 1. 2 éq), 13 (Y-M. Zhang, J.-M. Mallet, P.

Sinay. Carbohydr. Res. 236, (1992), 73-88) (6. 88 g, 12. 7 mmol, 1 éq) et 17 g de tamis moléculaire 4A en poudre dans 100 mL de dichlorométhane anhydre est agité sous atmosphère d'argon. Après 30 mn d'agitation, le milieu reactionnel est refroidi à-10°C. Du trifluorométhanesulfonate de

triméthylsilyle (0. 44 mL, 1. 9 mmol, 0. 15 éq) sont alors additionnés. 30mn plus tard, la solution est neutralisée par une solution aqueuse d'hydrogénocarbonate de sodium. La phase organique est ensuite lavée par une solution de saumure, séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée. La chromatographie du brut sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=6/1) fournit 14 (9. 3 g, 72%) sous la forme d'une sirop incolore. [a] D +93 (c 0. 55, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDCl3) : # 7.48-7.25m(, 35H, arom.), 5. 69 (d, 1H, J 1-2=1. 62Hz, H-1A), 5. 58 (dd, 1H, J 2-1=1. 7Hz et J 2-3=3.3Hz, H-2B), 5. 13 (d, 1H, J 1-2=1.7Hz, H-1B), 4. 94 (d, 1H, J gem=10. 8Hz, CHPh), 4. 87 (d, 1H, J gem=10. 8Hz, CHPh), 4. 79 (d, 1H, J gem=11.8Hz, CHPh), 4. 75 (d, 1H, J gem=11. 8Hz, CHPh), 4. 71 (d, 1H, J gem=10. 9Hz, CHPh), 4. 69 (d, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 64 (d, 1H, J gem=10. 8Hz, CHPh), 4. 6 (d, 1H, J gem=12.3Hz, CHPh0, 4. 52 (d, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 47 (d, 1H, J gem=10. 8Hz, CHPh), 4. 45 (d, 1H, J gem=10. 9Hz, CHPh), 4. 43 (d, 1H, J gem=12. 3Hz, CHPh), 4. 33 (ddd, 1H, J 5-4=9. 3Hz, J 5-6a=1. 7Hz et J 5-6b=5. 2Hz, H-5A), 4. 28 (dd, 1H, J 2-1=1. 62Hz et J 2-3=2. 8Hz, H-2A), 4. 03 (dd, 1H, J 3-2=3. 3Hz et J 3-4=9. 4Hz, H-3B), 4. 03-3. 97 (m, 1H, H-5B), 3. 99 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 3Hz, H-4A), 3. 94 (dd, 1H, J 3-2=2. 8Hz et J 3-4=9. 3Hz, H-3A), 3. 88 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 4Hz, H-4B), 3. 88 (dd, 1H, J 6b-6a=ll. lHz et J 6b-5=5. 2Hz, H-6Ab), 3. 77 (dd, 1H, J 6b-6a=ll. lHz et J 6b- 5=1. 7Hz, H-6Aa), 3. 74 (dd, 1H, J 6b-6a=10. 6Hz et J 6b- 5=4. 5Hz, H-6Bb), 3. 77 (dd, 1H, J 6b-6a=10. 6Hz et J 6b- 5=1. 7Hz, H-6Ba), 2. 19 (s, 3H,-C : O-OCH3).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 170. 2 (-C : O-OCH3), 138. 4, 138. 3, 138. 27, 138, 137. 98, 137. 9, 131. 6 (7 C arom.), 129-127. 3 (35 CH arom), 99. 7 (1JCH=169.2Hz, C-1B), 87. 1 (1JcH=168. 8Hz, C-1A), 79. 89 (C-3A), 78 (C-3B), 76. 6 (C-2A), 75. 2 (CH2Ph), 75 (CH2Ph), 74. 7 (C-4A), 74. 3 (C-4B), 73. 1 (2 CH2Ph), 72. 8 (C-5A), 72. 2 (CH2Ph), 71. 9 (CH2Ph), 71. 9 (C-5B), 69. 1 (C- 6A), 68. 7 (C-2B), 68. 5 (C-6B), 21. 1 (-C : O-OCH3).

Spectre de masse : m/z 1034. 4 (M+NH4) +.

Analyse pour C62H6401lS (1017. 256) : calculée C : 73. 20 H : 6. 35

trouvée C : 72. 98 H : 6. 65 2) 0- [2-0- (2-0-acétyl-3, 4, 6-tri-0-benzyl-a-D- mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-0-benzyl-a-D-mannopyranosyl et ß- D-mannopyranosyl] trichloroacétimidate (15).

14 (3 g, 2. 95 mmol, 1 éq) est dissous dans 150 mL d'un mélange acétone/eau : 95/5. A cette solution sont ajoutés 2. 6 g (11. 8 mmol, 4 éq) de N-bromosuccinimide. Après 15 mn d'agitation, une solution d'hydrogénocarbonate de sodium est ajoutée et l'acétone est évaporée sous vide. Le résidu est repris par du dichlorométhane et lavé par une solution de saumure. Une flash chromatographie sur gel de silice du brut fournit 2. 37 g (Rdt=87%) du produit OH libre en position réductrice sous forme d'une huile incolore. Cette huile ainsi obtenue est dissoute dans 10 mL de dichlorométhane anhydre. 3. 08 mL (12 éq) de trichloroacétonitrile sont ajoutés, la solution est refroidie à 0°C et 115 RL (0. 3 éq) de 1, 8-diazabicyclo- [5. 4. 0] undec-7-ène sont alors additionnés au milieu. Après 20 mn, la solution est injectée directement sur un gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=3/1) et 2. 2 g (Rdt=81% sur les deux étapes) du composé 15a très majoritaire (α/ß=92/8) sont ainsi obtenus sous la forme d'une huile incolore.

1H-R. M. N. (400MHz, CDC13) du produit a-0-Imidate : 88. 55 (s, 1H, C=NH), 7. 39-7. 25 (n, 30H, arom.), 6. 36 (d, 1H, J 1- 2=1. 95Hz, H-1A), 5. 67 (dd, 1H, J 2-1=1. 6Hz et J 2-3=3. 4Hz, H-2B), 5. 2 (d, 1H, J 1-2=1. 6Hz, H-1B), 4. 95 (d, 1H, J gem=10. 6Hz, CHPh), 4. 89 (d, 1H, J gem=10. 8Hz, CHPh), 4. 81 (d, 1H, J gem=11-9Hz, CHPh), 4. 75 (d, 1H, J gem=12Hz,

CHPh), 4. 73 (d, 1H, J-gem=11. 9Hz, CHPh), 4. 71 (d, 1H, J gem=10. 8Hz, CHPh), 4. 7 (d, 1H, J gem=12. 6Hz, CHPh), 4. 65 (d, 1H, J gem=10. 6Hz, CHPh), 4. 55 (d, 1H, J gem=12. 6Hz, CHPh), 4. 52 (d, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 51 (d, 1H, J gem=10. 8Hz, CHPh), 4. 45 (d, 1H, J gem=10. 8Hz, CHPh), 4. 13 (dd, 1H, J 2-1=1. 95Hz et J 2-3=3. 3Hz, H-2A), 4. 09 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9.7Hz, H-4A), 4. 08-3. 97 (m, 5H, H-5A, H-5B, H-3A, H-3B et H-4B), 3. 89 (dd, 1H, J-6b-6a=11. 5Hz et J 6b- 5=3. 6Hz, H-6Ab), 3. 86 (dd, 1H, J 6b-6a=11. 6Hz et J 6b- 5=4. lHz, H-6Bb), 3. 78 (dd, 1H, J 6b-6a=11.5Hz et J 6b- 5=l. lHz, H-6Aa), 3. 75 (dd, 1H, J 6b-6a=11. 6Hz et J 6b- 5=lHz, H-6Ba), 2. 2 (s, 3H,-C : O-OCH3).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 170. 25 (-C : O-OCH3), 159. 98 (- C=NH), 138. 4, 138. 3, 138. 15, 138. 07, 137. 9, 137. 88 (6 C arom.), 128. 4-127. 4 (30 CH arom), 99. 5 (C-1B), 96. 7 (C-1A), 78. 5 (C-3A), 78. 1 (C-3B), 75. 4 (CH2Ph), 75. 1 (CH2Ph), 74. 7 (C-5B), 74. 1 (C-4B), 73. 8 (C-4A), 73. 3 (CH2Ph), 73. 2 (CH2Ph), 73 (C-2A), 72. 4 (CH2Ph), 71. 97 (CH2Ph), 71. 9 (C- 5A), 68. 62 (C-2B), 68. 58 (C-6B), 68. 51 (C-6A), 21. 15 (-C : O- OCH3).

Pas d'analyse élémentaire pour ces composés peu stables.

3) Phényl 2-O-(3, 4, 6-tri-0-benzyl-a-D-manno pyranosyl)- 3, 4, 6-tri-O-benzyl-1-thio-a-D-mannopyranoside (16).

14 (6 g, 5. 9mmol) est dissous dans 40 mL d'un mélange toluène/méthanol : 1/1. A cela est ajouté du sodium (cat.).

Après 15 mn, la solution est neutralisée par de la résine amberlite IR 120 (H+), filtrée et concentrée. Une chromatographie sur gel de silice (élution : cyclohexane/ acétate d'éthyle=3/1) du brut fournit 16 (5. 45 g, 95%) sous forme d'un sirop incolore. [a] D +93. 6 (c 0. 51, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDCl3) : # 7. 5-7. 2 (m, 35H, arom.), 5. 76 (d,

1H, J 1-2=1. 6Hz, H-1A), 5. 22 (d, 1H, J 1-2=l. 6Hz, H-1B), 4. 95 (d, 1H, J gem=10.7Hz, CHPh), 4. 85 (d, 1H, J gem=10. 9Hz, CHPh), 4. 77 (s, 2H, CH2Ph), 4. 75 (d, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 66 (d, 1H, J gem=10.7Hz, CHPh), 4. 65 (d, 1H, J gem=11. 3Hz, CHPh), 4. 6 (d, 1H, J gem=11.3Hz, CHPh), 4. 57 (d, 1H, J gem=12. 4Hz, CHPh), 4. 55 (d, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 52 (d, 1H, J gem=10.9Hz, CHPh), 4. 45 (d, 1H, J gem=12.4Hz, CHPh), 4. 37-4. 33 (m, 1H, H-5A), 4. 34 (dd, 1H, J 2-1=1. 6Hz et J 2-3=2. 7Hz, H-2A), 4. 21-4. 18 (m, 1H, H-2B), 4. 01 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9.3Hz, H-4A), 4. 03-3. 98 (m, 1H, H- 5B), 3. 96 (dd, 1H, J 3-2=2. 7Hz et J 3-4=9. 3Hz, H-3A), 3. 95 (dd, 1H, J 6b-6a=11. 2Hz et J 6b-5=4. 6Hz, H-6Ab), 3. 93 (dd, 1H, J 3-2=3. lHz et J 3-4=9. 4Hz, H-3B), 3. 87 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9.4Hz, H-4B), 3. 8 (dd, 1H, J 6b-6a=11. 2Hz et J 6b- 5=1. 6Hz, H-6Aa), 3. 71 (dd, 1H, J 6b-6a=10. 6Hz et J 6b- 5=4. 9Hz, H-6Bb), 3. 64 (dd, 1H, J 6b-6a=10. 6Hz et J 6b- 5=1. 9Hz, H-6Ba), 2. 53 (d, 1H, J OH-2=1.6Hz, OH).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 138. 5, 138. 3, 138. 2, 138, 137. 9, 137. 86, 131. 5 (7 C arom.), 128. 9-127. 3 (35 CH arom), 101. 2 (C-1B), 87. 2 (C-1A), 79. 99 (C-3A), 79. 9 (C-3B), 76. 5 (C- 2A), 75. 1 (CH2Ph), 75 (CH2Ph), 74. 8 (C-4A), 74. 2 (C-4B), 73. 13 (CH2Ph), 73. 1 (CH2Ph), 72. 8 (C-5A), 72. 3 (CH2Ph), 72. 1 (CH2Ph), 71. 6 (C-5B), 69. 1 (C-6A), 68. 5 (C-6B), 68. 47 (C-2B).

Spectre de masse : m/z 992. 6 (M+NH4) +.

Analyse pour C60H62O10S (975. 218) : calculée C : 73. 89 H : 6. 408 trouvée C : 74. 15 H : 6. 90 4) Phényl 2-O- (2-0- (2-O- (3, 4, 6-tri-O-benzyl-a-D- mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl-a-D-mannopyranosyl)- 3, 4, 6-tri-0-benzyl-a-D-mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl- 1-thio-a-D-mannopyranoside (17).

Un mélange de 16 (200 mg, 187 pmol, 1 éq), 15 (364 mg, 374 pool, 2 éq), de 600 mg de tamis moléculaire 4 A dans 6 mL de dichlorométhane anhydre est agité durant 30 mn sous atmosphère d'argon et refroidi à-10°C. Puis 71 pL (3 éq) d'éthérate de trifluorure de bore sont additionnés. Après 40 mn à-10°C, l'ensemble est neutralisé par une solution d'hydrogénocarbonate de sodium. Après une filtration sur un lit de célite, la phase organique est lavée par une solution de saumure, séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous vide. Le résidu est chromatographié (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=6/1) et fournit 211 mg (Rdt=60%) d'une huile incolore. L'analyse par 1H-R. M. N montre la présence de deux produits, l'un de stéréochimie a au niveau de la liaison nouvellement créée et l'autre ß. Ceux-ci sont malheureusement non séparables par chromatographie sur gel de silice. Le mélange est alors dissous dans un mélange toluène/méthanol et du sodium (cat.) y est ajouté. Après 15 mn, la solution est neutralisée par de la résine amberlite IR 120 (H+), filtrée et évaporée sous vide. Le résidu est chromatographié (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=5/1) et fournit le produit 17 (153 mg, 71%) Caractéristiques de 17 : [a] D +48. 7 (c 0. 36, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDCl3) : # 7. 51-7. 23ro, 60H, arom.), 5. 83 (d, 1H, J 1 2=1-4Hzt H-1A), 5. 35 (d, 1H, J 1-2=1.4Hz, H-1B ou H-1C), 5. 3 (d, 1H, J 1-2=1.6Hz, H-1B ou H-1C), 5. 21 (d,

1H, J 1 2=1-5Hzs H-1D), 4. 91 (d, 1H, J gem=10. 7Hz, CHPh), 4. 9 (d, 1H, J gem=10. 9Hz, CHPh), 4. 89 (d, 1H, J gem=10. 6Hz, CHPh), 4. 84 (d, 1H, J gem=10. 8Hz, CHPh), 4. 71 (2d, 2H, J gem=12. 2Hz, 2 CHPh), 4. 69 (d, 1H, J gem=11. 3Hz, CHPh), 4. 67 (d, 1H, J gem=11. 3Hz, CHPh), 4. 65 (s, 2H, CH2Ph), 4. 64 (d, 1H, J gem=11-3Hz, CHPh), 4. 61 (d, 1H, J gem=10. 9Hz, CHPh), 4. 59 (d, 1H, J gem=12. 3Hz, CHPh), 4. 56 (3d, 3H, 3 CHPh), 4. 54 (d, 1H, J gem=12. 2Hz, CHPh), 4. 53 (d, 1H, J gem=11. 3Hz, CHPh), 4. 51 (d, 1H, J gem=10. 8Hz, CHPh), 4. 49 (d, 1H, J gem=11-9Hz, CHPh), 4. 47 (d, 1H, J gem=12. 2Hz, CHPh), 4. 46 (d, 1H, J gem=12. 8Hz, CHPh), 4. 36 (d, 1H, J gem=11. 9Hz, CHPh), 4. 36-4. 34 (m, 2H, H-2A et H-5A, B, C ou D), 4. 24 (d, 1H, J gem=12. 3Hz, CHPh), 4. 21 (m, 1H, H-2D), 4. 19 (dd, 1H, J 2-1=1. 6Hz et J 2-3=2. 4Hz, H-2B ou H-2C), 4. 17 (dd, 1H, J 2-1=1. 4Hz et J 2-3=2. 4Hz, H-2B ou H-2C), 4. 04-3. 95 (m, 6H, H-3D, H-3B ou H-3C, H-4A, B, C ou D, 3*H- 5A, B, C u D), 3. 97-3. 88 (m, 4H, H-3A, H-3B ou H-3C et 2*H- 4A, B, C ou D), 3. 83-3. 56 (m, 5H, H-4A, B, C ou D, H-6A, H- 6B, H-6C et H-6D), 2. 47 (d, 1H, J OH-2=2. 25Hz, OH).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 138. 47*2, 138. 44, 138. 4*2, 138. 32*2, 138. 29, 138. 2, 138. 05, 138, 137. 9, 134. 2 (13 C arom.), 128. 8-127. 2 (60 CH arom), 101. 4 (C-1B ou C-1C, JcH=171. 7Hz ou 1JCH=170. 9Hz), 101 (C-1B ou C-1C et C-1D, lJcH=171. 7Hz ou 1JCH=170. 9Hz), 87. 1 (C-lA, 1JCH=169. 1Hz), 80, 79. 6, 79. 4, 79 (4*C-3), 77. 3 (C-2A), 75. 5 (C-2B ou C-2C), 75. 1 (CH2Ph), 75. 07 (C-2B ou C-2C), 74. 94 (CH2Ph), 74. 85*2, 74. 77, 72 (4*C-4), 73. 26 (CH2Ph), 73. 18 (CH2Ph), 73. 1 (CH2Ph), 72. 8 (CH2Ph), 72. 6, 72. 26, 72. 22, 71. 5 (4*C-5), 72. 3 (CH2Ph), 72 (CH2Ph), 71. 8 (CH2Ph), 69. 4, 69. 2, 68. 9, 68. 7 (4*C-6), 68. 4 (C-2D).

Spectre de masse : m/z 1861. 9 (M+Na) +.

Analyse pour Cn4Hn802oS (1840. 258) calculée C : 74. 4 H : 6. 463 trouvée C : 74. 3 H : 6. 54 5) 8-méthoxycarbonyloctyl 2-0- (2-0- (2-0- (3, 4, 6-tri-O- benzyl-a-D-mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl-a-D- mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl)- 3, 4, 6-tri-O-benzyl-a-D-mannopyranoside (18a)

et 8-méthoxycarbonyloctyl 2-O-(2-O-(2-O-(3, 4, 6-tri-O-benzyl-a- D-mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl)- 3, 4, 6-tri-O-benzyl-a-D-mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl- P-D-mannopyranoside (18b).

Pour le protocole expérimental, voir le composé 10.

A partir de 268 mg (146 Rmol) du composé 17, les deux diastéréomères 18a a-O-connecteur (101 mg, 36%) et 18b ß-O- connecteur (100 mg, 36%) sont obtenus après une chromatographie sur gel de silice (élution : cyclohexane/ acétate d'éthyle=4/1) dans un rapport a/ß=1/1.

Caractéristique de 18a a-o-connecteur : [a] D +35 (c 0. 2, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDCl3) : # 7. 36-7. 23 (m, 55H, arom.), 5. 3 (d, 1H, J 1-2=1. 2Hz, H-1B ou H-1C), 5. 27 (d, 1H, J 1- 2=1. 6Hz, H-1B ou H-1C), 5. 18 (d, 1H, J 1-2=1. 4Hz, H-1D), 4. 99 (d, 1H, J 1-2=1. 4Hz, H-1A), 4. 89 (2d, 2H, J gem=10. 9Hz, 2 CHPh), 4. 86 (d, 1H, J gem=10.9Hz, CHPh), 4. 82 (d, 1H, J'gem=10. 5Hz, CHPh), 4. 72 (2d, 2H, 2 CHPh), 4. 67 (d, 1H, J gem=12. 2Hz, CHPh), 4. 63-4. 58 (m, 8H, 8 CHPh), 4. 56 (d, 1H, J gem=12. 3Hz, CHPh), 4. 55 (d, 1H, J gem=10.9Hz, CHPh), 4. 54 (d, 1H, J gem=10. 9Hz, CHPh), 4. 49 (d, 1H, J gem=10.5Hz, CHPh), 4. 48 (d, 1H, J gem=11.5Hz, CHPh), 4. 47 (d, 1H, J gem=11. 2Hz, CHPh), 4. 4 (d, 1H, J gem=12. 2Hz, CHPh), 4. 35 (d, 1H, J gem=11. 5Hz, CHPh), 4. 21

(d, 1H, J gem=12. 3Hz, CHPh), 4. 2-4. 19 (m, 1H, H-2D), 4. 185 (dd, 1H, J 2-1=1. 6Hz et J 2_3=2. 5Hz, H-2B ou H-2C), 4. 15 (dd, 1H, J 2-1=1. 2Hz et J 2-3=2. lHz, H-2B ou H-2C), 4. 03 (dd, 1H, J 2-1=1. 4Hz et J 2-3=2. 5Hz, H-2A), 4. 01-3. 89 (m, 9H, 4*H-3, 3*H-5A, B, C ou D, 2*H-4A, B, C ou D), 3. 84-3. 72 (m, 5H, 2*H-4A, B, C ou D, 1*H-5A, B, C ou D, 2*H-6A, B, C ou D), 3. 71 (s, 3H,-C : O-OCH3), 3. 67-3. 51 (m, 2H, 2*H-6A, B, C ou D), 3. 60 (dt, 1H, J CH-CH2=6. 8Hz et J gem=9. 5Hz,- O-CH-CH2-), 3. 28 (dt, 1H, J CH-CH2=6. 6Hz et J-gem=9. 5Hz,- O-CH-CH2-), 2. 44 (br, 1H, OH), 2. 34 (t, 2H, J 3-2=7. 6Hz,- CH2C : O-OCH3), 1. 69-1. 62 (m, 2H,-CH2-), 1. 55-1. 48 (m, 2H,- CH2-), 1. 37-1. 27 (m, 8H, -(CH2)4-).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 174. 2 (-C : O-OCH3), 138. 6, 138. 55, 138. 5*4, 138. 44, 138. 36*2, 138. 3, 138. 1, 138 (12 C arom.), 128. 4-127. 26 (55 CH arom), 101. 1 (C-1B ou C-1C, 1JCH=171. 7Hz ou 1JCH=172. 9Hz), 100. 9 (C-1B ou C-1C et C-1D, lJcH=171. 7Hz ou 1JCH=172. 9Hz), 98. 7 (C-1A, 1JcH=168. 5Hz), 80, 79. 4*2, 79. 1 (4*C-3), 75. 8 (C-2A), 75. 6 (C-2B ou C-2C), 75. 13 (C-2B ou C-2C), 75. 1 (2*CH2Ph), 74. 96 (CH2Ph), 73. 9*2, 74. 8, 74. 3 (4*C-4), 73. 3 (CH2Ph), 73. 2 (CH2Ph), 73. 18 (2*CH2Ph), 72. 33 (2*CH2Ph), 72. 3, 72, 71. 76, 71. 73 (4*C-5), 72 (CH2Ph), 71. 76 (CH2Ph), 71. 73 (CH2Ph), 69. 6, 69. 5, 63. 35, 68. 8 (4*C-6), 68. 5 (C-2D), 67. 65 (-O-CH2-), 69. 8 (CH2Ph), 51. 4 (-C : O-OCH3), 34 (-CH2-C : O-O-CH3), 29. 4, 29. 2, 29. 1, 29, 26, 24. 9 (-CH2-) Spectre de masse : m/z 1934. 8 (M+NH4) +.

Analyse pour C118Hl32023 (1918. 35) : calculée C : 73. 88 H : 6. 93 trouvée C : 73. 76 H : 7. 12 Caractéristique de 18b (3-0-connecteur [α] D +2 (c 0. 2, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDC13) : 5 7. 38-7. 25 (m, 55H, arom.), 5. 39 (d, 1H, J 1-2=1.5Hz, H-1B ou H-1C), 5. 34 (d, 1H, J 1- 2=1. 5Hz, H-1B ou H-1C), 5. 23 (d, 1H, J 1-2=1. 45Hz, H-1D), 4. 9 (d, H, J gem=10. 6Hz, CHPh), 4. 89 (d, 1H, J gem=10. 9Hz, CHPh), 4. 87 (d, 1H, J gem=10. 6Hz, CHPh), 4. 82 (d, H, J gem=12. 3Hz, CHPh), 4. 81 (d, 1H, J gem=10. 1Hz, CHPh), 4. 79 (d, 1H, J gem=11. 5Hz, CHPh), 4. 69 (d, 1H, J gem=12. 2Hz, CHPh), 4. 68-4. 55 (m, 11H, 11 CHPh), 4. 54 (d, 1H, J

gem=11. 7Hz, CHPh), 4. 52 (d, 1H, J gem=10. 6Hz, CHPh), 4. 51 (d, 1H, J gem=11-5Hz, CHPh), 4. 48 (d, 1H, J gem=10. 1Hz, CHPh), 4. 41-4. 38 (m, 1H, H-5B ou H-5C), 4. 38 (d, 1H, J gem=12. 2Hz, CHPh), 4. 3 (s, 1H, H-1A), 4. 27 (d, 1H, J gem=12. 4Hz, CHPh), 4. 25-4. 24 (m, 2H, H-2B et H-2C), 4. 2- 4. 19 (m, 1H, H-2D), 4. 13 (d, 1H, J 2-3=2. 3Hz, H-2A), 4. 09 (dd, 1H, J 3-2=2. 8Hz et J 3-4=9. 6Hz, H-3B ou H-3C), 4. 05 (dd, 1H, J 3-2=2. 8Hz et J 3-4=9. lHz, H-3B ou H-3C), 4. 047- 3. 88 (m, 7H, H-3D, 3*H-4B, B ou D, 3*H-5B, C ou D), 3. 92- 3. 89 (m, 1H,-0-CH-CH2-), 3. 8-3. 5 (m, 8H, H-4A, 4*H-6A, B, C et D,-C : O-OCH3), 3. 48 (dd, 1H, J 3-2=2. 5Hz et J 3- 4=9. 4Hz, H-3A), 3. 44-3. 39 (m, 2H, H-5A et-O-CH-CH2-), 2. 44 (br, 1H, OH), 2. 34 (t, 2H, J 3-2=7. 6Hz,-CH2C : O-OCH3), 1. 67-1. 57 (m, 4H,- (CH2) 2-), 1. 39-1. 28 (m, 8H,- (CH2) 4-).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 174. 2 (-C : O-OCH3), 138. 9, 138. 77, 138. 66, 138. 65, 138. 56*2, 138. 37, 138. 35, 138. 12*2, 138. 07, 137. 9 (12 C arom.), 128. 4-127. 2 (55 CH arom), 100. 8 (C-1D), 100. 5 (C-1B ou C-1C), 99. 9 (C-1A), 99. 5 (C-1B ou C-1C), 82. 3 (C-3A), 80 (C-3D), 79. 7 (C-3B ou C-3C), 79. 5 (C-3B ou C-3C), 75. 6 (C-5A), 75. 3 (C-2B ou C-2C), 75. 02 (CH2Ph), 75*2 (CH2Ph), 74. 93 (C-4A), 74. 9 (C-2B ou C-2C), 74. 88, 74. 84, 74. 2 (C-4B, C-4C, C-4D), 73. 35 (CH2Ph), 73. 23 (CH2Ph), 73. 21 (CH2Ph), 73. 17 (CH2Ph), 73. 12 (CH2Ph), 72. 5 (C-2A), 72. 34 (CH2Ph), 72. 2, 71. 6, 71. 5 (C-5B, C-5C, C-5D), 72. 1 (CH2Ph), 72 (CH2Ph), 71. 8 (CH2Ph), 69. 7, 69. 4, 63. 37, 69. 2 (4*C-6), 68. 48 (-O-CH2-), 68. 46 (C-2D), 51. 4 (-C : 0- OCH3), 34 (-CH2-C : O-O-CH3), 29. 6, 29. 2, 29. 16, 29. 1, 26, 24. 9 (-CH2-) Spectre de masse : m/z 1934. 95 (M+NH4) +.

Analyse pour C118Hl32023 (1918. 35) : calculée C : 73. 88 H : 6. 93 trouvée C : 73. 84 H : 7. 1 6) 8-carboxyloctyl 2-0- (2-0- (2-0- (a-D-mannopyranosyl)-a-D- mannopyranosyl)-a-D-mannopyranosyl)-a-D-mannopyranoside et P-D-mannopyranoside (II, R= connecteur).

A partir des deux isomères 18a et 18b, deux composés (II R= connecteur) ont été préparés :

-Composé a-aglycone Etape 1 : saponification Pour le protocole expérimental, voir l'étape 2 de I (R=connecteur).

18a (90 mg, 47 Rmol), donne 70 mg (78%) de 8- carboxyloctyl 2-0- (2-0- (2-0- (3, 4, 6-tri-O-benzyl-_-D- mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-0-benzyl---D-mannopyranosyl)- 3, 4, 6-tri-O-benzyl-_-D-mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl- --D-mannopyranoside après une chromatographie sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=2/1) : [_] D +17 (c 1, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDC13) : 7. 36-7. 23 (m, 55H, arom.), 5. 3 (d, 1H, J 1-2=1. 2Hz, H-1B ou H-1C), 5. 27 (d, 1H, J 1- 2=1. 6Hz, H-1B ou H-1C), 5. 18 (d, 1H, J 1-2=1. 4Hz, H-1D), 4. 99 (d, 1H, J 1-2=1. 4Hz, H-1A), Absence du pic caractéristique du méthyle de 1'ester méthylique.

Spectre de masse : m/z 1920. 86 (M+NH4+) +.

Analyse pour C117H130023 (1904. 32) : calculée C : 73. 79 H : 6. 88 trouvée C : 73. 36 H : 7. 12 Etape 2 : hydrogénolyse Pour le protocole, voir étape 3 de I (R=connecteur).

A partir de 48 mg (25 mol) du précurseur, 20 mg (Rdt=95%) sont obtenus pour le composé-0-connecteur II (R= connecteur).

1H-R. M. N. (400MHz, D20) du compose _-0-connecteur :-5. 25

(d, 1H, J 1-2=1. 6Hz, H-1B ou H-1C), 5. 24 (d, 1H, J 1- 2=1. 5Hz, H-1B ou H-1C), 5. 04 (d, 1H, J 1-2=1. 3Hz, H-1D), 4. 99 (d, 1H, J 1-2=2Hz, H-1A), 3. 69-3. 63 (m, 1H,-O-CH-CH2- ), 3. 48 (dt, 1H, J CH-CH2=6. 2Hz et J gem=9. 9Hz,-0-CH-CH2- ), 2. 22 (t, 2H, J 3-2=7. 5Hz,-CH2COOH), 1. 58-1. 48 (m, 4H,- (CH2) 2-), 1. 3-1. 24 (m, 8H,- (CH2) 4-).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 102. 5, 100. 96, 100. 91, 98. 29 (4 C- 1).

Spectre de masse (FAB) : calculée C33H5g023Na : m/z 845. 32 obtenue : 845. 37 -Composé ß-aglycone Etape 1 : saponification Pour le protocole expérimental, voir l'étape 2 de I (R=connecteur).

18b (89 mg, 46. 4 Rmol) donne 64 mg (72%) de 8- carboxyloctyl 2-O-(2-O-(2-O-(3, 4, 6-tri-O-benzyl-a-D- mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl-a-D-mannopyranosyl)- 3, 4, 6-tri-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl)- 3, 4, 6-tri-O-benzyl- ß-D-mannopyranoside : [α]D + 19 (c 1, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDCl3) : # 7. 38-7. 25 (m, 55H, arom.), 5. 39 (d, 1H, J 1-2=1. 5Hz, H-1B ou H-1C), 5. 34 (d, 1H, J 1- 2=1. 5Hz, H-1B ou H-1C), 5. 23 (d, 1H, J 1-2=1.45Hz, H-1D), 4. 3 (s, 1H, H-1A), Absence du pic caractéristique du méthyle de l'ester méthylique.

Spectre de masse : m/z 1920. 9 (M+NH4+) +.

Analyse pour C117H130023 (1904. 32) : calculée C : 73. 79 H : 6. 88 trouvée C : 73. 37 H : 7. 28 Etape 2 : hydrogénolyse Pour le protocole, voir étape 3 de I (R=connecteur).

18 mg (92%) II (R= connecteur) ß-O-connecteur sont obtenu à partir de 45 mg (23. 6 Rmol) : 1H-R. M. N. (400MHz, D20) du composé P-0-connecteur : 85. 33 (d, 1H, J 1-2=1.3Hz, H-1B ou H-1C), 5. 24 (d, 1H, J 1- 2=1. 8Hz, H-1B ou H-1C), 4. 98 (d, 1H, J 1 2=1-9Hzt H-1D), 4. 63 (s, 1H, H-1A), 3. 84-3. 79 (m, 1H,-O-CH-CH2-), 3. 53 (dt, 1H, J CH-CH2=5. 8Hz et J gem=9.9Hz, -O-CH-CH2-), 2. 22 (t, 2H, J 3-2=7. 5Hz,-CH2COOH), 1. 59-1. 49 (m, 4H,- (CH2) 2- ), 1. 3-1. 24 (m, 8H, - (CH2)4-).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 102. 5, 100. 95, 100. 91, 99. 99 (4 C- 1).

Spectre de masse (FAB) : calculée C33HsgO23Na : m/z 845. 32 obtenue : 845. 4 7) 2-O-(2-O-(2-O-(3, 4, 6-tri-O-benzyl-a-D-mannopyranosyl)- 3, 4, 6-tri-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl- a-D-mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl-D-mannopyranose Pour le protocole expérimental, voir l'étape 2 de I (R=H).

A partir de 105 mg (57 Rmol) du composé 17, 84 mg (85%) du composé 19 (a/ß=87/13) sont obtenus après une chromatographie sur gel de silice avec élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=3/1 puis 2/1.

1H-R. M. N. (400MHz, CDC13) du composé a : 57. 4-7. 27 (m, 60H, arom.), 5. 38-5. 37 (m, 1H, H-1A), 5. 34 (d, 1H, J 1-2=1.5Hz, H-1B ou H-1C), 5. 32 (d, 1H, J 1-2=1.7Hz, H-1B ou H-1C), 5. 23 (d, 1H, J 1-2=1. 6Hz, H-1D), 2. 83 (br, 1H, OH), 2. 51 (br, 1H, OH).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 100. 94 (C-1D), 100. 9 (C-1B ou C- 1C), 100. 85 (C-1B ou C-1C), 93. 3 (C-1A).

Spectre de masse : m/z 1769. 54 (M+Na) +.

Analyse pour C1l7Hl30o23 (1748. 1) : calculée C : 74. 2 H : 6. 57 trouvée C : 74. 15 H : 6. 7 8) 2-0- (2-0- (2-0- (a-D-mannopyranosyl)-a-D-manno pyranosyl)- a-D-mannopyranosyl)-D-mannopyranose II (R=H).

Pour le protocole expérimental, voir l'étape 3 du composé I (R=connecteur).

30 mg (18 Rmol) du composé précédent donnent 18 mg (Rdt=95%) du composé II (R=H) après lyophilisation.

1H-R. M. N. (400MHz, D20) du composé a-OH : a5. 23 (s, 1H, H- 1A), 5. 15 (se, 2H, H-1B et H-1C), 4. 91 (d, 1H, J1-2=1.6Hz, H-1D).

Spectre de masse : calculée C24H42021Na : m/z 689. 21 obtenue 689. 41 Exemple 3 : Préparation de D-Man a (1-3) D-Man a (1-2) D-Man α (1-2) D-Man a (1-2), de formule (III).

1-Schéma réactionnel.

La figure 3 en annexe représente le schéma réactionnel de la préparation de D-Man a (1-3) D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) D-Man a (1-2) de formule (III). Celui-ci est préparé par condensation d'un bloc a (1-3) avec un groupe partant SPh et un bloc α (1-2) dont l'un avec connecteur conformément aux réactions (a"') à (d"') ci-dessous.

La réaction (a"') est réalisée dans les conditions suivantes : TfOTMS, tamis moléculaire 4 Angstrom, CH2C12,- 20°C.

La réaction (b"') est réalisée dans les conditions suivantes : MeONa, MeOH.

La réaction (c"') est réalisée dans les conditions

suivantes : NIS, TfOH,, tamis moléculaire 4 Angstrom, CH2Cl2,-20°C.

La réaction (d"') est réalisée dans les conditions suivantes : 1-NaOH, THF, eau, 2-H2, Pd/C, MeOH, AcOEt.

II-Protocole expérimental.

Les composés 22 (Y-M. Zhang, J.-M. Mallet, P.

Sinay. Carbohydr. Res. 236, (1992), 73-88.) et 21 (P. J.

Garegg, H. Hultberg, T Norberg, Carbohydr. Res. 96 (1981) 59-64) sont préparés selon les protocoles de la littérature.

1) 8-méthoxycarbonyloctyl 2-0- (2-0-benzoyl-3, 4, 6-tri-O- benzyl-a-D-mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl-a-D- mannopyranoside (23).

430 mg (665 Rmol, 1 éq) de phényl 2-O-benzoyl-3, 4, 6-tri-O- benzyl-1-thio-a-D-mannopyranoside (22) (Y-M. Zhang, J.-M.

Mallet, P. Sinay. Carbohydr. Res. 236, (1992), 73-88.), 412 mg (1 éq) de 8-méthoxycarbonyl 3, 4, 6-tri-O-benzyl-1-a- D-mannopyranoside (21) (P. J. Garegg, H. Hultberg, T Norberg, Carbohydr. Res. 96 (1981) 59-64) et 1 g de tamis moléculaire sont mis en suspension dans 9 mL de dichlorométhane anhydre et sous atmosphère d'argon. Après 30 mn d'agitation à température ambiante, la solution est refroidie à-20°C. 306 mg (2. 2 éq) de N-iodosuccinimide et 11. 7 RL (0. 2 éq) d'acide trifluorométhanesulfonique sont alors successivement ajoutés. Après 30 mn à-20°C, le milieu reactionnel est neutralisé par une solution d'hydrogénocarbonate de sodium. Le tout est filtré sur un lit de célite, la phase organique est lavée par une solution de thiosulfate de sodium et par une solution

aqueuse de NaCl. Celle-ci est ensuite séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite. Une chromatographie du brut (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=4/1) fournit 615 mg (80%) du produit 23 sous la forme d'une huile incolore. [α]D +5. 2 (c 0. 56, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDCl3) : # 8. 15-7. 25r (i, 35H, arom.), 5. 85 (dd, 1H, J 2-1=1. 8Hz et J 2-3=3. 3Hz, H-2B), 5. 27 (d, 1H, J 1-2=1. 8Hz, H-1B), 4. 96 (d, 1H, J 1-2=1. 66Hz, H-1A), 4. 93 (d, 1H, J gem=10-7Hz, CHPh), 4. 92 (d, 1H, J gem=10. 9Hz, CHPh), 4. 83 (d, 1H, J gem=l1. lHz, CHPh), 4. 78 (d, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 76 (s, 2H, CH2Ph), 4. 74 (d, 1H, J gem=12. 2Hz, CHPh), 4. 62 (d, 1H, J gem=12. 2Hz, CHPh), 4. 62 (d, 1H, J gem=10. 7Hz, CHPh), 4. 58 (d, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 57 (d, 1H, J gem=10-9Hz, CHPh), 4. 51 (d, 1H, J gem=ll. lHz, CHPh), 4. 19 (dd, 1H, J 3-2=3. 3Hz et J 3-4=9Hz, H-3B), 4. 12-4. 09 (m, 2H, H-5B et H-4B), 4. 07 (dd, 1H, J 2- 1=1. 66Hz et J 2-3=2. 9Hz, H-2A), 4 (dd, 1H, J 3-2=2. 9Hz et J 3-4=9. 2Hz, H-3A), 3. 94 (dd, 1H, J 6b-6a=10.5Hz et J 6b- 5=3Hz, H-6Bb), 3. 92 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 2Hz, H-4A), 3. 85- 3. 77 (m, 4H, H-6A, H-6Ba et H-5A), 3. 71 (s, 3H,-C : O-OCH3), 3. 67 (dt, 1H, J gem=9.5Hz et J CH-CH2=6-7HZ,-o-CH-CH2-) 3. 35 (dt, 1H, J gem=9.5Hz et J CH-CH2=6-7HZ,-o-CH-CH2-) 2. 36 (t, 2H, J CH2-CH2=7.5Hz, -CH2-CO2CH3), 1. 69-1. 65, 1. 57-1. 54 et 1. 35-1. 33 (m, 12H,-CH2-).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 174. 2 (-C : O-OCH3), 165. 4 (-O-C : O), 138. 5, 138. 4, 138. 32, 138. 3, 138. 26, 137. 98, 129. 9 (7 C arom.), 133-127. 35 (35 CH arom), 99. 5 (C-1B), 98. 6 (C-1A), 79. 73 (C-3A), 78. 07 (C-3B), 75. 2 (C-2A), 75. 1 (CH2Ph), 75 (CH2Ph), 74. 6 (C-4B), 74. 3 (C-4A), 73. 3 (CH2Ph), 73. 2 (CH2Ph), 72. 1 (CH2Ph), 71. 9 (C-5B), 71. 7 (C-5A), 71. 6 (CH2Ph), 69. 2 (C-6A), 69. 15 (C-6B), 68. 98 (C-2B), 67. 64 (- O-CH2-), 51. 4 (-C : O-OCH3), 34 (-CH2-COOCH3), 29. 36, 29. 17, 29. 11, 29, 26, 24. 9 (-CH2-).

Spectre de masse : m/z 1174. 5 (M+NH4) +.

Analyse pour C71H80O14 (1157. 40) : calculée C : 73. 68 H : 6. 96 trouvée C : 73. 61 H : 7. 11 2) 8-méthoxycarbonyloctyl 2-0- (3, 4, 6-tri-O-benzyl-a-D- mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl-α-D-mannopyranoside

540 mg (467 umol) du composé 23 sont dissous dans 5 mL d'un mélange de solvant méthanol/dichlorométhane=1/1. Du sodium (cat.) est alors ajouté au mélange. Après 1 heure à température ambiante, la solution est neutralisée par de la résine amberlite IR 120 (H+). Le tout est filtré et concentré sous vide. Une chromatographie du brut (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=2. 75/1) fournit 442 mg (Rdt=90%) du produit 24 sous la forme d'une huile incolore. [a] D +34 (c 0. 71, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDCl3) : # 7.4-7. 3 (m, 30H, arom.), 5. 21 (d, 1H, J 1-2=1.45Hz, H-1B), 4. 95 (d, 1H, J 1-2=1. 75Hz, H-1A), 4. 89 (d, 1H, J gem=10. 6Hz, CHPh), 4. 87 (d, 1H, J gem=10. 9Hz, CHPh), 4. 75 (d, 1H, J gem=12. 2Hz, CHPh), 4. 75 (d, 1H, J gem=11. 6Hz, CHPh), 4. 71 (d, 1H, J gem=11.6Hz, CHPh), 4. 69 (d, 1H, J gem=12. 1Hz, CHPh), 4. 64 (d, 1H, J gem=11. 4Hz, CHPh), 4. 59 (d, 1H, J gem=10. 6Hz, CHPh), 4. 59 (d, 1H, J gem=12. 2Hz, CHPh), 4. 58 (d, 1H, J gem=11. 4Hz, CHPh), 4. 56 (d, 1H, J gem=12. 1Hz, CHPh), 4. 54 (d, 1H, J gem=10.9Hz, CHPh), 4. 2-4. 17 (m, 1H, H-2B), 4. 08 (dd, 1H, J 2-1=1. 75Hz et J 2-3=2.9Hz, H-2A), 4. 03-3. 99 (m, 1H, H-5B), 3. 99 (dd, 1H, J 3-2=2. 9Hz et J 3-4=9. 3Hz, H-3A), 3. 93 (dd, 1H, J 3-2=3. 2Hz et J 3-4=9. lHz, H-3B), 3. 89 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 3Hz, H-4A), 3. 86 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. lHz, H-4B), 3. 86 (dd, 1H, J 6b-6a=ll. lHz et J 6b-5=4. 95Hz, H-6Ab), 3. 82-3. 75 (m, 4H, H-6Aa, H-6B et H-5A), 3. 71 (s, 3H,-C : O- OCH3), 3. 65 (dt, 1H, J gem=9.5Hz et J CH-CH2=6. 8Hz,-O-CH- CH2-), 3. 3 (dt, 1H, J gem=9.5Hz et J CH-CH2=6. 8Hz,-0-CH- CH2-), 2. 51 (d, 1H, J OH-2=1.9Hz, OH), 2. 34 (t, 2H, J CH2- CH2=7. 6Hz,-CH2-C02CH3), 1. 7-1. 63, 1. 56-1. 49 et 1. 37-1. 27 (m, 12H,-CH2-).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 174. 3 (-C : O-OCH3), 138. 5, 138. 35, 138. 3, 138. 25, 138. 1, 137. 9 (6 C arom.), 128. 4-127. 3 (30 CH arom), 101 (C-1B), 98. 7 (C-1A), 79. 92 (C-3B), 79. 79 (C-3A), 75. 1 (CH2Ph), 74. 95 (CH2Ph), 74. 93 (C-2A), 74. 76 (C-4A), 74. 3 (C-4B), 73. 3 (CH2Ph), 73. 2 (CH2Ph), 72. 8 (CH2Ph), 72 (CH2Ph), 71. 7 (C-5B), 71. 7 (C-5A), 69. 2 (C-6A), 69 (C-6B), 68. 45 (C-2B), 67. 63 (-O-CH2-), 51. 4 (-C : O-OCH3), 34 (-CH2- COOCH3), 29. 4, 29. 2, 29. 1, 29, 26, 24. 9 (-CH2-).

Spectre de masse : m/z 1070. 5 (M+NH4) +.

Analyse pour C64H76013 (1053. 30) : calculée C : 72. 98 H : 7. 27 trouvée C : 72. 89 H : 7. 43 3) Phenyl 2-O-acétyl-4, 6-0-benzylidène-1-thio-oc-D- mannopyranoside (25).

2 g (5. 5 mmol, 1 éq) de phényl 4, 6-O-benzylidène-1-thio-α- D-mannopyranoside 1 et 292 mg (1. 2 mmol, 0. 2 éq) d'acide 10-DL-camphorsulphonique sont dissous dans 10 mL de triéthyl orthoacétate. Après 30 mn à température ambiante, 14. 4 mL d'acide acétique 80% sont ajoutés à la solution préalablement refroidie à 0°C. Après 1 heure en laissant remonter la température à l'ambiante, le tout est concentré et chromatographié sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=2/1). 1. 67 g (75%) du composé 25 sont obtenus, après évaporation des solvants, sous forme d'une poudre blanche. pf : 157-158°C ; [a] D +169 (c 1. 05, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDCl3) : # 7. 56-7. 3n (, 10H, arom.), 5. 66 (s, 1H, by), 5. 52 (s, 1H, H-1), 5. 51 (dd, 1H, J 2-1=1. 3Hz et J 2-3=3. 3Hz, H-2), 4. 41 (ddd, 1H, J 5-4=9. 7Hz, J 5- 6a=10. 3Hz et J 5-6b=4-9Hz H-5), 4. 29 (dd, 1H, J 6b- 6a=10. 3Hz et J 6b-5=4.9Hz, H-6b), 4. 28-4. 25 (m, 1H, H-3), 4. 04 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 7Hz, H-4), 3. 89 (t, 1H, J 6b-6a=J 6b-5=10. 3Hz, H-6a), 2. 65 (d, 1H, J OH-3=3.5Hz, OH), 2.21 (s, 3H, O-C : O-CH3).

13C R. M. N. (100 MHz) : 8 170. 3 (-O-C : O-CH3), 136. 9, 133 (2 C arom.), 132-126. 2 (10 CH arom.), 102. 2 (by), 86. 8 (C-1), 79 (C-4), 73. 5 (C-2), 68. 3 (C-6), 67. 7 (C-3), 64. 5 (C-5A), 20. 9 (-O-C : O-CH3).

Spectre de masse : m/z 403. 2 (M+H) +.

Analyse pour C21H2206S (402. 46) : calculée C : 62. 67 H : 5. 509 trouvée C : 62. 66 H : 5. 54 4) Phényl 3-0- (2-0-acétyl-3, 4, 6-tri-O-benzyl-a-D- mannopyranosyl)-2-0-acétyl-4, 6-0-benzylidène-1-thio-a-D- mannopyranoside (26).

731 mg (1. 15 mmol, 1. 1 éq) de 0- (2-0-acétyl-3, 4, 6-tri-O- benzyl-a-D-mannopyranose) trichloroacétimidate (12), 420 mg (1. 044 mmol, 1 éq) du composé 25 et 1. 3 g de tamis moléculaire sont mis en suspension dans 12 mL de dichlorométhane anhydre et sont maintenus sous atmosphère d'argon. Après 30 mn d'agitation à température ambiante, la solution est refroidie à-20°C et 22 RL (0. 1 éq) de trifluorométhanesulfonate de triméthylsilyle sont injectés.

Après 1 heure d'agitation, l'ensemble est neutralisé par une solution d'hydrogénocarbonate de sodium, filtré sur célite. la phase organique séparée est lavée par une solution aqueuse de NaCl, séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous vide. Le brut est chromatographié sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=4/1) et 626 mg (Rdt=68%) du composé 26 sont ainsi isolés sous la forme d'une mousse blanche. pf : 58-59°C ; [a] D +119 (c 0. 55, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDCl3) : # 7. 47-7. 25m(, 25H, arom.), 5. 69 (s, 1H, by), 5. 55 (dd, 1H, J 2-1=1. 8Hz et J 2-3=2. 7Hz, H-

2D), 5. 52 (dd, 1H, J 2-1=1. 3Hz et J 2-3=3. 4Hz, H-2C), 5. 49 (d, 1H, J 1-2=1.3Hz, H-1C), 5. 34 (d, 1H, J 1-2=1. 8Hz, H- 1D), 4. 89 (d, 1H, J gem=10. 9Hz, CHPh), 4. 77 (d, 1H, J gem=12. 2Hz, CHPh), 4. 74 (d, 1H, J gem=11. 4Hz, CHPh), 4. 56 (d, 1H, J gem=12. 2Hz, CHPh), 4. 56 (d, 1H, J gem=11. 4Hz, CHPh), 4. 54 (d, 1H, J gem=10. 9Hz, CHPh), 4. 42 (ddd, 1H, J 5-4=9.8Hz, J 5-6b=4.9Hz et J 5-6a=10. 3Hz, H-5C), 4. 4 (dd, 1H, J 3-2=3. 4Hz et J 3-4=9. 8Hz, H-3C), 4. 3 (dd, 1H, J 6b- 6a=10. 3Hz et J 6b-5=4.9Hz, H-6Cb), 4. 2 (t, 1H, J 4-3=J 4- 5=9. 8Hz, H-4C), 3. 97-3. 87 (m, 4H, H-5D, H-4D, H-3D et H- 6Ca), 3. 86 (dd, 1H, J 6b-6a=12Hz et J 6b-5=3. 9Hz, H-6Db), 3. 78 (dd, 1H, J 6a-6b=12Hz et J 6a-5=3. 3Hz, H-6Da), 2. 21 et 2. 16 (2s, 6H, 2 O-C : O-CH3).

13C R. M. N. (100 MHz). b 170. 1 et 169. 7 (2-0-C : O-CH3), 138. 4, 138. 2, 137. 9, 136. 9, 133 (C arom.), 132-125. 9 (25 CH arom.), 101. 3 (by), 98. 8 (C- 1D), 86. 8 (C-1C), 78. 9 (C-4C), 75. 6, 74. 1 et 72. 1 (C-3D, C- 4D et C-5D), 74. 9 (CH2Ph), 73. 4 (CH2Ph), 73. 1 (C-2C), 71. 7 (CH2Ph), 70. 8 (C-3C), 68. 6 (C-6D), 68. 4 (C-2D), 68. 2 (C- 6C), 64. 6 (C-5C), 21 et 20. 8 (2-0-C : O-CH3).

Spectre de masse : m/z 894. 3 (M+NH4) +.

Analyse pour C5oH52012S (877. 02) : calculée C : 68. 47 H : 5. 976 trouvée C : 68. 36 H : 6. 15 5) 8-méthoxycarbonyloctyl 2-0- (2-0- (3-0- (2-0-acétyl-3, 4, 6- tri-O-benzyl-a-D-mannopyranosyl)-2-0-acétyl-4, 6-O- benzylidène-a-D-mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl-α-D- mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl-α-D-mannopyranoside (27).

158 mg (180 pmol, 1 éq) du composé 26, 186 mg (1 éq) du composé 24 et 500 mg de tamis moléculaire sont mis en solution dans 5 mL de dichlorométhane anhydre et sont maintenus sous atmosphère d'argon. Après 30 mn d'agitation, la solution est refroidie à-20°C et 81 mg (2 éq) de N- iodosuccinimide ainsi que 4 RL (0. 3 éq) d'acide trifluorométhanesulfonique sont additionnés au milieu.

Après 30 mn d'agitation, le tout est neutralisé par une solution d'hydrogénocarbonate de sodium et flitre sur un lit de célite. La phase organique est alors lavée par une solution de thiosulfate de sodium, par une solution aqueuse de NaCl, séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous pression réduite. Le brut est chromatographié sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=5/1) et 236 mg (Rdt=72%) du produit 27 sont ainsi isolés sous la forme d'une huile incolore. [ D +29 (c 0. 85, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDC13) : 87. 38-7. 25m(, 50H, arom.), 5. 66 (s, 1H, by), 5. 56 (dd, 1H, J 2-1=1. 5Hz et J 2-3=3Hz, H-2D), 5. 44 (dd, 1H, J 2_1=1. 3Hz et J 2-3=3. 5Hz, H-2C), 5. 32 (se, 1H, H-1D), 5. 2 (se, 1H, H-1B), 5. 04 (se, 1H, H-1C), 4. 94 (se, 1H, H-1A), 4. 88 (d, 1H, J gem=10. 6Hz, CHPh), 4. 88 (d, 1H, J gem=10. 7Hz, CHPh), 4. 87 (d, 1H, J gem=10-9Hz, CHPh), 4. 75 (d, 1H, J gem=12. 4Hz, CHPh), 4. 75 (d, 1H, J gem=11. 2Hz, CHPh), 4. 72 (s, 2H, CH2Ph), 4. 67 (d, 1H, J

gem=12. 3Hz, CHPh), 4. 67 (d, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 61 (d, 1H, J gem=12. 4Hz, CHPh), 4. 6 (d, 1H, J gem=10. 6Hz, CHPh), 4. 6 (d, 1H, J gem=12Hz, CHPh), 4. 58 (s, 2H, CH2Ph), 4. 57 (d, 1H, J gem=11. 2Hz, CHPh), 4. 53 (d, 1H, J gem=10. 9Hz, CHPh), 4. 52 (d, 1H, J gem=10. 7Hz, CHPh), 4. 33 (d, 1H, J gem=12. 3Hz, CHPh), 4. 43 (dd, 1H, J 3-2=3. 5Hz et J 3- 4=9. 3Hz, H-3C), 4. 21 (dd, 1H, J 6b-6a=10. 4Hz et J 6b- 5=4. 5Hz, H-6Cb), 4. 14-4. 12 (m, 1H, H-2B), 4. 09 (t, 1H, J 4- 3=J 4-5=9. 3Hz, H-4C), 4. 07-4. 04 (m, 1H, H-5C), 4. 03 (t, 1H, J 4-3=J 4-5=9. 9Hz, H-4D), 4. 01-4 (m, 1H, H-2A), 3. 98-3. 96 (m, 1H, H-3B), 3. 93 (dd, 1H, J 3-2=3Hz et J 3-4=9. 9Hz, H- 3D), 3. 88-3. 85 (m, 1H, H-5D), 3. 71 (s, 3H,-C : 0-OCH3), 3. 62-3. 59 (m, 1H, H-6Da), 3. 6-3. 56 (m, 1H,-0-CH-CH2-), 3. 25 (dt, 1H, J gem=9. 4Hz et J CH-CH2=6. 6Hz,-O-CH-CH2-), 2. 34 (t, 2H, J CH2-CH2=7. 5Hz,-CH2-CO2CH3), 2. 14 et 2. 13 (2s, 6H, 2 O-C : 0-CH3), 1. 7-1. 62, 1. 54-1. 47 et 1. 35-1. 25 (m, 12H,-CH2-).

13C R. M. N. (100 MHz) : 174. 3 (-C : O-OCH3), 170. 1 et 169. 5 (2-O-C : O-CH3), 138. 6, 138. 55, 138. 3*2, 138. 29*2, 138. 23, 138. 2, 137. 98, 137 (10 C arom.), 128. 7-125. 9 (50 CH arom.), 101. 2 (by), 100. 6 (C-1B, 1JCH=171. 3Hz), 99. 8 (C-1C, 1JcH=172. 2Hz), 98. 8 (C-1D, 1JCH=174Hz), 98. 6 (C-1A, 1JCH=170. 5Hz), 79. 3 (C-3B), 78. 9 (C-4C), 77. 7 (C-3D), 75. 56 (C-2A), 75. 4 (C-2B), 75. 13 (CH2Ph), 75. 06 (CH2Ph), 74. 87 (CH2Ph), 73. 9 (C-4D), 73. 24 (CH2Ph), 73. 22 (CH2Ph), 73. 2 (CH2Ph), 72. 17 (CH2Ph), 72. 09 (CH2Ph), 72 (C-5D), 71. 7 (CH2Ph), 71. 4 (C-2C), 70. 8 (C-3C), 68. 05 (C-2D), 68. 4 (C- 6C), 67. 63 (-0-CH2-), 51. 4 (-C : O-OCH3), 34 (-CH2-COOCH3), 29. 4, 29. 2, 29. 1, 29, 26, 24. 9 (-CH2-), 21 et 20. 8 (2-O- C : O-CH3).

Spectre de masse : m/z 1836. 5 (M+NH4) +.

Analyse pour C1o8Hl22o25 (1820. 026) : calculée C : 71. 27 H : 6. 75 trouvée C : 71. 08 H : 6. 94 6) 8-carboxyloctyl 2-0- (2-0- (3-0- (a-D-mannopyranosyl)-a-D- mannopyranosyl)-a-D-mannopyranosyl)-a-D-mannopyranoside III.

Etape 1 : saponification 200 mg (110 zmol, 1 éq) du précurseur 27 sont dissous dans 10 mL d'un mélange tétrahydrofurane/solution d'hydroxyde de sodium (0. 1N) (1/1). Après une nuit à reflux, l'ensemble est acidifié et extrait trois fois par du dichlorométhane. La phase organique est alors séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et concentrée sous vide. Le produit brut est chromatographié sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=1. 5/1) et 155 mg (Rdt=82%) du composé sont ainsi isolés sous la forme d'une huile incolore.

8-carboxyloctyl 2-0- (2-0- (3-0- (3, 4, 6-tri-O-benzyl-a-D- mannopyranosyl)-4, 6-O-benzylidène-α-D-mannopyranosyl)- 3, 4, 6-tri-O-benzyl-a-D-mannopyranosyl)-3, 4, 6-tri-O-benzyl- a-D-mannopyranoside [α] D +33. 3 (c 0. 52, chloroforme) 1H-R. M. N. (400MHz, CDCl3) : å 7. 5-7. 25 (m, 50H, arom.), 5. 6 (s, 1H, by), 5. 21 (d, 1H, J 1-2=1.3Hz, H-1B), 5. 16 (d, 1H, J 1- 2=1. 45Hz, H-1D), 5. 12 (d, 1H, J 1-2=l. lHz, H-1C), 4. 97 (d, 1H, J 1-2=1. 2Hz, H-1A), 4. 42-4. 41 (m, 1H, H-2C), 4. 18-4. 17 (m, 1H, H-2B), 4. 08 (m, 1H, H-2D), 4 (dd, 1H, J 2-1=1. 2Hz et J 2-3=3. lHz, H-2A), 3. 6 (dt, 1H, J gem=9.5Hz et J CH- CH2=6. 5Hz,-0-CH-CH2-), 3. 27 (dt, 1H, J gem=9.5Hz et J CH- CH2=6. 5Hz,-0-CH-CH2-), 2. 35 (t, 2H, J CH2-CH2=7.5Hz, -CH2- C02H), 1. 7-1. 6, 1. 54-1. 47 et 1. 35-1. 25 (m, 12H,-CH2-).

Absence des trois pics correspondant aux méthyles des esters.

13C R. M. N. (100 MHz) : # 178. 5 (-C02H), 102. 3 (C-1C), 101. 7 (by), 100. 9 (C-1B), 99. 8 (C-1D), 98. 5 (C-1A), 75. 7 (C-2A), 74. 8 (C-2B), 69. 65 (C-2C), 68. 5 (C-2D), 67. 6 (-O-CH2-), 33. 8 (-CH2-COOH), 29. 3, 29, 28. 9, 28. 7, 25. 9, 24. 5 (-CH2-), 21 et 20. 8 (2-0-C : O-CH3).

Spectre de masse : m/z 1738. 9 (M+NH4) +.

Analyse pour C1o3Hll6o23 (1722. 059) : calculée C : 71. 84 H : 6. 789 trouvée C : 71. 73 H : 6. 91 Etape 2 Pour le protocole expérimental, voir l'étape 3 du composé I (R=connecteur).

100 mg (58 llmol) du composé précédent donne 40 mg (Rdt=83%) du composé III sous la forme d'une poudre blanche amorphe après lyophilisation.

1H-R. M. N. (400MHz, D2O) : #5. 25 (d, 1H, J 1-2=1. 2Hz, H- 1B), 5. 1 (d, 1H, J 1 2=1-3Hzt H-1D), 5. 05 (d, 1H, J 1- 2=0. 8Hz, H-1A), 4. 99 (d, 1H, J 1-2=1.4Hz, H-1C), 4. 19 (dd, 1H, J 2-1=1. 42Hz et J 2-3=3Hz, H-2C), 4. 07 (dd, 1H, J 2- 1=1. 2Hz et J 2-3=3. lHz, H-2B), 4. 03 (dd, 1H, J 2-1=1. 3Hz et J 2-3=3. 3Hz, H-2D), 3. 9-3. 88 (m, 1H, H-2A), 3. 92 (dd, 1H, J 3-2=3.1Hz et J 3-4=9. 6Hz, H-3B), 3. 91 (dd, 1H, J 3-2=3Hz et J 3-4=9. 4Hz, H-3C), 3. 72-3. 65 (m, 1H,-O-CH-CH2_), 3. 49 (dt, 1H, J gem=10Hz et J 1a-CH2=6. 2Hz-0-CH-CH2-), 2. 32 (t, 2H, J CH2-CH2=7.4Hz, -CH2-CO2H), 1. 6-1. 5 et 1. 33-1. 26 (m, 12H,-CH2-).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 178. 3 (-CO2H), 102. 5 (C-1D), 102. 49 (C-1C), 100. 99 (C-1B), 98. 3 (C-1A), 79. 3 (C-2A), 78. 9 (C-2B), 78. 2 (C-3C), 73. 66, 73. 6*2, 73 (4*C-5), 70. 63 (C-3D), 70. 61 (C-3A), 70. 34 (C-2D), 70. 28 (C-3B), 69. 9 (C- 2C), 68. 3 (-O-CH2-), 67. 4, 67. 24, 67. 2, 66. 5 (4*C-4), 61. 4*2, 61. 3, 61. 2 (4*C-6), 34. 6 (-CH2-COOH), 28. 7, 28. 56, 28. 55, 28. 48, 25. 6, 24. 6 (-CH2-).

Spectre de masse (FAB négatif) : calculée C33H57O23 : m/z 821. 32 obtenue 821. 32

Exemple 4 : Synthèse des dimannosides VII.

La figure 4 en annexe représente le schéma réationnel du protocole décrit ci-dessous.

1) 2-O-(3-O-benzyl-4,6-O-benzylidène-ß-D-manno pyranosyl)- 3-0-benzyl-4, 6-0-benzylidène-D-mannopyranoside (28).

Pour le protocole expérimental, voir l'étape 2 du composé 9.

6 (200 mg, 252 umol, 1 éq) donne 160 mg (Rdt=90%) du composé 28 (a/ß=1/1) sous forme d'une mousse blanche après une chromatographie sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=1. 5/1).

1H-R. M. N. (250MHz, CDCl3) du mélange a-OH et ß-OH : 8 7. 46-7. 16in (, 20H, arom.), 5. 49*3 et 5. 43 (2s, 4H, 4*by), 5. 21 (se, 1H, H-1), 4. 89-4. 59 (m, 11H, 3*H-1 et 4*CH2Ph), 4. 35-3. 55 (m, 20H, 4*H-2, 4*H-3, 4*H-4 et 4*H-6), 3. 4-3. 21 (m, 4H, 4*H-5).

Spectre de masse : m/z 716 (M+NH4) +.

Analyse pour C4oH42011 (698. 77) : calculée C : 68. 75 H : 6. 058 trouvée C : 68. 50 H : 6. 26 1) 2-O- (ß-D-mannopyranosyl)-D-mannopyranose (IV, R=H).

Pour le protocole expérimental, voir l'étape J du composé (I, R=connecteur).

28 (130 mg (35 Rmol) donne 56. 7 mg (Rdt=85%) de (IV, R=H) sous la forme d'une poudre amorphe blanche après lyophilisation.

1H-R. M. N. (400MHz, D20) du composé a-OH 5. 27 (d, 1H, J 1-2=l. 7Hz, H-1A), 4. 76 (s, 1H, H-1B), 4. 11 (dd, 1H, J 2-1=1. 7Hz et J 2-3=3. 3Hz, H-2A), 4. 03 (d, 1H, J 2-3=3. 1Hz, H-2B), 3. 84 (dd, 1H, J 3-2=3. 3Hz et J 3-4=9. 7Hz, H-3A), 3. 63 (dd, 1H, J 3-2=3. lHz et J 3-4=9. 5Hz, H-3B).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 99. 01 (C-1B), 92. 25 (C-1A), 78. 30 (C-2A), 71. 13 (C-2B).

1H-R. M. N. (400MHz, D20) du composé ß-OH : # 4. 97 (s, 1H, H-1A), 4. 81 (s, 1H, H-1A), 4. 17 (d, 1H, J 2- 3=3Hz, H-2A), 4. 16 (d, 1H, J 2-3=3. 3Hz, H-2B), 3. 65-3. 61 (m, 2H, H-3A et H-3B).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 101. 18 (C-1B), 93. 99 (C-1A), 79. 68 (C-2A), 70. 63 (C-2B).

Spectre de masse HRMS : (M-OH+NH3) calculée : 342. 1400 observée : 342. 1391 (M +NH4) + calculée : 360. 1506 observée : 360. 1517 2) 8-méthoxycarbonyloctyl 2-0- (3-0-benzyl-4, 6- O-benzylidène-ß-D-mannopyranosyl)-3-O-benzyl-4, 6-O- benzylidène-D-mannopyranoside (29).

Pour le protocole expérimental, voir le compose 10.

6 (250 mg, 316 Rmol) donne 190 mg (Rdt=70%) du composé 29 (mélange α/ß=1/1, non séparables), sous forme d'une huile incolore après chromatographie sur gel de silice (élution : cyclohexane/acétate d'éthyle=1. 5/1) 1H-R. M. N. (250MHz, CDC13) : # 7. 45-7. 18m (, 20H, arom.), 5. 51*2, 5. 49 et 5. 43 (2s, 4H, 4*by), 4. 86 (s, 1H,

H-1), 4. 80-4. 67 (m, 10H, 2*H-1 et 4*CH2Ph), 4. 41 (s, 1H, H-1), 4. 31-3. 53 (m, 28H, 4*H-2, 4*H-3, 4*H-4, 4*H-6, 2*- C : 0-0-CH3 et 2*-0-CH2-), 3. 42-3. 21 (m, 6H, 4*H-5 et 2*-0- CH2-), 2. 26-2. 18 (m, 4H, 2*-CH2-C02CH3), 1. 54-1. 18 (m, 24H,-0-CH2- (CH2) 6-CH2-C : o-) Spectre de masse : m/z 886 (M+NH4) +.

Analyse pour CsoH6oOi3 (869. 028) : calculée C : 69. 10 H : 6. 959 trouvée C : 68. 55 H : 7. 41 3) 8-carboxyloctyl 2-0- (P-D-mannopyranosyl)-D- mannopyranoside (VII, R=connecteur).

-Etape 1 : Pour le protocole expérimental, voir l'étape 2 du composé (I, R=connecteur).

60 mg (69 Rmol) du précurseur 29 fournissent 42 mg (Rdt=72%) après chromatographie sur gel de silice avec élution : cyclohexane/acétate d'éthyl=1/1 sous la forme d'une poudre blanche.

1H-R. M. N. (250MHz, CDC13) 8 7. 45-7. 18m (, 20H, arom.), 5. 51*2, 5. 49 et 5. 43 (2s, 4H, 4*by). Absence du pic caractéristique du méthyle de 1'ester méthylique.

Spectre de masse HRMS : m/z calculée : 855. 3956 observée : 855. 3958 Analyse pour C4oH42011 (855. 0008) : calculée C : 68. 83 H : 6. 837 trouvée C : 68. 64 H : 7. 10 Etape 2 : Pour le protocole expérimental, voir l'étape 3 du composé (I, R=connecteur).

A partir de 30 mg (35 µmol) de l'intermédiaire précédent, 15 mg (Rdt=92%) de (VII, R=connecteur) sous la forme d'une poudre amorphe sont récupérés après lyophilisation.

1H-R. M. N. (400MHz, D20) du composé a-0- connecteur : 8 4. 97 (s, 1H, H-1A), 4. 75 (s, 1H, H-1B), 4. 12

(d, 1H, J 2-3=3Hz, H-2A), 4. 03 (d, 1H, J 2-3=2. 9Hz, H-2B), 3. 91-3. 87 (m, 1H,-0-CH-), 3. 81 (dd, 1H, J 3-2=3Hz et J 3_ 4=9. 8Hz, H-3A), 3. 65-3. 61 (m, 1H,-0-CH-), 3. 62-3. 59 (m, 1H, H-3B), 2. 3 (t, 2H, J CH2-CH2=7.4Hz, -CH2-CO2H), 1. 63- 1. 56 (m, 4H,- (CH2) 2-), 1. 35-1. 29 (m, 8H, -(CH2)4-).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 98. 94 (C-1B, 1JC- H=155Hz), 97. 83 (C-1A, 1JC-H=170Hz), 77. 58 (C-2A), 71. 1 (C- 2B).

1H-R. M. N. (400MHz, D20) du composé ß-O- connecteur : # 4. 83 (s, 1H, H-1B), 4. 72 (s, 1H, H-1A), 4. 24 (d, 1H, J 2-3=2. 9Hz, H-2A), 4. 11 (d, 1H, J 2-3=2. 9Hz, H- 2B), 3. 77-3. 72 (m, 1H,-O-CH-), 3. 66-3. 61 (m, 2H, H-3A et H-3B), 3. 57-3. 51 (m, 1H,-O-CH-), 2. 3 (t, 2H, J CH2- CH2=7-4HZ,-CH2-CO2H) 1. 63-1. 56 (m, 4H,- (CH2) 2-), 1. 35- 1. 29 (m, 8H, -(CH2)4-).

13C R. M. N. (100 MHz) : # 101. 04 (C-1B, 1JC H=161. 8Hz), 100. 45 (C-1A, 1JC-H=157.5Hz), 78. 4 (C-2A), 70. 7 (C-2B).

Spectre de masse HRMS : (M-OH+NH3) calculée : 498. 2551 observée : 498. 2531 (M +NH4) + calculée : 516. 2656 observée : 516. 2671 Exemple 5 : Procédures de couplage covalent des oligomannosides de synthèse de l'invention.

Ce couplage présente les avantages suivants : -surface robuste et adaptée au tests d'immunoanalyse -meilleure orientation de la biomolécule -densité plus élevée en épitopes -moins de problème de reconnaissance de 1 anticorps : site antigénique accessible

Utilisation de la carbodiimide : Cette méthode consiste à activer les groupements acide carboxylique des biomolécules elles-mmes pour du carbodiimide, qui conduit à un ester activé puis à la formation de liaisons amides avec les groupes amine primaire de la surface (Nunc TechNote Vol. 4 N° 27-28). La carbodiimide hydro-soluble (EDC : 1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl) carbodiimide) est utilisée pour activer les groupements-COOH de la biomolécule en présence du sulfo-N-hydroxy succinimide (sulfo-NHS : N- hydroxysuccinimide) (Timkovich, R., 1977, Anal. Biochem.

79 : 139-143 ; Staros, J. V., et al., 1986, Anal. Biochem.

156 : 220-222 ; Rasmussen, S. E., 1990, Ann. Biol. Clin.

48 : 647-50). Le sulfo-NHS supprime de manière efficace l'hydrolyse du produit activé et permet la fixation du sucre de synthèse à la surface de la plaque déjà sensibilisée par le groupement NH2.

1) Matériel : Dissoudre tous les réactifs de couplage dans 1'eau distillée. Le reste des réactifs est reconstitué dans l'eau déminéralisée.

-Covalink NH2 C8 (Cat. Polylabo. N° N70897).

-Sucres de synthèse tetramannose plié à une chaine de 8 carbones (bras Lemieux) : 200 mg.

Sulfo-NHS : sulfo-N-hydroxysuccinimide, PIERCE cat. N° 24510.

-EDC : 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)- carbodiimide, Novabiochem, PIERCEN° 01-62-0011.

-PBS 0. 15 M Na+, pH7. 2, Sigma.

-PBS/Tween PBS, 0. 05% ; Tween 20, Sigma.

-PBS/Tween/BSA : PBS/Tween, 0. 5% BSA -Lait écrémé.

2) Protocole : Le tétramannoside de synthèse est utilisé sur deux plaques différentes.

A partir d'une solution mère de sucre à 0, 8 mg/ml on réalise 6 dilutions de raison 2 pour obtenir une gamme de concentration de 40 à 1, 25 ug/ml dans 1'eau distillée.

On prépare de manière extemporanée une solution de : NHS 3, 48 mg/ml EDC 3, 07 mg/ml On prévoit plusieurs puits pour le blanc et les contrôles (sucres sans réactifs de couplage, un témoin pour le conjugué) Activation et couplage : -On dépose successivement la solution de sucres à raison de 100 pi par puits : NHS 50 ul/puits EDC 50 ul/puits -On couvre les plaques à l'aide d'un film plastique -On incube les plaques pendant une nuit à température ambiante et sous agitation douce.

Lavages et Saturation : Trois lavages avec de 1'eau (300 ul/puits).

Saturation avec 300 pl/puits d'une solution de lait écrémé à 5% dans le tampon PBS.

Incubation 1 heure à température ambiante 5 lavages par le PBS-Tween 20 (0, 05%) à raison de 300 ul/puits Détection par methode ELISA : -Les sucres ainsi couplés peuvent tre détectés par l'anticoprs monoclonal 5B2 dilué au 250sème dans une solution PBS-Tween-BSA puis déposer 100 pl/puits.

-5 lavages avec une solution PBS-Tween

Révélation : -Déposer 100 ul/puits de conjugué (exemple : anti-IgM de rat dilué au 500 pour révéler le 5B2) dans une solution PBS-Tween-BSA puis incuber une heure à température ambiante -5 Lavages PBS/Tween (300 ul/puits).

-Révélation par l'addition d'un substrat chromogène à base du tetraméthylbenzidine (TMB) : -200 pi de TMB (Kit de révélation, Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-La-Coquette) -Incuber les plaques à température ambiante pendant une demi heure -Arrter la réaction par 100 ul/puits par une solution de H2SO4 2N.

Lecture : -Filtre de lecture 450 nm -Filtre de référence 620 nm Exemple 6 : Réactivité des oligomannosides de synthèse vis à vis d'anticorps produits contre des oligomannosides naturels.

1) Oligomannosides de synthèse mimant les activités antigéniques des oligomannosides naturels de levures du genre Candida. a) Anticorps polyclonaux.

Les anticorps polyclonaux monospécifiques commercialisés par la firme Iatron sont préparés par immunisation de lapins avec des levures entières puis adsorbés par des levures d'espèces hétérologues. Ils permettent, utilisés en batterie, une identification par agglutination des principales espèces de Candida impliquées en pathologie humaine. Chacun de ces"facteurs"réagit avec des épitopes spécifiques qui ont été identifiés par

toute une série d'études immunochimiques conduites au Japon. Les résultats de ces études sont synthétisés dans la publication de S. Suzuki (Suzuki, S. et al., 1997, Curr.

Top. Med. Mycol. 8 : 57-70).

Les figures 5 et 6 rapportent les tests effectués sur le facteur 5 (§), spécifique des ß-1, 2 oligomannosides et le facteur 1 (§) réagissant avec les (X- 1, 2 oligomannosides vis à vis des mannotétraoses de synthèse d'anomérie a et ß-1, 2.

Les figures 5 et 6 attestent de la spécificité des réactions observées. b) Anticorps monoclonaux.

Plusieurs anticorps monoclonaux ont été décrits dans la littérature pour réagir avec des ß-1, 2 oligomannosides de C. albicans. La figure 7 rapporte la réactivité du D-Man (1-2) D-Man ß (1-2) D-Man ß (1-2) D-Man avec plusieurs de ces anticorps monoclonaux.

L'anticorps 5B2 (Cailliez, J. C. et al. 1988, Ann. Inst. Pasteur. Microbiol. 139 : 171-88 ; Hopwood, V. et al. 1986, Infect. Immun. 54 : 222-227 ; Poulain, D. et al.

1991, Mycoses 34 : 221-226 ; Trinel, P. A., 1992, Infect.

Immun. 60 : 3845-3851) généré par notre équipe (Dr.

Poulain). Cet anticorps détecte des oligomannnosides circulants dans les sérums d'animaux et de patients infectés par C. albicans.

L'anticorps AF1 généré par A. Cassone (De Bernardis, F. et al., 1993, J. Clin. Microbiol. 31 : 3142- 3146 ; De Bernardis, F. et al. 1994, Infect. Immun. 62 : 509-519 ; Girmenia, C. et al., 1997, J. Clin. Microbiol.

35 : 903-906 ; Torosantucci, A. et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136 : 2155-2263). Cet anticorps protège les rates dans des modèles expérimentaux de candidose vaginale.

Les anticorps 10G et B6. 1 générés par J.

Cutler (Li, R. et al., 1991, J. Gen. Microbiol. 137 : 455-

464 ; Li, R. et al., 1993, J. Biol. Chem. 268 : 18293-8 ; Kanbe, T. et al., 1994, Infect. Immun. 62 : 1662-8 ; Han, Y. et al., 1995, Infect. Immun. 63 : 2714-9 ; Han, Y. et al., 1997, J. Infect. Dis. 175 : 1169-75 ; Han, Y. et al., 1997, Infect. Immun. 65 : 4100-7 ; Han, Y. et al., 1998, Infect. Immun. 66 : 5771-6 ; Zhang, M. X. et al., 1998, Infect. Immun. 66 : 6027-9). Ces anticorps réagissent contre des adhésines de C. albicans et protègent les souris dans des modèles expérimentaux de candidose disséminée.

A titre de témoin il a été utilisé un anticorps monoclonal dénommé CA1, produit par Sanofi-Diagnostic Pasteur et qui reconnaît des séquences a-1, 2 mannose (Jacquinot, P. M. et al., 1998, FEMS Microbiol. Lett. 169 : 131-8 ; Poulain, D. et al. 1991, Mycoses 34 : 221-226 ; Trinel, P. A., 1992, Infect. Immun. 60 : 3845-3851).

Les résultats de la figure 7 montrent que les sucres de synthèse réagissent de manière attendue avec ces anticorps monoclonaux et miment donc les antigènes qui présentent tous un grand intért en physiopathologie.

2) Oligomannosides de synthèse mimant les activités antigéniques des oligomannosides naturels de levures du genre Saccharomyces.

Il a été montré qu'un des épitopes majeurs vis à vis desquels était dirigée la réponse ASCA des patients atteints de la maladie de Crohn était un mannotétraose de formule Man a-1, 3 Man a-1, 2 Man e1, 2 Man (Sendid, B. et al., 1996, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 3 : 219-26 ; Young, M. et al., 1998, Glycoconj. J. 15 : 815-22) a) Anticorps polyclonaux animaux.

Selon les travaux immunochimiques ayant porté sur les sérums Iatron cette structure devrait réagir avec le Facteur 34 (Suzuki, S. et al., 1997, Curr. Top. Med.

Mycol. 8 : 57-70). La figure 8 montre que les résultats observés correspondent aux résultats attendus. b) Anticorps de patients.

La figure 9 rapporte que l'utilisation du pool de sérums de patients, qui sert à standardiser le test ASCA, montre que ces anticorps se fixent à selon une réaction dépendante de la dose d'antigène de synthèse utilisée pour sensibiliser les plaques.

Exemple 7 : Inhibition de la colonisation dans un modèle de candidose vaginale expérimentale de la rate (F. de Bernardis et al. Infection and Immunity 1998, 66 : 3317-3325). _ Des rates ovarectomisées sont maintenues en pseudo-oestrus par injection sous-cutanée de 0, 5 mg de benzoate d'oestradiol tous les 2 jours pendant toute la durée des expériences.

Les animaux sont inoculés avec 0, 1 mL d'une solution à 10'levures. La cinétique de l'infection est suivie en déterminant le nombre de levures présentes dans les sécrétions vaginales. 1 uL de sécrétions sont prélevées à l'aide d'une anse en plastique calibrée, étalés sur boite de sabouraud gélosé plus antibiotiques, les unités formant colonies sont numérées après 48h d'incubation à 28°C.

Le graphe de la figure 10 rapporte les résultats observés sur 4 séries de 5 rates chacune. 1 : le P-1, 2 mamnotétraose (100ug) a été administré 1 heure avant inoculation. 2 : 1 heure après inoculation. 3 : lh, 24h et 48h après inoculation.

Exemple 8 : Inhibition des colonisations intestinales par C. albicans par des ß-1, 2 oligomannosides de synthèse.

L'incidence croissante des candidoses systémiques est un problème médical et économique majeur en milieu hospitalier. Ces candidoses sont principalement déterminées par des levures dont l'habitat naturel est le tube digestif humain. On estime que 40 à 80% des individus sont porteurs de C. albicans ou de C. glabrata, les deux espèces les plus pathogènes du genre. Lors des candidoses systémiques c'est généralement la souche hébergée par le patient qui dissémine. Chez les patients de réanimation ou d'hématologie clinique l'intensité de la colonisation a été établie comme un facteur de risque indépendant de développement de candidose systémique.

La nature des systèmes ligand-récepteur, responsables de la colonisation intestinale par C. albicans est inconnue.

Les inventeurs ont pu montrer que des sucres particuliers de la surface pariétale de C. albicans, les ß- 1, 2 oligomannosides se fixaient aux cellules macrophagiques par l'intermédiaire de la galectine-3. Les 1, 2 oligomannosides sont massivement exprimés à la surface de la paroi associés à plusieurs types de molécules, le mannane, les mannoprotéines et un glycolipide, le PLM. La galectine-3 est surtout connue comme une lectine exprimée sur les cellules épithéliales polarisées. Ces résultats laissent donc supposer que la galectine-3 pourrait tre responsable de la fixation de C. albicans à l'intestin via les ß-1, 2 oligomannosides.

Parallèlement, il a été établi indirectement que les ß-1, 2 oligomannosides présentaient vraisemblablement un rôle dans la pathogénèse des candidoses. En effet des anticorps spécifiques de ces résidus se sont montrés protecteurs contrairement aux anticorps dirigés contre les résidus mannose liés en a, beaucoup plus ubiquitaires. Les mécanismes à la base de la

protection ne sont pas élucidés. Aucune étude n'a concerné à ces jour, l'analyse de corrélations entre expression phénotypique de surface de ß-1, 2 oligomannosides et pathogénicité des souches de C. albicans. Cependant, des travaux anciens utilisant une anticorps monoclonal anti- glycoprotéine de C. albicans avaient montré que cet anticorps réagissait davantage avec les souches isolées en position pathogène que celles isolées en position saprophyte. Or, il a été montré ultérieurement que cet anticorps réagissait spécifiquement avec des épitopes ß-1, 2 oligomannosidiques.

Sur ces bases, le modèle expérimental qui a été développé pour explorer le rôle des ß-1, 2 oligomannosides dans la colonisation intestinale a visé tout d'abord à impliquer des souches de C. albicans sélectionnées pour présenter différents niveaux d'expression phénotypique de ß-1, 2 oligomannosides, puis à explorer 1'effet de l'administration de ß-1, 2 oligomannosides sur la colonisation intestinale.

Les souches ont été choisies sur la base de travaux qui avaient montré des différences de pathogénicité reproductibles entre souches de C. albicans dans deux modèles expérimentaux d'infection systémique, chez le rat et la souris. La co-agglutination des levures avec des particules de latex sensibilisées par plusieurs anticorps monoclonaux anti-ß-1, 2 oligomannosides a permis de montrer que les souches les plus virulentes exprimaient davantage de ß-1, 2 oligomannosides à leur surface. Le modèle de colonisation intestinale utilisé fut celui du souriceau nouveau né développé par Cole et al.. Deux souches y ont été impliquées, l'une « virulente », exprimant davantage de ß-1, 2 oligomannosides en surface qu'une souche « avirulente ». Sur la base des examens de selles, la souche virulente s'est montrée capable de maintenir une colonisation digestive plus intense et plus persistante que

la souche exprimant moins de P-1, 2 oligomannosides. il a alors été entrepris de tenter d'inhiber cette colonisation intense. Dans ce but, des P-1, 2 oligomannosides obtenus par synthèse chimique selon l'invention ont été administrés aux souriceaux, préalablement à l'inoculation de la souche.

Cette procédure permet de disposer de grandes quantités de produits purs en s'affranchissant des longues procédures de purification de matériels biologiques. L'administration de P-1, 2 tétramannosides de synthèse à titre prophylactique a permis une réduction drastique et dose dépendante du nombre de levures retrouvées dans les selles par rapport aux animaux non traités ou traités par des a-1, 2 tétramannosides de synthèse utilisés à titre de témoin. Ces résultats confortent les informations acquises sur l'importance physiopathologique des P-1, 2 oligomannosides présentés spécifiquement par C. albicans aux cellules et aux lectines endogènes ses hôtes naturels. Ils laissent également entrevoir le développement de mesures prophylactiques à base d'analogues de produits naturels de C. albicans et visant à décontaminer le tube digestif des patients à risque.

1-Matériel et Méthodes.

1) Souches de C. albicans.

Il a été utilisé 7 souches de C. albicans de sérotype A pour lesquelles des expériences précédentes avaient permis de mettre en évidence des différences de pathogénicité dans des modèles de candidoses systémiques du rat et de la souris [Schmidt, 1996 #2553]. Il s'agit de 3 souches avirulentes ATCC44831, ATCC18804, et ATCC10231, de 3 souches virulentes : ATCC44505, ATCC62342, ATCC10261 et d'une souche de virulence intermédiaire : ATCC32354.

2) Agglutination par particules de latex sensibilisées par des anticorps monoclonaux anti-ß-1, 2 oligomannosides.

Deux anticorps monoclonaux ont été utilisés pour sensibiliser des particules de latex. L'anticorps monoclonal AF1, fourni par le Pr. A Cassone [Cassone, 1988 #3333] et l'anticorps monoclonal DF9-3, fourni par le Dr. M.

Borg-von-Zepelin [Borg-von-Zepelin, 1993 &num 283]. Ces anticorps monoclonaux sont spécifiques d'épitopes ß-1, 2 oligomannosidiques. Ils réagissent spécifiquement d'une part avec des ß-1, 2 oligomannosides dérivés du mannane convertis en néoglycolpides et utilisés pour sensibiliser des plaques de microtitration et d'autre part avec le PLM de C. albicans qui n'exprime que ce type d'épitopes.

[Trinel, 1992 #3603 ; Trinel, 1993 #3292 ; Trinel, 1999 &num 3692].

Les particules de latex, sensibilisées selon la méthode précédemment décrite sont du type bichro-latexOO.

Elles sont colorées et mises en suspension dans un tampon de couleur complémentaire facilitant la lecture et contenant une solution qui inhibe l'agglutination spontanée de levures [Quindos, 1997 &num 3321]. Lors de la pratique du test, 15uL d'une suspension 106 levures par mL (echelle de Mc farland) obtenue après 48h de culture à 24°C sur milieu de Sabouraud est mise en présence de 15 uL de Bichro-latex et agitée sur agitateur de Kline. Les scores d'agglutination sont appréciés à l'oeil nu après 1 min, 2 min et 3 min d'agitation selon une échelle de 0, 5 à 2 et cumulés. Cette méthode a fait preuve d'une excellente reproductibilité. Les agglutinations ont été pratiquées à l'aveugle sur les souches fournies par Schmidt avec des numéros arbitraire et les résultats ont été décryptés ultérieurement.

3) Animaux.

Les mères et leurs portées (10 à 15 souriceaux/portée) ont été livrées au 4sème jour de vie (lignée CD1@ (Crl : CD-1O (ICR) BR, Charles River, Saint Aubin les Elbeuf, France). Les animaux ont été inoculés au 66m'jour de vie. Une séparation de la mère pendant 3 heures avant gavage et une attente d'une heure après l'inoculation ont toujours été observées.

4) Souches.

Deux souches de C. albicans ont été utilisées, la souche 4276 exprimant peu de ßl-2 oligomannosides à sa surface, et la souche 4277 en exprimant beaucoup. Avant chaque utilisation, les souches ont été repiquées sur gélose de Sabouraud-chloramphénicol (SC) à partir d'une culture stockée à-80°C dans du PBS-glycérol 40%. Après incubation de 24 heures à 35°C, les levures ont été lavées 3 fois en eau physiologique stérile (NaCl 0, 9%, eau (p) et la suspension ajustée à 2 x 109/ml. La viabilité de l'inoculum a été vérifiée à chaque expérience par ensemencement de dilutions appropriées des suspensions de levures sur gélose SC en boite de Pétri.

5) Traitement par les sucres de synthèse.

Pour certaines expériences, des sucres de synthèse (Il-2 oligomannoside (Man) et a 1-2 oligomannosides (aMan) ont été administrés par gavage 1 heure avant inoculation. Les sucres ont dilués dans l'eau stérile de façon à obtenir la concentration désirée (voir résultats) dans un volume de 50 ul. Deux expériences indépendantes ont été entreprises. Dans la première, 4 portées infectées avec la souche 4277 ont été comparées après administration respective d'eau (portée 1), de 50 pg

de aMan (portée 2), 150 ug de ßMan (portée 3), ou de 150 ug de aMan (portée 4). Dans la deuxième expérience, quatre portées ont été infectées soit avec la souche 4276 (portées 1 et 2) soit avec la souche 4277 (portées 3 et 4), après traitement avec de 1'eau (portée 1 et 3) ou 50 ug de ßMan (portées 2 et 4).

6) Surveillance de l'infection.

-Mortalité : les cages ont été surveillées une fois par jour et le nombre de souriceaux répertorié -Colonisation digestive : de façon séquentielle à partir de J7 après l'inoculation, une crotte a été recueillie pour chaque souriceau, broyée dans 100ul d'eau stérile à l'aide d'un petit piston adapté aux tubes Eppendorf de 1, 5 ml, et le volume total a été ensemencé sur gélose SC en boite de Pétri. Le nombre d'unités formant colonies (UFC) a été compté après 24 heures d'incubation à 30°C. Lorsque la densité des UFC empchait leur numération, un score a été attribué selon l'aspect de la culture pour permettre les comparaisons statistiques : 2 ou 1000 UFC, 3 ou 10, 000 UFC, 4 ou 100, 000 UFC.

7) Analyse statistique.

Les colonisations digestives selon la souche infectante et selon le traitement précédent l'inoculation ont été comparées par un test non paramétrique (test de Mann-Whitney ou Kruskall-Wallis, selon le nombre de groupe) grâce au logiciel Statview 4. 5 pour Macintosh. Le pourcentage de cultures positives ou de morts à J1 a été comparé avec le Fisher exact test.

II-Résultats.

1) Expression de surface des [3-1, 2 oligomannosides selon la virulence de souches de sérotype A de C. albicans.

Les scores d'agglutination observés sur les 7 souches de sérotype A par des particules de bichro-latex sensibilisées par des anticorps monoclonaux anti-ß-1, 2 oligomannosides sont reportés sur le tableau 1, en fonction de leur virulence observée dans les modèles expérimentaux de candidose systémique. Toutes les souches avirulentes ont présenté un score d'agglutination inférieur aux souches virulentes ou d'une virulence intermédiaire.

Le tableau 1 ci-dessous présente les scores d'agglutination en utilisant des particules de bichro-latex sensibilisées par les anticorps DF9-3 et AF1 en fonction de la virulence des souches de C. albicans.

Tableau 1 DF9-3 AF1 Souches 1 2 3 Cumulé 1 2 3 Cumulé Total Statut min min min min min min ATCC 1 1, 5 1, 5 4 0, 5 1 1 2, 5 6, 5 virulent 44505 ATCC 0, 5 1 1 2, 5 1 1 1 3 5, 5 Avirulent 44831 ATCC 1 1, 5 2 4, 5 1 1, 5 1, 5 4 8, 5 virulent 62342 ATCC 1 1, 5 2 4, 5 0, 5 1 1 2, 7 Intermédiaire 32354 ATCC 1 1 1 3 0, 5 1 1 2, 5 5, 5 Avirulent 18804 ATCC 1 1, 5 2 4, 5 1 1, 5 2 4, 5 9 virulent 10261 ATCC 1 1 1, 5 3, 5 0, 5 0, 5 1 2 5, 5 Avirulent 102311 1 1 2) Différences de mortalité et de colonisation digestive observées selon l'inoculation à la souris d'une souche virulente exprimant davantage de ß-1, 2 oligomannosides qu'une souche non virulente. a) Mortalité.

En cumulant les données obtenues dans 3 expériences indépendantes, la mortalité précoce (J1) après inoculation de la souche 10261 était supérieure à celle observée après inoculation de la souche 10231 (3/63 vs.

1/62, p=0, 059 Fisher exact test). b) Colonisation digestive.

Le nombre d'UFC présentes était significativement plus grand lorsque les souriceaux avaient été inoculés avec la souche 4277 que lorsqu'ils l'avaient été avec la souche 4276, et ce à tous les temps de la surveillance (Tableau 1). Par ailleurs, la colonisation durait significativement plus longtemps (à J33 après infection, 11/11 souriceaux infectés avec la souche 10261 avaient encore des crottes infectées contre 5/11 souriceaux seulement pour ceux qui avaient été inoculés avec la souche 10231, p=0, 006 Fisher exact test).

3) Effet prophylactique de tetramannosides de synthèse d'anomérie a ou b-1, 2 sur la colinsation digestive.

L'administration de tetramannosides de synthèse préalablement à l'inoculation de la souche pathogène 4277 a abouti à des résultats différents selon l'anomérie de liaison des sucres utilisés. Les résultats sont rapportés sur le tableau 2 et la figure 11.

Le tableau 2 ci-dessous rapporte la cinétique du tube digestif en fonction de la souche infectante.

Tableau 2 UFC/crotte en moyenne déviation standard (n) Jour après ATCC10231 ATCC10261 P (Mann- infection Whitney) J12 154 143 (n=19) 609 340 (n=18) <0, 0001 J15 393 419 (n=12) 5777 4316 (n=11) 0, 0003 J19 58 62 (n=11) 795 354 (n=11) <0, 0001 J26 94 285 (n=11) 581 416 (n=11) 0, 0006 J33 2 + 3 (n=11) 1515 3008 (n=11) <0, 0001

L'administration d'aMan avant l'inoculation par la souche 10261 n'a pas modifié le degré de colonisation digestive (médiane des UFC= 258 vs. 196), tandis que celle de (3Man l'a diminué significativement et de façon d'autant plus importante que la dose était plus grande (médiane des UFC = 48, 5 pour 50 ug, p<0, 02 vs. témoin et 5 pour 150 ug, p<0, 0001 vs. témoin) (Figure 1).

III-Discussion.

La clonisation digestive est reconnue comme une source difficilement maîtrisable d'infection systémique candidosique chez les patients hospitalisés. Malgré l'importance biologique et médicale de la colonisation naturelle de l'homme par C. albicans ses mécanismes moléculaires intimes restent inconnus. La découverte récente et inattendue que la galectine-3 était une lectine endogène humaine servant de récepteur spécifique pour les P-1, 2 oligomannosides a permis d'ouvrir des perspectives nouvelles dans ce domaine car la galectine-3 est une lectine majoritairement exprimée sur les entérocytes.

Parallèlement, bien que les P-1, 2 oligomannosides apparaissent de plus en plus comme des molécules impliquées dans la pathogénèse des candidoses aucune étude n'avait concerné l'analyse de leur expression phénotypique en relation avec la pathogénicité des souches. Dans ce travail il est mainetant démontré que les différences de virulence observées entre souche de C. albicans dans des modèles de candidose systémique sont liées au niveau d'expression de surface de ß-1, 2 oligomannosides. Dans un second temps, il a été inoculé per os aux souriceaux nouveau nés des quantités identiques de levures provenant deux souches de virulence et de niveau d'expression d'oligomannosides différents ; La souche virulente exprimant davantage de 5- 1, 2 oligomannosides a entraîné une mortalité plus

importante des souriceaux ainsi qu'une colonisation plus intense et plus persistante. Ces résultats suggèrent que la virulence et/ou la quantité de ß-1, 2 oligomannosides présents à la surface des cellules des souches de levures sont liés à leur aptitude à entraîner le décès des souriceaux et à les coloniser plus intensément et plus longtemps. De façon à vérifier l'hypothèse du rôle des ß- 1, 2 oligomannosides dans la colonisation intestinale il a été administré ces résidus à titre prophylactique avant d'inoculer la souche la plus virulente. Le gavage des souriceaux par les P-1, 2 oligomannosides préalable à l'inoculation par C. albicans a entraîné une réduction de la colonisation dépendante de la dose administrée. La réduction quasi totale observée avec une dose de 150ig de P-1, 2 tétramannoside ne fut pas observée lorsqu'un a-1, 2 tétramannoside a été administré dans les mmes conditions, démontrant ainsi le rôle spécifique des ß-1, 2 oligomannosides dans la colonisation intestinale par C. albicans. Ces résultats permettent de concevoir des mesures prophylactiques visant à décoloniser le tube digestif des patients risquant de développer une candidose systémique au décours de leur hospitalisation. Il s'agit des patients devant tre soumis à des protocoles de chimiothérapie intensive, de greffe de moelle, d'organes solides, des patients de chirurgie digestive ou des patients de réanimation médicale capables de recevoir une alimentation entérale. Jusqu'à présent les méthodes prohylactiques ayant pour cible la décolonisation digestive ont été de plusieurs ordres. L'administration per os d'amphotéricine B, qui ne passe pas la barrière digestive n'a pas fourni de résultats véritablement probants. Plus récemment, l'administration d'immunoglobulines anti-C. albicans a été également proposée sans que l'on ne connaisse la nature des épitopes reconnus ni l'efficacité véritable de cette procédure.

L'administration de S. boulardii (S. cerevisiae) correspond

à des procédures connues de longue date sur l'utilisation de probiotiques susceptibles de rentrer en compétition avec C. albicans dans la niche écologique intestinale. Les données sur son efficacité sont contradictoires et quelques cas de septicémie déterminée par S. boulardii-au demeurant rares en regard du nombre de patients traités-risquent de remettre cette prophylaxie en question. L'utilisation de molécules de levures ayant un rôle dans l'adhésion comme les ß-1, 2 oligomannosides rentre dans le cadre du traitement probiotique. Ces P-1, 2 oligomannosides sont des molécules qui avec les levures qui les expriment naturellement à leur surface sont normalement présentes dans l'intestin et sont donc normalement tolérés par l'oganisme. Jusqu'à présent les études sur le rôle biologique de ces résidus ont été effectuées en utilisant du matériel préparé biochimiquement à partir de levures selon des procédures longues à réaliser et à standardiser avec tous les risque inhérents à la préparation voire la contamination de matériels biologiques. Une des originalités de cette étude repose sur l'utilisation de sucres de synthèse de structure parfaitement analogue à celle des sucres de C. albicans. La procédure suivie pour cette synthèse est facilement transposable à l'obtention en grandes quantités. Nombre de questions se posent concernant les mécanismes intimes de l'inhibition de la colonisation par C. albicans par les ß-1, 2 oligomannosides de synthèse ainsi que sur l'optimisation des doses des constructions chimiques. Il n'en reste pas moins que ce travail conforte sur le plan biologique les informations acquises sur l'importance physiopathologique des ß-1, 2 oligomannosides présentés spécifiquement par C. albicans aux cellules et aux lectines endogènes ses hôtes naturels. Il laisse également entrevoir le développement de mesures prophylactiques innovantes à base d'analogues de produits naturels de C. albicans et visant à décontaminer le tube

digestif des patients à risque. Cette stratégie pourrait en complément d'autres déjà en oeuvre aider à la résolution d'un problème infectieux majeur lié à la présence naturelle dans le tube digestif des patients hospitalisés d'un agent opportuniste dont les capacités infectieuses croissent parallèlement aux progrès des techniques médico- chirurgicales affectant l'homéostasie des patients..

Exemple 9 : Effets thérapeutiques des -1, 2 oligomannosides de synthèse sur les candidoses vaginales.

Les candidoses vaginales sont des infections opportunistes provoquées par principalement par C. albicans, une levure dans la règle inoffensive. Son habitat naturel est le tube digestif humain (environ 50% des individus) ainsi que le vagin chez environ 10% des femmes. Les levures se multiplient dans le vagin sans aucune manifestation pathologique. Leur présence est cependant est en relation avec l'état physiologique de la femme. Ainsi, durant la grossesse, le pourcentage de femmes dont le vagin est colonisé par C. albicans croit pour atteindre 30%.

En dehors de ces relations de simple portage en surface C. albicans peut envahir la sphère vaginale en provoquant des infections très gnantes avec démangeaisons, brûlures, pertes blanches. Les causes de leur survenue ne sont pas élucidées. Leur mécanisme est complexe et les symptômes de l'infection sont très certainement majorés par les réactions de défense.

On sait actuellement que 75% des femmes souffriront d'un épisode de candidose vaginale au moins une fois dans leur existence. Plus de 20% d'entre elles présenteront des récidives difficiles à soigner malgré des antifongiques en théorie très efficaces. Ces récidives ont un impact physique et psychologique sur une part insoupçonnée de la population féminine. Bien qu'il ne s'agisse pas d'une

maladie sexuellement transmissible au sens propre, elle perturbe la vie de millions de femmes et de couples.

Les inventeurs ont étudié les mécanismes mis en jeu lors de la transformation de la levure entre sa forme saprophyte, inoffensive et sa forme pathogène. Les principales propriétés biologiques de C. albicans impliquées dans la pathogénie sont celles qui lui permettent d'adhérer aux cellules de l'hôte, de pénétrer les tissus, d'éviter les réactions de défense.

En se fondant sur l'analyse des variations de C. albicans en relation avec sa pathogénicité, les invenetrus pu identifier des molécules par lesquelles C. albicans adhère aux cellules et qui sont capables de moduler la réponse immunitaire. Ces molécules ont comme point commun d'exprimer des sucres particuliers à certaines espèces de Candida et plus particulièrement à C. albicans : les ß-1, 2 oligomannosides.

Plusieurs travaux utilisant ces sucres purifiés à partir de C. albicans ont montré qu'ils se fixaient aux cellules humaines et que cette fixation, s'opérant par un récepteur spécifique entraînait une réponse de la cellule cible.

L'importance des ß-1, 2 oligomannosides dans la pathogénie des candidoses d'une part et les difficultés inhérentes à leur obtention en grande quantité à partir de la levure d'autre part, ont conduit à préparer et utiliser les homologues obtenus par synthèse chimique selon la présente invention.

Des travaux de recherches ont permis de montrer que la présence de ß-1, 2 oligomannosides dans les sécrétions vaginales était un excellent marqueurs du comportement pathogène de C. albicans.

Ainsi, il a été montré que des anticorps anti- mannane et qu'un anticorps monoclonal dénommé AF1

reconnaissant des ß-1, 2 oligomannosides protégeaient la rate contre une candidose vaginale.

Ces résultats permettent de considérer que la production de P-1, 2 oligomannosides par Candida albicans est un élément important dans les processus de pathogénèse des candidoses. Il a donc été considéré que l'administration de P-1, 2 oligomannosides de synthèse (en tant que leurres) pouvait saturer les ligands des cellules vaginales avec lequels C. albicans interagit et ainsi priver la levure de sites d'interaction spécifique.

Un modèle de candidose vaginale reconnu par la communauté internationale et avec lequel les expérimentations animales les plus pertinentes à ce jour ont été conduites a été utilisé.

Les résultats obtenus lors de deux séries expérimentales sont parfaitement concordants. Ils démontrent une relation dose-dépendante d'inhibition de la colonisation/infection par administration de P-1, 2 oligomannosides de synthèse lh, 24h, 48h après l'inoculation. Mme à la dose maximale, les a-1, 2 oligomannosides administrés de la mme façon à titre de témoin n'ont aucun effet comme montré dans le tableau 3 ci- après. Ainsi les animaux auxquels ont été administrés les P-1, 2 oligomannosides voient leur colonisation diminuer de près de moitié dès le premier jour d'administration et sont les seuls à ne plus tre porteurs de C. albicans à la fin des expériences.

Tableau 3 Jours SA-40 SA-40 SA-40 SA-40 SA-40 SA-40 CONTROL +ßM4 +ßM4 +ßM4 +αMAN +αMAN (150y) (100 y) (50 y) (100 y) (50 y) 0 >100 >100 >100 >100 >100 >100 1 >100 62 7 87 6 >100 >100 >100 2 >100 54 9 83 8 88 6 93 3 95 2 5 89 3 27 ~ 3 40 ~ 6 62 ~ 4 83 ~ 5 86 ~ 4 7 67 5 28 4 54 8 57 3 71 6 69 6 14 49 9 5, 6 3 45 ~ 14 23 ~ 5 495 48 ~ 4 21 20, 8 1, 7 <1 <1 <1 22, 4 21 4 3, 4

Il apparaît donc possible d'inhiber l'infection par C. albicans avec des sucres inoffensifs, totalement analogues aux naturels, par exemple contenus dans des ovules gynécologiques. Les implications de ces résultats sont importantes sur le plan médical et économique, par exemple comme un adjuvant aux traitements antifongiques classiques.