Tetrathiol-Liganden, Metallkomplexe, Konjugate und Kits, deren Verwendung in der nuklearmedizinischen Diagnostik und Endoradionuklidtherapie sowie Verfahren zur Herstellung der Tetrathiol-Liganden und Metallkomplexe

[0001] Die Erfindung betrifft das Gebiet der Radiopharmazie, insbesondere Metallkomplexe von Tetrathiol-Liganden und deren Verwendung als radioaktive Arzneimittel für die Diagnostik und in der Endoradionuklidtherapie sowie ein Verfahren zur Herstellung der Tetrathiol-Liganden und Metallkomplexe.

[0002] Die Diagnostik mit Technetium-99m-Präparaten findet in breitem Umfang

Anwendung zur Untersuchung des renalen und hepatobiliären Systems, des Skeletts, des Myokards und Hirns.

[0003] Rheniumisotope sind von Interesse für eine therapeutische Anwendung in der Endoradionuklidtherapie. Das ß-emittierende Isotope ¹⁸⁸ Re (E _max = 2.12 MeV) ist ein attraktives Radioisotop für Radiotherapie und Radioimmuntherapie, da es abgesehen von seinen therapierelevanten Strahlungseigenschaften leicht trägerfrei als Perrhenation (ReO ₄ ) in wässriger Lösung von einem ¹⁸⁸ WV ¹⁸⁸ Re Generatorsystem erhalten werden kann [

GUHLKE, S. Simple new method for effective concentration of 188Re Solutions from alumina-based 188W-188Re generator. J. Nucl. Med., 2000 S. 1271-8.

]. Durch die lange Lebensdauer des Generators steht ¹⁸⁸ Re zu niedrigen Kosten für die Routinepräparation von Radiopharmaka für die Behandlung beispielsweise von Tumorerkrankungen zur Verfügung.

[0004] Ungeachtet dessen gibt es bisher nur eine begrenzte Anzahl von Rheniumpräparaten wie ¹⁸⁶ Re-DMSA, ¹⁸⁶ Re-DTPA und ¹⁸⁶ Re-Diphosphonate für die Endoradionuklidtherapie. Diese Verbindungen sind jedoch unzureichend für eine therapeutische Anwendung, weil sie zu unspezifisch wirken.

[0005] Ein weiterer begrenzender Faktor bei der Entwicklung von Rheniumradiophamaka ist der Mangel an geeigneten Komplexbildnern, mit denen das radioaktive Metall stabil an andere Moleküle, insbesondere Biomoleküle, angekoppelt werden kann. Insbesondere ist die Stabilität vieler Rheniumchelate hinsichtlich Hydrolyse, Re-oxidation zu Perrhenat und Radiolyse, die unter Freisetzung des radioaktiven Metalls vom targetbindenden Radiopharmakon verläuft.

[0006] Derivate der Dimercaptobernsteinsäure wurden als Agentien für die Markierung von Proteinen und Antikörpern mit Technetium-99m und Rhenium- 186 bzw. Rhenium- 188 vorgeschlagen (

US 5175256 A 1992-12-29.

). Auch diese technische Lösung führt nicht zu klar definierten Verbindungen.

[0007] Hinsichtlich der genannten Stabilitätskriterien genügen die beschriebenen wie auch weitere Systeme noch nicht den Anforderungen für eine breite m-v/vo-Anwendung. [0008] Kürzlich beschrieben die Erfinder Tetrathiol-Liganden, die durch Verbrückung zweier DMSA-Moleküle zugänglich sind ( WO WO 2005/108330 A 2005-11-17.

). Die entsprechenden Technetium- und Rheniumkomplexe zeigen eine sehr hohe chemische und radiolytische Stabilität. Ein Nachteil dieses Ligandsystems ist jedoch die aufwendige organische Synthese über mehrere Stufen und die daraus resultierenden geringen Ausbeuten.

[0009] Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Tetrathiol-Liganden und deren radiolytisch und metabolisch stabile Metallkomplexe, die zur Konjugation mit Biomolekülen geeignet sind, sowie Verfahren zur Herstellung der Chelatliganden und Metallkomplexe anzugeben.

[0010] Gelöst wird die Aufgabe durch die in Anspruch 1 beschriebenen Liganden, sowie deren Verwendung zur Bindung von Radiometallen, vorzugsweise Technetium und Rhenium, an Biomoleküle.

[0011] Gegenstand der Erfindung ist ein Ligand der Formel

worin (CH-Rl) und (CH-Rl') substituierte oder unsubstituierte Methylenbrücken darstellen.

[0012] Die einzelnen Rl und Rl', sowie R3 und R3' sind jeweils unabhängig voneinander ausgewählt aus Wasserstoff, substituierten oder unsubstituierten Alkylgruppen, substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen. Bevorzugte Rl und Rl', sowie R3 und R3' sind jeweils Wasserstoff und Cl bis C3-Alkyl, besonders bevorzugt Methyl und Ethyl.

[0013] m und n sind positive ganze Zahlen, wobei m die Anzahl der Gruppen (CH-Rl') und n die Anzahl der Gruppen (CH-Rl) repräsentiert. Die Summe aus m und n liegt bevorzugt im Bereich von 4 bis 10, besonders bevorzugt sind n und m jeweils ausgewählt aus 2, 3 und 4.

[0014] R2und R2' sind unabhängig voneinander ausgewählt aus Wasserstoff, substituierten oder unsubstituierten Alkylgruppen, substituierten oder unsubstituierten Car- boxylgruppen, substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen oder der weiter unten definierten Gruppe Z. Bevorzugte R2und R2' sind unabhängig voneinander ausgewählt aus -COOH, Estergruppen und substituierten oder unsubstituierten Säurea- midgruppen.

[0015] X ist eine substituierte oder unsubstituierte Methylenbrücke mit der Formel CHR4 oder eine unsubstituierte Aminogruppe (N-H) oder substituierte Aminogruppe (N-Z).

[0016] Z steht für -(CH-R5)p-A, worin (CH-R5) eine substituierte oder unsubstituierte Methylenbrücke darstellt und p eine ganze Zahl ist, die für die Anzahl der Gruppen (CH-R5) steht. Bevorzugt liegt p im Bereich von 2 bis 8. Besonders bevorzugt ist p ausgewählt aus 4, 5 oder 6.

[0017] A stellt eine kopplungsfähige Einheit dar, d. h. eine funktionelle Gruppe, welche die einfache Anbindung eines organische Moleküls oder Biomolküls erlaubt. A ist bevorzugt ausgewählt aus Estergruppen, Säureamidgruppen, Isothiocyanatgruppen (-NCS), Thiolgruppen, Aminogruppen, Hydroxylgruppen und Halogenen, vorzugsweise Brom oder Iod.

[0018] R4 und die einzelnen R5 sind jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff, substituierten oder unsubstituierten Alkylgruppen, substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen. Bevorzugte R4 und R5 sind jeweils Wasserstoff und Cl bis C3-Alkyl, besonders bevorzugt Methyl und Ethyl.

[0019] Die Esterguppen in R2, R2' und A sind bevorzugt Carbonsäurestergruppen des Typs COOR mit R = Alkyl oder Aryl, vorzugsweise Cl bis C7 Alkyl oder Aryl, besonders bevorzugt ausgewählt aus Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, tert-Butyl, Phenyl, Benzyl, Tosyl, alkylsulfonyl, Polyethylenglykol (PEG).

[0020] Die Säureamidgruppen in R2, R2' und A sind vorzugsweise Carbonsäurea- midgruppen des Typs CON(R) ₂ mit R = Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy oder Aryl, bevorzugt Cl bis C7 Alkyl oder Aryl, besonders bevorzugt unabhängig voneinander ausgewählt aus Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, tert-Butyl, Phenyl, Benzyl, Tosyl, alkylsulfonyl, PEG.

[0021] Alternativ bilden die beiden R in der Säureamidgruppe CON(R) ₂ gemeinsam mit dem N einen acyclischen oder cyclischen Rest mit bevorzugt 3 bis 6 C- Atomen und ggf. 1 bis 6 weiteren Heteroatomen (bevorzugt ausgewählt aus N, S und O). Besonders bevorzugte acyclische und cyclische Reste sind ausgewählt aus:

(PEG) _n N

(PEG) _n

[0022] Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Konjugat aus einem erfindungsgemäßen Liganden und einem organischen Molekül oder Biomolekül, wobei die Anbindung des organischen Moleküls oder Biomoleküls über die funktionelle Gruppe A in X, R2 oder R2' erfolgt.

[0023] Bevorzugt ist das organische Molekül oder Biomolekül im Konjugat ausgewählt aus Proteinen, Zuckern, Lipiden, Nukleinsäuren, Antikörpern, Peptiden und Oligonu- kleotiden, sowie kleinen organische Molekülen, insbesondere Zytostatika. Die angebundenen organische Moleküle oder Biomoleküle sind vorzugsweise zielsuchende Moleküle (engl. Targeting units), d. h. Moleküle die vorteilhaft an ein bestimmtes Ziel (Target), d. h. bestimmte Zellen oder Organe, im Körper selektiv binden. Durch die Anbindung dieser Moleküle wird es möglich den radioaktiven Komplex gezielt zu bestimmten Organen oder Zellen, z. B. Karzinome, durch die Anbindung von Zytostatika, wie z. B. (Tamoxifen) zu dirigieren.

[0024] Der Begriff Antikörper im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst dabei neben monoklonalen und polyklonalen Antikörpern auch rekombinante Antikörper und Fragmente, wie z. B. scFv (single-chain-Fragmente) und Fab-Fragmente. Der Begriff Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung umfasst neben DesoyriboDnukleinDsäuren (DNA) und Ribonukleinsäuren (RNA) auch alle anderen linearen Polymeren in denen die Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) oder Uracil (U) in entsprechender Abfolge angeordnet sind, insbesondere Nukleinsäuren mit verändertem Rückgrat, wie z. B. einem Phosphothioat-, Phosphoramidat- oder O- Methyl-derivatisierten Rückgrat, Peptid-NukleinDsäuren (PNA), und locked nucleic acids (LNA). [0025] Die Erfindung umfasst auch Metallkomplexe der Formel

worin (CH-Rl) und (CH-Rl') einfach substituierte oder unsubstituierte Methylenbrücken darstellen, die einzelnen Rl und Rl', R2und R2', R3 und R3', m und n, sowie X jeweils unabhängig voneinander und wie oben definiert ausgewählt sind.

[0026] Y ist ein Metallatom oder ein Metallkomplex, bevorzugt ein Oxo- oder Nitri- dokomplex eines Metalls. Besonders bevorzugt ist Y ausgewählt aus ^99m Tc0, ¹⁸⁶ ReO, 1 ⁸⁸ ReO, ^99m TcN, ¹⁸⁶ ReN, ¹⁸⁸ ReN, ⁶⁴ Cu, ⁶⁷ Cu, ⁶⁸ Ga, Sn, Tc ³⁺ und Re ³⁺ , vorzugsweise Sn(IV).

[0027] Die Metallkomplexe mit den Radionukliden eignen sich für die Radiodiagnostik (insbesondere mit Tc) und die Radiotherapie (insbesondere mit Re). [0028] Der erfindungsgemäße Metallkomplex mit Zinn eignet sich besonders gut zur Herstellung eines nichtradioaktiven Kits, da das Zinn die vier Schwefelatome im Liganden koordinativ bindet und dadurch vor Oxidation schützt. Vorteilhaft lässt sich das Sn im Komplex leicht durch Technetium oder Rhenium verdrängen, wodurch der entsprechende Komplex mit ^99m Tc0, ¹⁸⁶ ReO, ¹⁸⁸ ReO, ^99m TcN, ¹⁸⁶ ReN oder ¹⁸⁸ ReN entsteht.

[0029] Gegenstand der Erfindung ist daher auch die Verwendung von Zinn zur Stabilisierung von Tetrathiolliganden, speziell im Bereich der Radiopharmazie. [0030] Wie auch die erfindungsgemäßen Liganden eignen sich die erfindungsgemäßen Metallkomplexe zur Konjugation mit einem Biomolekül. Auch hier erfolgt die die Kopplung über die funktionelle Gruppe A in X, R2 oder R2'. Das Biomolekül ist dazu bevorzugt wie oben beschrieben ausgewählt.

[0031] Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Liganden oder Konjugates zur Herstellung eines Metallkomplexes. [0032] Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Liganden oder Metallkomplexes zur Kopplung an Biomoleküle. [0033] Wichtiges Merkmal für die erfindungsgemäßen Verbindungen ist, dass sie über eine - gegenüber den bekannten verbrückten DMSA-Liganden - einfachere Synthese hergestellt werden können, die entsprechenden Technetium und Rhenium jedoch eine vergleichbar hohe chemische und radiolytische Stabilität aufweisen. Weiter wird durch eine spezielle Ausgestaltung des Komplexbildners die Bildung von Isomeren gezielt gesteuert: Im Gegensatz zur meso-DMSA handelt es sich bei der in der Erfindung verwendeten Dimercaptomaleinsäure (DMMA) um eine achirale Verbindung, d.h. sie enthält keine Stereozentren. Daher entsteht bei der Verbrückung zweier DMMA- Einheiten nur ein Isomer.

[0034] Durch Überbrückung zweier separater DMMA-Moleküle über eine modifizierte Kohlenstoffkette wird in der Erfindung ein neuer Komplexbildner synthetisiert, der vier zur Koordination an ein Metall befähigte Mercaptogruppen enthält, und dieser wird mit Technetium(V) oder Rhenium(V) zum entsprechenden Komplex umgesetzt. Die Länge der Kohlenstoffkette wird so gewählt, dass die Mercaptogruppen in sterisch günstiger Anordnung zum Metall stehen. In die Kohlenstoffkette ist eine Gruppe (X) eingebaut. Die Kopplung von biologisch aktiven Einheiten erfolgt entweder über die Gruppe (X) oder über R2 oder R2'.

[0035] Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Liganden mit folgenden Schritten:

1. Umsetzen von mit Thionylchlorid zu und ggf. (wenn nicht R2 = R2')

Umsetzen von mit Thionylchlorid zu

Mögliche Alternativen zum Thionylchlorid sind: PCl ₃ , PCl ₅ , POCl ₃ 2. Umsetzen des in Schritt 1. erhaltenen Säurechlorids mit

R3-(NH)-(CH-Rl) _n -X-(CH-Rl') _m -(NH)-R3' zu

3. Schwefelsubstitution durch Sauerstoff zu

bevorzugt in Gegenwart eines Quecksilbersalzes, besonders bevorzugt

Hg(II)acetat;

4. Hydrolyse zu

R R3 ¹

bevorzugt in Gegenwart einer Alkalilauge, besonders bevorzugt NaOH oder KOH.

[0036] (CH-Rl) und (CH-Rl') stellen jeweils einfach substituierte oder unsubstituierte Methylenbrücken dar. Die einzelnen Rl und Rl', R2und R2', R3 und R3', m und n, sowie X sind jeweils unabhängig voneinander und wie oben definiert ausgewählt. [0037] Schritt 2. wird bevorzugt unter Schutzgas durchgeführt und bevorzugt bei Temperaturen von - 20 ⁰ C bis 10 ⁰ C.

[0038] Die Herstellung der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Ausgangsverbindungen bevorzugt mit R2 und R2' unabhängig voneinander ausgewählt aus -COOH, Estergruppen und substituierten oder unsubstituierten Säureamidgruppen, geschieht bevorzugt durch:

1. Umsetzen von Dialkylacetylendicarboxylat mit Ethylentrithiocarbonat zum 2-Thioxo-l,3-dithiol-4,5-dicarbonsäuredialkylester, wobei Alkyl bevorzugt ausgewählt ist aus C1-C3, besonders bevorzugt Methyl,

2. Hydrolyse des Diesters zur Dicarbonsäure, bevorzugt durch Zugabe einer Säure,

3. Kondensation der Dicarbonsäure zum Anhydrid, bevorzugt durch Zugabe von Essigsäureanhydrid (vorzugsweise unter Schutzgas)

4. Umsetzen des so erhaltenen 2-Thioxo-l,3-dithiol-4,5-dicarbonsäure- Anhydrids mit

5. einem Alkohol HOR bzw. Amin zum Carbonsäurester des Typs COOR oder Carbonsäureamiddes Typs CON(R) ₂ , wobei R ausgewählt ist, wie zu R2, R2, R2' und A weiter oben angegeben.

[0039] Sind R2 und R2' freie Carboxylgruppen (-COOH) entfallen die Schritte 3. und 4..

[0040] Abbildung 1 zeigt eine vereinfachte schematische Übersicht des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens am Beispiel Rl = Rl' = R3 = R3' =H, n = m = 3 und R2 = R2' = C=O-R, wobei R für das obengenannte OR (aus COOR) oder N(R) ₂ (aus CON(R) ₂ ) steht, sowie der Herstellung des erfindungsgemäßen Komplexes mit Sn bzw. Oxo- technetium (M = Tc) oder Oxorhenium (M = Re).

[0041] Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines radioaktiv markierten Metallkomplexes oder Konjugates, durch Umsetzen

1. eines erfindungsgemäßen Liganden oder dessen Konjugat mit einem Biomolekül, eines Komplexes mit Y ausgewählt aus Sn und/oder ein Konjugats mit einem Zinnkomplex, mit

2. einem Metallsalz, bevorzugt Pertechnetat oder Perrhenat, in Gegenwart eines Reduktionsmittels, bevorzugt einem Zinn(II)salz (wie z. B. SnCl ₂ ).

[0042] Für die Herstellung der Nitridokomplexe (bevorzugt ^99m TcN, ¹⁸⁶ ReN oder ¹⁸⁸ ReN) wird zusätzlich zu den Komponenten 1. und 2. eine Stickstoffquelle, bevorzugt Dial- kylditihiocarbazat zu der Reaktionsmischung zugegeben.

[0043] Bevorzugt sind dazu in der Reaktionslösung Stabilisatoren enthalten, die dass

Zinnsalz stabilisieren, z. B. Tatrat, und ggf. auch Stabilisatoren für das Rhenium, z. B. Ascorbinsäure.

[0044] Die Herstellung des radioaktivmarkierten Metallkomplexes oder Konjugates mit

Technetium kann vorteilhaft bei Raumtemperatur erfolgen und wird vorzugsweise bei 15 bis 40 ⁰ C durchgeführt.

[0045] Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate aus Metallkomplex und

Biomokül wird bei den radioaktiven Metallen bevorzugt zunächst der nicht radioaktive Ligand oder der entsprechende Zinnkomplex an das Biomolekül gekoppelt und anschließend das radioaktive Metall oder der Metallkomplex (bevorzugt ^99m Tc0, ¹⁸⁶ ReO, 1 ⁸⁸ ReO, ^99m TcN, ¹⁸⁶ ReN oder ¹⁸⁸ ReN) an den Ligand gebunden. Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Konjugats aus einem Zinnkomplex und einem Biomokül wird bevorzugt zunächst der Zinnkomplex hergestellt und der Komplex über die funktionelle Gruppe A in X, R2 oder R2' an das Biomolekül gebunden. [0046] Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zur Herstellung eines Konjugates enthaltend

1. einen erfindungsgemäßen Liganden und/oder einen erfindungsgemäßen Metallkomplex mit Zinn (bevorzugt Sn(IV)),

2. Kopplungsreagenzien (wie z. B. BOP, HBTU, HATU, DCC)

3. Puffersubstanzen,

4. gegebenenfalls Stabilisatoren und Hilfsstoffe wie Tartrat, Glucose, Mannose,

Mannitol, Ascorbinsäure.

[0047] Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Kit zur Herstellung eines Metallkomplexes oder dessen Konjugate enthaltend

1. einen erfindungsgemäßen Liganden, dessen Konjugate mit einem Biomolekül und/oder einen erfindungsgemäßen Metallkomplex mit Zinn (bevorzugt Sn(IV)) oder dessen Konjugate,

2. Reduktionsmittel, bevorzugt ausgewählt aus Zinn(II)salzen (wie z. B. SnCl ₂ ),

3. gegebenenfalls eine Stickstoff quelle

4. Puffersubstanzen,

5. gegebenenfalls Stabilisierungsreagenzien, bevorzugt auswählt aus Tartrat, Oxalsäure und Ascorbinsäure

6. gegebenenfalls Hilfstoffe wie Glucose, Mannose, Mannitol, gamma-Cy- clodextrin.

[0048] Die Erfindung umfasst auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Liganden, eines erfindungsgemäßen Metallkomplexes oder deren Konjugate oder eines erfindungsgemäßen Kits in der Nuklearmedizin, insbesondere in der nuklearmedizinischen Diagnostik und in der Endoradionuklidtherapie.

Ausführungsbeispiele :

[0049] Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert ohne auf diese beschränkt zu sein.

[0050] Das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Liganden und deren Technetium- und Rhenium-Komplexe wird nachstehend am speziellen Beispiel erläutert - s. Reaktions Schema in . Herstellung von 2-Thioxo-l,3-dithiol-4,5-dicarbonsäuredimethylester 1

[0052] 10 g (70 mmol) Dimethylacetylendicarboxylat und 9,59 g (70 mmol) Ethylentrithio- carbonat werden in jeweils 35 ml Toluol gelöst. Anschließend werden beide Lösungen vereinigt und für 7 h unter Rückflussbedingung bei 12O ⁰ C erhitzt. Während der Reaktion findet ein Farbumschlag von gelb zu orange statt. Nach dem Erhitzen wird das Reaktionsgemisch weitere 12 h bei RT gerührt. Im Anschluss wird das Reaktionsgemisch am Rotationverdampfer auf die Hälfte eingeengt und bei 4 ⁰ C zum Auskristallisieren stehen gelassen. Durch sukzessive Konzentration des Filtrates erhält man weiteres Produkt. Durch Vereinigung der ersten beiden Feststoffe erhält man 11,07 g von Verbindung 1 als gelben, feinkristallinen Feststoff. Herstellung von 2-Thioxo-l,3-dithiol-4,5-dicarbonsäure Monohydrat 2

1 2

[0054] 4,16 g (16,6 mmol) Dimethylester 1 werden in einer Mischung aus 64 ml konzentrierter Salzsäure und 64 ml konzentrierter Essigsäure suspendiert. Das Reaktionsgemisch wird 4 Tage bei 4O ⁰ C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend langsam auf Raumtemperatur gekühlt, wobei ein orange-gelber, feiner Niederschlag entsteht. Bei 4 ⁰ C erfolgt die weitere Auskristallisierung des Produktes. Der gewonnene Feststoff wird abfiltriert und das erhaltene Filtrat um 50% am Rotationsverdampfer eingeengt. Durch die sukzessive Konzentration wird weiteres Produkt erhalten. Man erhält 3,66 g von Verbindung 2 als orange-gelben Feststoff

Herstellung von 2-Thioxo-l,3-dithiol-4,5-dicarbonsäure-Anhydrid 3

2 3

[0056] 1,06 g (4,41 mmol) Dicarbonsäure 2 werden in 6,24 ml (66 mmol) Essigsäureanhydrid als Reaktand und Lösungsmittel unter Schutzgasatmosphäre für 1,5 Stunden bei einer Temperatur von 40 ⁰ C gerührt. Anschließend lässt man das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen, wobei ein feinkristalliner gelber Feststoff ausfällt. Durch Einengen der Lösung bis zur Trockne am Rotationsverdampfer (Argon-Belüftung) erhält man 961,15 mg eines gelben feinkristallinen Feststoffes. Herstellung von

5-(Morpholin-N-carbonyl)-2-thioxo-l,3-dithiol-4-carbonsä ure 4

[0058] Es werden 905 mg (4,43 mmol) des Anhydrids 3 in 30 ml wasserfreiem Dich- lomethan gelöst und im Kolben vorgelegt. Unter Eisbadkühlung und Schutzgasatmosphäre tropft man 386 μl (4,43 mmol) Morpholin in 10 ml Dichlormethan innerhalb einer Stunde dem Reaktionsgemisch zu. Anschließend wird das gelbe Gemisch für eine weitere Stunde bei 0 ⁰ C gerührt, wobei ein Feststoff ausfällt. Es wird nun für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt und das Gemisch bei 4 ⁰ C über Nacht auskristallisieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wird am Rotationsverdampfer bis zur Trockne eingeengt. Man erhält 1,44 g eines leuchtend gelben Feststoffes. Herstellung von 5-(Morpholin-N-carbonyl)-2-thioxo-l,3-dithiol-4 carb- onsäurechlorid 5

4

5

[0060] 200 mg (0,69 mmol) Morpholin- Amid 4 werden in einem mit Argon befüllten

Kolben vorgelegt. Es werden 3,00 ml (41,4 mmol) Thionylchlorid als Reaktand und Lösungsmittel zugegeben. Das Reaktionsgemisch für unter Rühren auf T = 30 ⁰ C erhitzt. Nach 1 h geht die anfänglich hellgelbe Suspension in eine klare orange Lösung über. Während der Reaktion kann eine stetige Gasentwicklung beobachtet werden. Nach einer Reaktionszeit von 17 h wird das überschüssige Thionylchlorid im Vakuum vollständig entfernt (1 mbar für 6 h). Man erhält 230 mg einer orangen und zäh- flüssigen Substanz, die auf Grund ihrer hohen Reaktivität nicht weiter charakterisiert werden kann und somit direkt für Folgereaktionen verwendet wird. Herstellung von tert-

Butyl-bis{3-[4-(morpholin-N-carbonyl)-2-thioxo-l,3-dithio l-5-carboxamido]pr opyl}carbamat 7

[0062] 233,8 mg (0,75 mmol) Säurechlorid 5 werden in 4 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst und im Kolben unter Argon- Atmosphäre vorgelegt. Weiter werden 105 μl (0,75 mmol) Triethylamin in 1 ml wasserfreien Dichlormethan bei 0 bis 5 ⁰ C zugegeben. Dabei kommt es zu einer kurzen Rauchentwicklung. Es werden 87,9 mg (0,38 mmol) in 4 ml trockenem Dichlormethan gelöstes te/t-Butyl-bis(3-aminopropyl)carbamat 6 dem Reaktionsgemisch im Zeitraum von 5 min langsam zugetropft. Anschließend wird die gelb-braune Lösung 1 h bei 0 bis 5 ⁰ C gerührt, das Eisbad entfernt und 4 Tage bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird durch Vakuumdestillation entfernt und es verbleibt ein braunes öliges Rohprodukt. Dieses wird in wenig Chloroform aufgenommen und säulenchromatografisch über Kieselgel 60 mit dem Elutionsmit- telgemisch Chloroform/Propan-2-ol (9,5:0,5) gereinigt. Man erhält 96 mg des Zielproduktes 7 als gelb-braunes Öl. N,N'-(iminodipropane-3,l-diyl)bis[5-(morpholin-4-ylcarbonyl) -2-oxo-l,

3-dithio-4-carboxamide] 8

[0063]

8

[0064] 81 mg (0,1 mmol) von Verbindung 7 werden in 4-5 ml Essigsäure gelöst. Zu der orange-klaren Lösung werden 199 mg Quecksilber(II)acetat (0,6 mmol), gelöst in 3-4 ml Essigsäure beigemengt, wobei sich augenblicklich ein weißer Niederschlag bildet. Nach 4 Tagen Rühren bei Raumtemperatur wird die entstandene Suspension bis zur Trockne eingeengt. Das Produkt 8 wird durch 3-4maliges Extrahieren mit Chloroform aus dem vorliegenden Feststoff extrahiert und liegt nach dem Entfernen des Lösungsmittels als hellgelbes Pulver vor. N,N'-(iminodipropane-3,l-diyl)bis[4-(morpholin-4-yl)-4-oxo-2 ,3-disulfa nylbut-2-enamide] 9

[0066] 0,1 mmol von Verbindung 8 werden in 4 ml Methanol gelöst. Zu der gelben Lösung werden 0,4 mmol NaOH, gelöst in 3 ml Methanol beigemengt. Nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht wird die entstandene Suspension bis zur Trockne eingeengt und der verbleibende Feststoff mit 5ml 1 mol/1 Salzsäure suspendiert. Das Produkt 9 wird durch 3-4maliges Extrahieren mit Chloroform extrahiert und liegt nach dem Entfernen des Lösungsmittels als hellbraunes Pulver vor. Zinn-(IV)-Komplex (10) des Tetrathiol-Liganden 9

[0067]

10

[0068] 0,1 mmol von Verbindung 9 werden in 3 ml Acetonitril gelöst. Nach Zugabe von 0,1 mmol SnCl ₄ , gelöst in 2 ml Acetonitril, rührt man 4 Stunden bei Raumtemperatur. Nach Abzug des Lösungsmittels verbleibt das Zielprodukt 10 als hellgelber Feststoff. Oxorhenium(V)-Komplex des Tetrathiol-Liganden 9

I l

[0070] Bei Raumtemperatur werden 0,15 mmol [NBu ₄ ][ReOCl ₄ ] in 100 ml trockenem MeOH vorgelegt. Unter Rühren werden 0,15 mmol 9 in 100 ml MeOH gelöst zur Reaktionsmischung langsam zugegeben. Die Farbe der Lösung ändert sich von grün nach orange-braun. Die Reaktion wird mittels DC kontrolliert und ist nach 1-2 h beendet. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und man erhält 190 mg Rohprodukt als braunes Öl. Das ölige Produkt wird mit einem Isopropanol/ Chloroform/ Ammoniak-Eluentengemisch (5:4:1) über Kieselgel gereinigt. 1 ⁸⁸ ReO-Komplex des Tetrathiol-Liganden 9

IO [0072] 0,1 mg Komplex 10, gelöst in einer Mischung aus 0,5 ml Methanol und 0,2 ml Pro- pylenglykol wird mit 0,5 ml Perrhenat-Generatoreluat versetzt. Nach Zugabe von 1,0 mg SnCl ₂ , gelöst in 0,1 ml 0,1 mol/1 HCl, hält man die Reaktionsmischung 30 min bei 50 ⁰ C. Radiochemische Ausbeute ca. 90 %. 9 ^9m TcO-Komplex des Tetrathiol-Liganden 9

10

I l

[0074] 0,1 mg Komplex 10, gelöst in einer Mischung aus 0,2 ml Methanol, 0,2 ml Propy- lenglykol und 0,02 ml 1 n NaOH , wird mit 0,2 ml Pertechnetat-Generatoreluat versetzt. Nach Zugabe von 0,5 mg SnCl ₂ , gelöst in 0,1 ml Methanol, hält man die Reaktionsmischung 10 min bei Raumtemperatur. Radiochemische Ausbeute ca. 90 %. Konjugation eines Oligonucleotides

[0075] Einführung eines aktivierten Linkers

[0077] Zur Darstellung des maleinimidfuktionalisiertem Derivates werden 1,1 äquimol. MPS (3-Maleinimidopropionsäuresuccinimidylester), gelöst in Acetonitril oder DMF (Dimethylformamid) zum ebenfalls in Acetonitril bzw. DMF gelösten und mit 2.0 äquimol. Triethylamin versetztem Oxo-Liganden 8 langsam bei Raumtemperatur zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird nun für 24 h bei RT gerührt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels wird mit dem verbleibenden Rückstand direkt weitergearbeitet.

[0078] Konjugation des Oligonukleotides [0079]

[0080] Die Konjugation des 1-Mercaptohexylmodifizierten 17mers (SEQ ID No. 1) wird dieses in einem 20 mmol/1 Boratpuffer (pH = 5) gelöst. Die Ligandvorstufe 12 wird ebenfalls im 2,5fachen Überschuss im Boratpuffer gelöst und langsam bei Raumtemperatur zugetropft. Die ReaktionsDzeit beträgt ca. 12 h. Die Isolierung des Produktes erfolgt durch Zugabe von Ethanol (bis zu einem Ethanol/Wasser- Verhältnis von 90: 10). Nach erfolgter Zentrifugation wird der Überstand entfernt und die Produktpellets in wenig Wasser gelöst. Im Anschluss erfolgt wiederum eine Etha- nolfällung. Diese Reinigungsprozedur wird insgesamt 3 bis 4mal durchgeführt.

[0081] Herstellung des Zinn-Komplexes

[0083] Zur Entfernung der Schutzgruppen von Verbindung 13 wird diese in konzentriertem Ammoniak gelöst und bei 50 ⁰ C für 4 h gerührt. Die Reaktionslösung wird vollständig eingeengt. Zur Isolierung des freien Tetrathiol-Oligonukleotid-Konstruktes kann die oben beschriebene Reinigung via Ethanolfällung herangezogen werden. Die Herstellung des Zinnkomplexes erfolgt wie oben beschrieben. Synthese des 12-Krone-4-tragenden Tetrathiol-Liganden

[0084] 1. Stufe:

[0086] 1,11 g (5,43 mmol) des Anhydrids 3 werden in 20 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst. Anschließend wird Argon über diese Lösung geleitet und auf 0-5 ⁰ C gekühlt. 0,95 g (5,43 mmol) l-Aza-12-Krone-4 werden in 10 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst und der Anhydrid- Lösung über einen Zeitraum von 60 min zugetropft. Das Gemisch wird nun für eine weitere Stunde unter Eisbadkühlung und danach für zwei weitere Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Rohprodukt am Rotationsverdampfer eingeengt und das zurückbleibende Öl mit n-Hexan versetzt. Die überstehende, hellgelbe Hexanfraktion wird angenommen. Dieser Vorgang wird mehrmals wiederholt. Dem zurückbleibenden, dunkelgelbe Öl wird vorsichtig unter vermindertem Druck restliches Lösungsmittel entfernt. Das Produkt liegt in Form eines gelben, schaumartigen Feststoffes (2,1 g).

[0087] 2. Stufe:

[0089] 200 mg (0,527 mmol) des 12-Krone-4-Amides werden mit einem 60-fachen

Überschuss an Thionylchlorid versetzt. Es entsteht eine gelbe Suspension, die auf 30 0C erwärmt und für 18 h gerührt wird. Während der Reaktionsdauer wird die Suspension zur orange, klaren Lösung. Eine stetige Gasentwicklung ist weiterhin zu beobachten. Das Reaktionsgemisch wird am Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingeengt und für den Druckausgleich (Belüftung) Argon verwendet. Dem zurückbleibenden Öl werden mittels Hochvakuumpumpe (< 0.5 mbar) das restliche Thionylchlorid sowie im Öl verbliebenen gasförmigen Nebenprodukte entfernt und für den Druckausgleich (Belüftung) Argon verwendet. Das erhaltene Produkt liegt als klares, orange und stark viskoses Öl vor und wird auf Grund der enorm hohen Hydrolyseempfindlichkeit sofort der Nachfolgereaktion zugeführt.

[0090] 3. Stufe:

[0092] Das Frisch hergestellte Carbonsäurechlorid wird in 4 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst und im Kolben unter Argon- Atmosphäre vorgelegt. Weiter werden 2 Moläquivalente der Komponente 6 sowie 8 Moläqivalente an Triethylamin in 1 ml wasserfreien Dichlormethan gelöst und bei 0 bis 5 ⁰ C dem Säurechlorid zugegeben. Dabei kommt es zu einer kurzen Rauchentwicklung. Es werden 87,9 mg (0,38 mmol) in 4 ml trockenem Dichlormethan gelöstes te/t-Butyl-bis(3-aminopropyl)carbamat 6 dem Reaktionsgemisch im Zeitraum von 5 min langsam zugetropft. Anschließend wird die gelb-braune Lösung 1 h bei 0 bis 5 ⁰ C gerührt, das Eisbad entfernt und 2 Tage bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird durch Vakuumdestillation entfernt und es verbleibt ein braunes öliges Rohprodukt. Dieses wird in wenig Chloroform aufgenommen und säulenchromatografisch über Kieselgel 60 mit dem Elutionsmit- telgemisch Chloroform/Methanoll (19:1) gereinigt. Man erhält das Zielproduktes in 70 %iger Ausbeuteals gelb-braunen und pulvrigen Feststoff.

[0093] 4. Stufe:

[0094]

[0095] Die verbrückten und Boc-geschützen Verbindungen werden in 2-4 ml Trifluores- sigsäure gelöst. Nach 12 h wird unter Hochvakuumbedingungen (< 0.5 mbar) die überschüssige Trifluoressigsäure entfernt. Die Produkte liegen in Form eines pulvrigen, gelben Feststoffes vor. Lässt sich die Trifluoressigsäure nicht vollständig entfernen (Produkt liegt als zähes Öl vor), so kann dieses in wenig Dichlormethan gelöst werden und mittels Diethyletherzugabe gefällt werden. Um Ausbeuteverluste zu vermeiden, werden die überstehende Lösungsmittel (Dichlormethan und Ether) am Rotationsverdampfer entfernt. Alle Entschützungen verlaufen nahezu quantitativ und die Produkte liegen als Trifluoracetatsalze vor.

[0096] 5. Stufe:

[0098] Der jeweilige Ligand wird in Methanol (1 ml pro 100 mg Ligand) gelöst. Das Methanol muss sauerstofffrei sein. Dieses kann durch Einleiten von Helium und anschließender Ultraschallbehandlung erreicht werden. Zum gelösten Ligand werden 4-5 Moläquivalente an Natriumhydroxid in Form einer methanolischen Natriumhydroxidlösung beigemengt. Nach 12 h Reaktionszeit kann das Lösungsmittel entfernt werden und der Ligand mit Dichlormethan extrahiert werden. Durch Zugabe von TFA und anschließender Entfernung des Lösungsmittels und überschüssiger TFA liegt das Produkt als TFA-SaIz in Form eines tiefroten Feststoffes vor. Synthese des 18-Krone-6-tragenden Tetrathiol-Liganden

[0099] 1. Stufe:

[0101] 1,19 g (5,84 mmol) Thio- Anhydrid 3 werden in 20 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst. Anschließend wird Argon über diese Lösung geleitet und auf 0-5 ⁰ C gekühlt. 1,54 g (5,84 mmol) l-Aza-18-Krone-6 werden in 10 ml trockenem Dichlormethan gelöst und der Anhydrid- Lösung über einen Zeitraum von einer Stunde zugetropft. Das Gemisch wird nun für eine weitere Stunde unter Eisbadkühlung gerührt und danach für zwei weitere Stunden gerührt. Anschließend wird das Rohprodukt am Rotationsverdampfer eingeengt. Dieser Vorgang wird mehrmals wiederholt. Dem zurückbleibenden, dunkelgelben Öl wird vorsichtig unter vermindertem Druck restliches Lösungsmittel entfernt. Das Produkt liegt in Form eines gelben, schaumartigen Feststoffes (2,73 g).

[0102] 2. Stufe:

[0104] 200 mg (0,428 mmol) des 18-Krone-6-Amides werden mit einem 60-fachen

Überschuss an Thionylchlorid versetzt. Es entsteht eine gelbe Suspension, die auf 30 0C erwärmt und für 18 h gerührt wird. Während der Reaktionsdauer wird die Suspension zur orange, klaren Lösung. Eine stetige Gasentwicklung ist weiterhin zu beobachten. Das Reaktionsgemisch wird am Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingeengt und für den Druckausgleich (Belüftung) Argon verwendet. Dem zurückbleibenden Öl werden mittels Hochvakuumpumpe (< 0.5 mbar) das restliche Thionylchlorid sowie im Öl verbliebenen gasförmigen Nebenprodukte entfernt und für den Druckausgleich (Belüftung) Argon verwendet. Das erhaltene Produkt liegt als klares, orange und stark viskoses Öl vor und wird auf Grund der enorm hohen Hydrolyseempfindlichkeit sofort der Nachfolgereaktion zugeführt.

[0105] 3. Stufe:

[0107] Das Frisch hergestellte Carbonsäurechlorid wird in 4 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst und im Kolben unter Argon- Atmosphäre vorgelegt. Weiter werden 2 Moläquivalente der Komponente 6 sowie 8 Moläqivalente an Triethylamin in 1 ml wasserfreien Dichlormethan gelöst und bei 0 bis 5 ⁰ C dem Säurechlorid zugegeben. Dabei kommt es zu einer kurzen Rauchentwicklung. Es werden 87,9 mg (0,38 mmol) in 4 ml trockenem Dichlormethan gelöstes te/t-Butyl-bis(3-aminopropyl)carbamat 6 dem Reaktionsgemisch im Zeitraum von 5 min langsam zugetropft. Anschließend wird die gelb-braune Lösung 1 h bei 0 bis 5 ⁰ C gerührt, das Eisbad entfernt und 2 Tage bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird durch Vakuumdestillation entfernt und es verbleibt ein braunes öliges Rohprodukt. Dieses wird in wenig Chloroform aufgenommen und säulenchromatografisch über Kieselgel 60 mit dem Elutionsmit- telgemisch Chloroform/Methanoll (19:1) gereinigt. Man erhält das Zielproduktes in 70 %iger Ausbeuteals gelb-braunen und pulvrigen Feststoff.

[0108] 4. Stufe:

[0109]

[0110] Die verbrückten und Boc-geschützen Verbindungen werden in 2-4 ml Trifluores- sigsäure gelöst. Nach 12 h wird unter Hochvakuumbedingungen (< 0.5 mbar) die überschüssige Trifluoressigsäure entfernt. Die Produkte liegen in Form eines pulvrigen, gelben Feststoffes vor. Lässt sich die Trifluoressigsäure nicht vollständig entfernen (Produkt liegt als zähes Öl vor), so kann dieses in wenig Dichlormethan gelöst werden und mittels Diethyletherzugabe gefällt werden. Um Ausbeuteverluste zu vermeiden, werden die überstehende Lösungsmittel (Dichlormethan und Ether) am Rotationsverdampfer entfernt. Alle Entschützungen verlaufen nahezu quantitativ und die Produkte liegen als Trifluoracetatsalze vor.

[Ol l i] 5. Stufe:

[0113] Der jeweilige Ligand wird in Methanol (1 ml pro 100 mg Ligand) gelöst. Das

Methanol muss sauerstofffrei sein. Dieses kann durch Einleiten von Helium und anschließender Ultraschallbehandlung erreicht werden. Zum gelösten Ligand werden 4-5 Moläquivalente an Natriumhydroxid in Form einer methanolischen Natriumhydroxidlösung beigemengt. Nach 12 h Reaktionszeit kann das Lösungsmittel entfernt werden und der Ligand mit Dichlormethan extrahiert werden. Durch Zugabe von TFA und anschließender Entfernung des Lösungsmittels und überschüssiger TFA liegt das Produkt als TFA-SaIz in Form eines tiefroten Feststoffes vor. 6 ⁴ Cu-Markierungen :

[0114] 10 μg des Tetrathiol-Liganden 9, gelöst in einer Mischung aus 0,1 ml DMF und 0,1 ml einer 100 mM Amminoumacetat-Puffer-Lösung (pH = 6,5) mit 40 MBq [ ⁶⁴ Cu]-CuCl ₂ versetzt, ausgiebig mit einem Vortexer geschüttelt und für 10 min bei

Raumtemperatur in einem Eppendorf- Mixer geschüttelt. Die radiochemische Ausbeute beträgt ca. 95 %.

⁶⁸ Ga-Markierungen : [0115] 10 μg des Tetrathiol-Liganden 9, gelöst in einer Mischung aus 0,1 ml DMF und 0,1 ml einer 100 mM Amminoumacetat-Puffer-Lösung (pH = 6,5) mit frisch eluiertem [ ⁶⁸

Ga]GaCl ₃ (10 MBq) versetzt und ausgiebig mit einem Vortexer geschüttelt. Die Kom- plexierung findet bei in einem Eppendorf-Mixer statt und ist nach 10 min vollständig.

Die radiochemische Ausbeute beträgt ca. 85 %.

Darstellung von Aktivesterderivaten [0116] Hydroxysuccinimidylester des Morpholino-Derivates: [0117] 7V^V-Bis-(3-{[(5-(morpholin-4-carbonyl)-2-thioxo-[l,3]dithio l-4-carbonyl]amino

}-propyl)hydroxysuccinimidylester

[0119] 100 mg des TFA-Salzes der boc-entschützten Morpholino- Verbindung werden in 5 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst und 42,0 μl Triethylamin zugegeben. Nach 10 min erfolgt die Zugabe von 18,0 mg Bernsteinsäureanhydrid. Die Beendigung der Reaktion kann mittels Dünnschichtchromatographie (Kieselgelplatten mit Methanol- Chlorform 1:10 als Laufmittel) bestimmt werden. Im Anschluss werden 5 ml einer 0,1 N HCl-Lösung zugegeben und das entstehende 2-Phasensystem für 3-4 h intensiv gerührt. Im Anschluss erfolgt eine Phasentrennung und nach vollständigem Entfernen von Dichlormethan erhält man das gewünschte Zwischenprodukt aus der organischen Phase. Diese Zwischenverbindung wird wiederum in 2 ml wasserfreiem Dichlormethan und 2 ml wasserfreiem Acetonitril gelöst und 1,5 Moläquivalente an Di- succinimidylcarbonat zugegeben. Im Anschluss erfolgt die Zugabe von 50 μl Triethylamin. Die Vollständigkeit der Reaktion kann mittels Dünnschichtchromatographie (Kieselgelplatten mit Methanol-Chlorform 1:10 als Laufmittel) verfolgt werden. Nach Beendigung der Reaktion wird 0,1 N HCl-Lösung zugegeben und für 1 h gerührt. Aus der organischen Phase kann das Produkt durch vollständige Entfernung des Lösungsmittels rein isoliert werden. Hydroxysuccinimidylester des 12-Krone-4-Derivates:

[0120] 7V^V-Bis-(3-{[(5-(l,4,7,10,13-pentaoxa-16-aza-cyclooctadecan -16-carbonyl)-2-thi oxo-[l,3]dithiol-4-carbonyl]amino}-propyl)hydroxysuccinimidy lester

[0122] 100 mg des TFA-Salzes der boc-entschützten 12-Krone-4- Verbindung werden in 5 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst und 32,6 μl Triethylamin zugegeben. Nach 10 min erfolgt die Zugabe von 14,1 mg Bernsteinsäureanhydrid. Die Beendigung der Reaktion kann mittels Dünnschichtchromatographie (Kieselgelplatten mit Methanol- Chlorform 1:10 als Laufmittel) bestimmt werden. Im Anschluss werden 5 ml einer 0,1 N HCl-Lösung zugegeben und das entstehende 2-Phasensystem für 3-4 h intensiv gerührt. Im Anschluss erfolgt eine Phasentrennung und nach vollständigem Entfernen von Dichlormethan erhält man das gewünschte Zwischenprodukt aus der organischen Phase. Diese Zwischenverbindung wird wiederum in 2 ml wasserfreiem Dichlormethan und 2 ml wasserfreiem Acetonitril gelöst und 1,5 Moläquivalente an Di- succinimidylcarbonat zugegeben. Im Anschluss erfolgt die Zugabe von 50 μl Triethylamin. Die Vollständigkeit der Reaktion kann mittels Dünnschichtchromatographie (Kieselgelplatten mit Methanol-Chlorform 1:10 als Laufmittel) verfolgt werden. Nach Beendigung der Reaktion wird 0,1 N HCl-Lösung zugegeben und für 1 h gerührt. Aus der organischen Phase kann das Produkt durch vollständige Entfernung des Lösungsmittels rein isoliert werden. Konjugation der Hydroxysuccinimidyl-Aktivester mit einem Oligo- nukleotid und anschließender Abspaltung der Thiolschutzgruppen:

[0123] Morpholin-BS-DNA-Tetrathiol-Ligand:

CGT OGC OTC GCT GCG-(OH)- ¹ [0125] Der Aktivester wird im 20fachen Überschuss zur DNA in 200 μl Dichlormethan gelöst und in einem Eppendorf- Vial (low-DNA-binding) vorgelegt. Das Oligo- nukleotid wird in 200 μl 85 mM Phosphatpuffer bei pH = 7.0 gelöst und zur Dichlor- methanlösung beigemengt. Anschließend werden 100 μl DMF zugegeben und für mindestens 1O d und intensivem Schütteln (Durchmischung der beiden Phasen notwendig) zur Reaktion gebracht. Die Reaktionskontrolle kann mittels HPLC unter Verwendung einer speziell für die Trennung von Oligonukletiden entwickelten Säule und gepuffertem Laufmittel verfolgt werden. Nach Beendigung kann die organische Phase abgetrennt werden und somit überschüssiger Ligand zurückgewonnen werden. Der wässrige, gelb gefärbte Phase werden alle Lösungsmittel entfernt und das thiol- geschützte DNA-Konjugat via HPLC-Reinigung isoliert. Dieses wird zur Entschützung vollständig entionisiertem Wasser gelöst und durch Zugabe einer Natriumhydroxidlösung (Suprapur) auf einen pH-Wert von 9-10 gebracht. Die Beendigung der Reaktion wird mittels HPLC ermittelt. Nach dem Lyophillisieren wird das Produkt durch HPLC-Reinigung und Lyophillisieren als gelber, fluffiger Feststoff erhalten.

[0126] 12-Krone-4-BS-DNA-Tetrathiol-Ligand:

[0128] Der Aktivester wird im 20fachen Überschuss zur DNA in 200 μl Dichlormethan gelöst und in einem Eppendorf- Vial (low-DNA-binding) vorgelegt. Das Oligo- nukleotid wird in 200 μl 85 mM Phosphatpuffer bei pH = 7.0 gelöst und zur Dichlor- methanlösung beigemengt. Anschließend werden 100 μl DMF zugegeben und für mindestens 10 d und intensivem Schütteln (Durchmischung der beiden Phasen notwendig) zur Reaktion gebracht. Die Reaktionskontrolle kann mittels HPLC unter Verwendung einer speziell für die Trennung von Oligonukletiden entwickelten Säule und gepuffertem Laufmittel verfolgt werden. Nach Beendigung kann die organische Phase abgetrennt werden und somit überschüssiger Ligand zurückgewonnen werden. Der wässrige, gelb gefärbte Phase werden alle Lösungsmittel entfernt und das thiol- geschützte DNA-Konjugat via HPLC-Reinigung isoliert. Dieses wird zur Entschützung vollständig entionisiertem Wasser gelöst und durch Zugabe einer Natriumhydroxidlösung (Suprapur) auf einen pH-Wert von 9-10 gebracht. Die Beendigung der Reaktion wird mittels HPLC ermittelt. Nach dem Lyophillisieren wird das Produkt durch HPLC-Reinigung und Lyophillisieren als gelber, fluffiger Feststoff erhalten. 4-(5-Carboxy-2-thioxo-[l,3]-dithiol-4-carbonyl)-l-methylpipe razinhydr ochlorid (Methylpiperazinamid)

[0130] Es werden 0,425 g (2,08 mmol) Anhydrid in 5 ml wasserfreiem Dichlormethan unter Argon gelöst. Anschließend wird eine Lösung aus 0,36g (2,08 mmol) und 290 μl (2,08 mmol) TEA in 15 ml wasserfreiem Dichlormethan innerhalb von 30 min langsam zugegeben. Der Ansatz wird über Nacht gerührt. Aus der Lösung fällt ein gelber Niederschlag aus, dieser wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Man erhält 0,618g eines hellgelben, feinkristallinen Feststoffes. 5-(4-Methylpiperazin-l-carbonyl)-2-thioxo-[l,3]dithiol-4-car bonsäure-

Trifluoracetat (Methylpiperazinamid)

[0131]

[0132] 57,2 mg (0,25 mmol) Anhydrid werden in 3 ml wasserfreiem Dichlormethan unter

Argon gelöst. Das 1-Methylpiperazinbistrifluoracetat (103,05 mg; 0,28 mmol) wird mit 39 μl (0,28 mmol) TEA versetzt und anschließend in 6 ml Dichlormethan gelöst. Es bildet sich eine leicht trübe Suspension. Die Suspension wird innerhalb von 5 min zugetropft. Nach 10 min beginnt ein gelber Feststoff auszufallen. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgetrennt. Der Feststoff wird mit Dichlormethan gewaschen, an- schließend abfiltriert und im Vakuum getrocknet. Es entstehen 58 mg eines hellgelben Feststoffes. Die Ausbeute beträgt 46%.

5-{4-{l-[2-(Dimethylamino)ethyl]}piperazincarbonyl}-2-thi oxo-[l,3]dit hiol-4-carbonsäure-Trifluoracetat (Aminopiperazinamid)

[0133]

[0134] 263,5 mg (1,26 mmol) Anhydrid werden in 3 ml wasserfreiem Dichlormethan unter Argon gelöst. Das 1-Methylpiperazinbistrifluoracetat (200,7 mg; 1,26 mmol) werden mit 175 μl (1,26 mmol) TEA versetzt und anschließend in 3 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird innerhalb von 5 min zum Anhydrid zu- getropftDas Gemisch färbt sich rotbraun. Nach Rühren über Nacht fällt ein gelbbrauner Feststoff aus. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgetrennt. Der Feststoff wird mit Dichlormethan gewaschen, anschließend abfiltriert und getrocknet. Man erhält 205,6 mg eines hellbraunen Feststoffes. Die Ausbeute beträgt 46 %. 5-{4-{l-[2-(Dimethylamino)ethyl]}piperazincarbonyl}-2-thioxo -[l,3]dit hioM-carbonsäurechlorid-Trifluoracetat

[0135]

[0136] 150 mg (32 mmol) Aminopiperazinamid werden mit einem 60-fachem Überschuß an Thionylchlorid versetzt. Bei Zugabe des Thionylchlorides entsteht eine gelbe Lösung mit schwarzen Partikeln. Die Suspension wird 18 h bei 3O ⁰ C gerührt. Dabei bildet sich eine viskose braune Suspension. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgetrennt. Der so entstandene Feststoff wird im Vakuum vollständig getrocknet. Man erhält 146,4 mg eines braunen Festostoffes. DieAusbeute beträgt 94%. Aufgrund der hohen Reaktivität konnte der Stoff nicht weiter charakterisiert werden. tert-butyl

Bis[3-(5-{4-[2-(dimethylamino)ethyl]piperazin-l-carbonyl} -2-thioxo-[l,3]-dithi ol-4-carbonsäureamid)propyl]carbamat(verbrücktes Aminopiperazin)

[0137]

[0138] 146,4 mg (0,30 mmol) Säurechlorid werden in 4 ml wasserfreiem Dichlormethan unter Argon gelöst. 34,78 mg (0,15 mmol) Triaminbrücke werden mit einem 10-fachem Überschuss TEA versetzt und anschließend in 4 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst. Unter Eisbadkühlung wird die Triaminbrückenlösung innerhalb von 5 min zum Säurechlorid zugetropft. Man erhält eine braune Suspension. Der Ansatz wird bei Raumtemperatur 2 Tage gerührt. Aus der Lösung fällt eine gelbbrauner Feststoff aus. [0139]

Beispielhafte Kitzusammensetzung für die radiopharmazeutische Markierung mit ¹⁸⁸ Re [0140] 0,1 mg Tetrathiol-Ligand 1,0 mg Zinn(II)chlorid 5 mg Oxalsäure, 5 mg gamma-Cyclodextrin, 15 mg Ascorbinsäure

Beispielhafte Kitzusammensetzung für die radiopharmazeutische Markierung mit ^99m Tc [0141] 0, 1 mg Tetrathiol-Ligand, 1,0 mg Zinn(II)chlorid 5 mg Natriumtatrat 5 mg Mannitol [0142]