DESCRIPCIÓN La presente invención se refiere a una composición inhibidora de la ureasa y al uso de la misma para la fertilización de suelos o para reducir la emisión de amoniaco en granjas de ganado intensivo.

Más concretamente, en un primer aspecto, la invención proporciona una composición inhibidora de la ureasa que contiene al menos uno de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III) o una combinación de todos ellos:

En un segundo aspecto, la invención se refiere al uso de la composición inhibidora de la ureasa que contiene al menos uno de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III) o una combinación de todos ellos para inhibir la acción de la ureasa en suelos, en purines de granjas de ganado intensivo, reduciendo en este caso la emisión de amoniaco, o en la aplicación de fertilizantes nitrogenados ureicos, reduciendo la volatilización de amoniaco.

El nitrógeno es un nutriente imprescindible para los cultivos. El nitrógeno, una vez aplicado en el suelo, sufre una serie de transformaciones, produciéndose la absorción por los cultivos o la pérdida del nutriente por diferentes causas, tales como pérdida por emisiones a la atmósfera de óxidos de nitrógeno y amoniaco, pérdida por procesos de lixiviación o pérdida debida a la erosión de los terrenos.

Por ello se han llevado a cabo investigaciones orientadas al desarrollo de fertilizantes más eficientes, como podrían ser los desarrollados en las patentes ES 2 204 307 A1 ; ES 2 264 386 B1 ; WO 2001072665 A1 ; WO 2007/132032; WO 2006 125836 A1.

La urea constituye uno de los fertilizantes nitrogenados más utilizados del mundo debido principalmente a su elevado contenido en nitrógeno (46%), su bajo coste, su solubilidad en agua y su fácil manejo. Sin embargo, presenta un bajo rendimiento y una pérdida de eficacia del fertilizante debida a la lixiviación del nitrógeno en forma nítrica y a las pérdidas por volatilización del nitrógeno amoniacal debido a la rápida hidrólisis que sufre la urea al ser aplicada en los suelos:

(NH ₂ ) ₂ CO + H ₂ O CO ₂ + 2NH ₃

Reacción de hidrólisis de la urea

El amoniaco resultante de esta reacción de hidrólisis entra en equilibrio con la humedad del suelo originado iones amonio:

NH ₃ + H ₂ O NH ₄ ⁺ + OH'

Esta hidrólisis es catalizada por la enzima ureasa, una metaloenzima cuyo sitio activo está compuesto por un dímero de Ni(ll).

La acción de este enzima es muy rápida y provoca una alta generación de amoniaco en sitios muy reducidos del suelo. Debido a la reacción de este NH3 con el suelo se produce un fuerte incremento del pH en el sitio concreto donde se está produciendo la reacción de hidrólisis. Por este motivo, la reacción de generación de NH ₄ ⁺ en el suelo se ralentiza, acumulándose cantidades relevantes de amoniaco (NH3).

El amoniaco liberado puede llegar a alcanzar una concentración demasiado elevada en las proximidades de las raíces de las plantas jóvenes, produciendo su intoxicación, además de su fácil liberación al medioambiente por volatilización, con los problemas que esto puede acarrear.

En este contexto, toda investigación orientada al desarrollo de fertilizantes más eficaces y con menos riesgos de contaminación medioambiental es de gran interés.

En relación con los inhibidores de la hidrólisis de la urea, se han desarrollado gran cantidad de moléculas tanto de origen natural (véase, por ejemplo, Baughman y Wozniak, US5549728; Seiyaku, JP8019595) como sintético (véase, por ejemplo, Cheng y col., US5770771 ; Peacock y col., US5352265; Radel, US4932992).

En la búsqueda de inhibidores de la ureasa, la selección de estos principios activos se debe a que algunas investigaciones apuntaban a que la enzima ureasa podía ser inhibida por moléculas derivadas de ácidos hidroxámicos (Luzia V. Modolo, Aline X. de Souza, Lívia P. Horta, Dóbora P. Araujo, Angelo de Fátima, An overview on the potential of natural products as ureases inhibitors: A review, Journal of Advanced Research (2015) 6, 35-44); Z. Amtul, Atta-ur-Rahman, R.A. Siddiqui y M.l: Choudhary, Chemistry and Mechanism of Urease Inhibition, Current Medicinal Chemistry, 2002, 9, 1323-1348).

Aun así, existe bibliografía que pone de manifiesto la existencia de moléculas que pertenecen al grupo de los ácidos hidroxámicos con capacidad para inhibir la enzima ureasa in vitro, pero son poco eficientes en el suelo y no son capaces de reducir la perdida de nitrógeno amoniacal procedente de la hidrólisis de la urea.

Por ello, sería deseable disponer de inhibidores de la ureasa que fueran eficientes cuando se aplican a los suelos.

De acuerdo con el primer aspecto de la invención, ésta proporciona una composición inhibidora de la ureasa que contiene al menos uno de los compuestos de fórmulas (I),

(II) y (III) o una combinación de todos ellos: en disolución acuosa a una concentración final de 1.000 mg de la composición por litro de agua.

En una forma de realización, los compuestos de las fórmulas (I), (II) y (III) antes descritos están presentes en la composición inhibidora de la ureasa de la invención en una concentración igual o superior a 1 mg/l y hasta 50 mg/l. Preferentemente, la concentración de los compuestos de las fórmulas (I), (II) y (III) antes descritos presentes en la composición inhibidora de la ureasa de la invención es igual o superior a 5 mg/l. De acuerdo con el segundo aspecto, la invención se refiere al uso de la composición inhibidora de la ureasa que contiene al menos uno de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III) o una combinación de todos ellos para inhibir la acción de la ureasa en suelos o en purines de granjas de ganado intensivo, reduciendo en este caso la emisión de amoniaco, o junto con fertilizantes nitrogenados ureicos, reduciendo aquí la volatilización de amoniaco.

En una forma de realización relativa a este segundo aspecto, en particular cuando a la composición inhibidora de la ureasa se utiliza para inhibir la ureasa en suelos, la composición se aplica a una concentración de entre 5 y 100 mg por kilogramo de suelo. Cuando a la composición inhibidora de la ureasa se utiliza para inhibir la ureasa en purines de granjas de ganado intensivo, la composición se aplica a una concentración de entre 1 y 100 mg por litro de purín. En el caso de la aplicación de la composición inhibidora de la invención junto con fertilizantes nitrogenados ureicos, preferentemente la composición inhibidora incorporada en el fertilizante representa entre 0,2 y 4 g por kg de nitrógeno ureico.

A continuación se describe la invención en base a ejemplos de realización de la misma y en referencia a las figuras adjuntas, en las cuales:

Figura 1 : ensayo in vitro de inhibición de la enzima ureasa comercial “Jack Bean” (de Canavalia ensiformis, CAS 9002-13-5, polvo) por diferentes cantidades de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III);

Figura 2: ensayo in vitro de inhibición de la enzima ureasa comercial “Jack Bean” (de Canavalia ensiformis, CAS 9002-13-5, polvo) por diferentes cantidades de composiciones de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III);

Figura 3: ensayo de inhibición de la ureasa en muestras de suelo por diferentes cantidades de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III);

Figura 4: ensayo de inhibición de la ureasa en muestras de suelo por diferentes cantidades de por diferentes cantidades de composiciones de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III); Figura 5: ensayo de inhibición de la ureasa en muestras de purín de cerdo por diferentes cantidades de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III);

Figura 6: ensayo de inhibición de la ureasa en muestras de purín de cerdo por diferentes cantidades de composiciones de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III);

Figura 7: ensayo de pérdida de nitrógeno por volatilización de amoniaco procedente de la hidrólisis de la urea en muestras de un fertilizante de nitrógeno ureico (Urea Prill) por diferentes cantidades de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III); y

Figura 8: ensayo de pérdida de nitrógeno por volatilización de amoniaco procedente de la hidrólisis de la urea en muestras de un fertilizante de nitrógeno ureico (Urea Prill) por diferentes cantidades de composiciones de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III).

Ejemplos

Ejemplo 1 : ensayo in vitro de inhibición de la enzima ureasa comercial “Jack Bean” (de Canavalia ensiformis, CAS 9002-13-5, polvo) por diferentes cantidades de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III).

El objetivo de este ensayo es comprobar la capacidad que tienen diferentes cantidades de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III) individualmente para inhibir la acción de la enzima ureasa comercial “Jack Bean” (SIGMA Tipo III).

Material necesario:

• Urea 750 mM en agua Milli-Q

• Solución de ureasa “Jack Bean” a 0,1 mg/ml en tampón fosfato (1M), pH 7.

Se preparan tres soluciones de los compuestos de fórmulas compuestos de fórmulas (I), (II) y (III) en agua a una concentración de 1.000 mg/l cada una de ellas.

Los ensayos in vitro se llevan a cabo en tubos de vidrio, realizando tres réplicas por muestra. A cada tubo se añaden 100 pl de tampón fosfato, 100 pl de urea, 20 pl de la solución de ureasa y diferentes dosis de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III) para una concentración final en la reacción de 1 mg/l; 5 mg/l; 20 mg/l y 50 mg/l.

Se completan todos los tubos hasta 1 mi de volumen final con agua Milli-Q. Los tubos se tapan, se disponen en ambiente controlado de temperatura (25 °C) y oscuridad y se incuban durante 45 minutos. Tras la incubación, se toman 0,1 mi de cada tubo y se añaden sobre 0,4 ml de KCI 2M, previamente añadidos en tubos nuevos, para detener la reacción enzimática. Posteriormente se procede a la determinación del ion amonio mediante el método de Berthelot.

Los resultados de este ensayo se muestran en la figura 1.

Como se deriva de la figura 1 , los tres compuestos son capaces de inhibir la enzima ureasa comercial. Esta inhibición es superior al 85% cuando la concentración de cada compuesto es superior a 5 mg/l.

Ejemplo 2: ensayo in vitro de inhibición de la enzima ureasa comercial “Jack Bean” (de Canavalia ensiformis, CAS 9002-13-5, polvo) por diferentes cantidades de composiciones de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III)

Con el objetivo de valorar la capacidad de inhibición de mezclas de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III), se preparan las siguientes mezclas:

Mezcla 1 : 70% compuesto fórmula (I) + 30% compuesto fórmula (II)

Mezcla 2: 50% compuesto fórmula (I) + 50% compuesto fórmula (II)

Mezcla 3: 30% compuesto fórmula (II) + 70% compuesto fórmula (III)

Mezcla 4: 40% compuesto fórmula (I) + 20% compuesto fórmula (II) + 40% compuesto fórmula (III).

Siguiendo el protocolo del ejemplo 1 , se preparan disoluciones de estas mezclas a una concentración final de 1.000 mg de mezcla/l y se lleva a cabo el mismo protocolo que en el Ejemplo 1 para valorar la capacidad de inhibición de la enzima ureasa comercial Jack Bean.

Los resultados se muestran en la figura 2. Como se observa en la figura 2, las cuatro combinaciones son capaces de inhibir la actividad ureasa in vitro. Esta inhibición es superior al 70% cuando la concentración de las combinaciones es igual o superior a 1 mg de mezcla por litro.

Ejemplo 3: ensayo de inhibición de la ureasa en muestras de suelo por diferentes cantidades de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III)

Con el objetivo de evaluar la capacidad de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III) para inhibir la enzima ureasa en muestras de suelo, se preparan disoluciones de dichos compuestos en agua a una concentración de 1.000 mg/l.

Los ensayos de inhibición en suelos se llevan a cabo en muestras de suelo básico de textura franco-arenosa tamizados a 4 mm. Para cada condición, se toma 1 g de muestra de suelo y se agregan 400 pl de agua para la muestra control (NO inhibidor) y en la reacción de inhibición se agregan diferentes cantidades de solución inhibidora para conseguir concentraciones finales de 1 , 5, 25, 100 mg de compuesto inhibidor por Kg de tierra, completándose el volumen restante hasta 400 pl con agua. Las muestras se incuban a 25 °C durante 2 horas. Pasado este tiempo, se agregan 2,5 ml de tampón borato 75 mM a pH 10 y se incuba bajo agitación a temperatura ambiente hasta que la muestra sea lo más homogénea posible, unos 15 minutos aproximadamente. Se toman 250 pl de la suspensión preparada para cada uno de los triplicados técnicos y se agregan 100 pl de sustrato y 100 pl de tampón para las muestras blanco (por duplicado). Además, se realiza un control de sustrato (por duplicado también) donde se disponen 250 pl de tampón borato y 100 pl del sustrato (urea).

Todas las muestras se incuban a 32 °C durante 2 horas en agitación a 120 rpm. Finalizado el tiempo de reacción, se agrega 1 ml de KCI-HCI con el fin de detener la reacción, se incuba bajo agitación durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los tubos se centrifugan 1 minuto a máxima velocidad y se procede a la cuantificación de amonio mediante el método de Berthelot.

Los resultados se muestran en la figura 3.

Como se observa en la figura 3, los tres compuestos son capaces de inhibir la actividad ureasa en suelos. Esta inhibición es cercana al 60% cuando la concentración de los compuestos es igual a 25 mg/Kg suelo.

Ejemplo 4: ensayo de inhibición de la ureasa en muestras de suelo por diferentes cantidades de composiciones de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III)

Con el objetivo de valorar la capacidad de inhibición de la ureasa en suelos de composiciones de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III), se preparan las siguientes mezclas:

Mezcla 1 : 70% compuesto de fórmula (I) + 30% compuesto de fórmula (II) Mezcla 2: 50% compuesto de fórmula (I) + 50% compuesto de fórmula (II) Mezcla 3: 30% compuesto de fórmula (II) + 70% compuesto de fórmula (III) Mezcla 4: 40% compuesto de fórmula (I) + 20% compuesto de fórmula (II) + 40% compuesto de fórmula (III).

Siguiendo el protocolo del ejemplo 3, se preparan disoluciones de estas mezclas a una concentración final de 1.000 mg de mezcla/l.

Se lleva a cabo el mismo protocolo que en el Ejemplo 3 para valorar la capacidad de inhibición de las enzimas ureasa del suelo.

Los resultados se muestran en la figura 4.

Como se observa en la figura 4, las combinaciones de los diferentes compuestos tienen capacidad para inhibir la actividad de la ureasa del suelo. Además, las combinaciones 3 y 4 parecen tener un efecto acumulativo, siendo más eficientes que las otras dos mezclas o que los diferentes componentes por separado. En estas dos combinaciones podemos ver inhibiciones del 75% o superiores a concentraciones de 5 mg de mezcla/Kg suelo.

Ejemplo 5: ensayo de inhibición de la ureasa en muestras de purín de cerdo por diferentes cantidades de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III)

Con el objetivo de evaluar la capacidad de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III) para inhibir la enzima ureasa en muestras de purín de cerdo, se preparan disoluciones de dichos compuestos por separado en agua a una concentración de 1.000 mg/l. Se aplican diferentes cantidades de las disoluciones al purín para conseguir una concentración final de cada uno de los compuestos de 1, 5, 25 y 100 mg de compuesto por litro de purín.

La cantidad basal de amonio en el purín es alta y, por este motivo, para valorar la actividad ureasa se deberá diluir el purín con o sin los compuestos incorporados 50 veces. Para ello se sigue el siguiente protocolo con los diferentes purines a los que se le ha añadido las diferentes cantidades de compuestos de fórmulas (I), (II) y (III):

Una vez preparadas las muestras, se incuban los diferentes tubos 16 horas a 25 °C. Después de la incubación se siguen los siguientes pasos: tomar 200 pl y añadir 800 pl de KCI, incubar durante 15 minutos, centrifugar a máxima velocidad, tomar 100 pl y colocar en un eppendorf de 2 mi, añadir 900 pl de agua y continuar con el protocolo de cuantificación de amonio según el método de Berthelot.

Los resultados se muestran en la figura 5.

Como se observa en la figura 5, la incorporación en un purín de cerdo de una cantidad de 5 mg/l de cualquiera de las tres sustancias comporta una reducción de más del 70% de la actividad ureasa.

Ejemplo 6: ensayo de inhibición de la ureasa en muestras de purín de cerdo por diferentes cantidades de composiciones de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III)

Con el objetivo de valorar la capacidad de inhibición de la ureasa en muestras de purín de composiciones de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III), se preparan las siguientes mezclas:

Mezcla 1 : 70% compuesto de fórmula (I) + 30% compuesto de fórmula (II) Mezcla 2: 50% compuesto de fórmula (I) + 50% compuesto de fórmula (II)

Mezcla 3: 30% compuesto de fórmula (II) + 70% compuesto de fórmula (III)

Mezcla 4: 40% compuesto de fórmula (I) + 20% compuesto de fórmula (II) + 40% compuesto de fórmula (III).

Sed aplican diferentes cantidades de las mezclas al purín para conseguir una concentración final de cada una de 1 , 5, 25 y 100 mg de mezcla por litro de purín.

Posteriormente se sigue el mismo protocolo que en el ejemplo 5 para valorar la actividad ureasa del purín, así como la capacidad de inhibición de las diferentes mezclas.

Los resultados se muestran en la figura 6.

Como se observa en la figura 6, las mezclas son más eficaces que la utilización de las sustancias de forma individual, especialmente la mezcla 4, que es capaz de reducir la actividad ureasa de un purín en un 85% tan solo con la aplicación de 1 mg de mezcla por litro de purín.

Ejemplo 7: ensayo de pérdida de nitrógeno por volatilización de amoniaco procedente de la hidrólisis de la urea en muestras de un fertilizante de nitrógeno ureico (Urea Prill) por diferentes cantidades de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III).

Con el objetivo de valorar el impacto sobre la perdida de nitrógeno por volatilización de amoniaco procedente de la hidrólisis de la urea se realiza la siguiente prueba.

Se prepara una solución de sulfóxido de dimetilo y monopropilenglicol en una proporción 30/70. Utilizando esta solución se incorporan los diferentes compuestos de fórmulas (I), (II) o (III) a razón de 100 g/l.

Las soluciones se aplican sobre Urea prill de tal forma que el principio activo quede a una concentración de 0,2, 0,5, 1 ,02,0 y 4,0 g de compuesto de fórmula (I), (II) o (III) por Kg de nitrógeno ureico.

Los ensayos de volatilización en suelos se llevan a cabo en muestras de suelo básico de textura franco-arenosa tamizados a 4 mm. Para cada condición, se toman 50 gramos de muestra de suelo y se dispone en un recipiente cerrado herméticamente. En la tapa del recipiente se coloca una almohadilla con 2 mi de una mezcla de ácido fosfórico y glicerina (20/80). En cada recipiente se aplica una cantidad equivalente a la aplicación de 150 unidades de nitrógeno por hectárea y se cierra.

Después de 7 días, se retira la tapa y se recupera la almohadilla diluyéndola en 20 mi de agua y se valora la cantidad de amoniaco recogida en la trampa ácida (almohadilla con la mezcla de fosfórico y glicerina).

Teniendo en cuenta las emisiones máximas que se dan en la aplicación de urea sin ningún tratamiento, en la figura 7 se muestran los valores de las emisiones totales de amonio a los 7 días de la aplicación de la urea tratada en el suelo respecto a las emisiones de la urea no tratada.

Como se observa en la figura 7, la utilización de una cantidad superior a 1 gramos de cualquiera de las 3 sustancias por Kg de nitrógeno ureico produce una reducción de la volatilización de amoniaco superior a un 20%.

Ejemplo 8: ensayo de pérdida de nitrógeno por volatilización de amoniaco procedente de la hidrólisis de la urea en muestras de un fertilizante de nitrógeno ureico (Urea Prill) por diferentes cantidades de composiciones de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III).

Con el objetivo de valorar la eficacia de diferentes composiciones de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III) sobre la volatilización de amoniaco procedente de la hidrólisis de urea, se preparan las siguientes mezclas:

Mezcla 1 : 70% compuesto de fórmula (I) + 30% compuesto de fórmula (II)

Mezcla 2: 50% compuesto de fórmula (I) + 50% compuesto de fórmula (II)

Mezcla 3: 30% compuesto de fórmula (II) + 70% compuesto de fórmula (III)

Mezcla 4: 40% compuesto de fórmula (I) + 20% compuesto de fórmula (II) + 40% compuesto de fórmula (III).

Se prepara una solución de sulfoxido de dimetilo y monopropilenglicol en una proporción 30/70. A la solución anterior se incorporan las diferentes mezclas 1 , 2, 3 y 4 a razón de 100 g/l.

Las soluciones se aplican sobre Urea prill de tal forma que la suma de los compuestos de fórmulas (I), (II) y (III) quede a una concentración de 0,2, 0,5, 1 ,0, 2,0 y 4,0 g de cada compuesto por Kg de nitrógeno ureico.

Los resultados se muestran en la figura 8.

Como se observa en la figura 8, la utilización de una cantidad superior a 1 gramo de cualquiera de las 4 mezclas por Kg de nitrógeno ureico da como resultado una reducción de la volatilización de amoniaco del 40%, este valor llega al 70% en el caso de las mezclas 3 y 4.