La presente invención se refiere al uso del compuesto CR-6 (3, 4-dihidro-6- hidroxi-7-metoxi-2, 2-dimetil-1(2H)-benzopirano) o de un compuesto derivado, para el tratamiento de una lesión producida en determinados individuos como consecuencia de Ia reperfusión tras un episodio de isquemia cerebral. Esta lesión se denomina lesión por reperfusión y se asocia a determinados signos precoces como es Ia hiperemia reactiva cuando ocurre Ia reperfusión post- isquémica. En Ia presente invención se demuestra que no todos los individuos que han sufrido isquemia van a responder favorablemente al tratamiento con este compuesto, sino solamente aquellos que presenten signos de lesión por reperfusión, donde dicho signo es hiperperfusión o hiperemia reactiva. La hiperperfusión se considera que tiene lugar cuando el flujo sanguíneo cerebral aumenta por encima de un 20% del valor basal, condición que no se da en todos los sujetos que han sufrido isquemia/reperfusión cerebral.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La reperfusión es actualmente Ia mejor estrategia para proteger el cerebro contra el daño isquémico, y Ia trombolisis con rtPA es el único tratamiento aprobado para el ictus isquémico (isquemia) en Europa y Norte América. Estudios preclínicos han demostrado que una oclusión de Ia arteria cerebral media (ACM) seguida de una reperfusión causa menos daño que una oclusión permanente de Ia ACM en ratas (Menezawa et al., 1992. Stroke, 23: 552-559; Rogers et al., 1997. Stroke: 28: 2060-2065). No obstante, Ia reperfusión conlleva algunos riesgos, como una transformación hemorrágica o edema, los cuales podrían ser atribuidos, al menos en parte, al daño o herida por reperfusión (Pan et al., 2007. Neuroradioloqy, 49: 93-102). El daño postisquémico asociado a Ia reperfusión está bien documentado en el corazón (Kutala et al., 2007. Antioxid. Redox Signal, 9: 1193-1206) y en los órganos trasplantados (Jamieson y Friend, 2008. Front. Biosci., 13: 221-235), pero Ia evidencia de que ocurre lesión por reperfusión en el cerebro humano ha resultado más difícil de encontrar. Datos experimentales obtenidos en ciertos modelos de ratas sometidas a Ia oclusión intraluminal de Ia ACM (Aronowski et al., 1997. J. Cereb. Blood Flow Metab.. 17: 1048-1056) evidencian el daño de Ia reperfusión en el contexto preclínico. Estos estudios evidencian que las manifestaciones del daño por reperfusión pueden depender de varios factores como Ia duración de Ia oclusión de Ia ACM o factores genéticos. Esto sugiere que Ia lesión por reperfusión podría ser una variable en el ictus humano (isquémico o hemorrágico), así como factores genéticos también podrían estar involucrados, al igual que Ia duración y el grado de reducción del flujo pueden diferir en cada paciente. El daño por reperfusión se atribuye a varios efectos de ésta, como el estrés oxidativo (Chan, 1996. Stroke, 27: 1124-1129), el daño de Ia barrera hematoencefálica (BBB) (del Zoppo y Mabuchi, 2003. J. Cereb. Blood Flor. Metab., 23: 879-894), y de Ia acumulación de leucocitos en los vasos sanguíneos (del Zoppo et al., 1991. Stroke, 22: 1276-1283), Ia infiltración al parénquima cerebral (Zhang et al., 1994. J. Neurol. ScL 125: 3-10) de plaquetas (Chong et al., 2001. Acta Pharmacol. Sin.. 22: 679-684), Ia activación del complemento (D' Ambrosio et al., 2001. Mol. Med.. 7: 367-382) y Ia transformación hemorrágica (Pan et al., 2007. Neuroradioloqy, 49: 93-102). La reperfusión puede inducir un incremento en el flujo sanguíneo por encima de niveles básales, como se ha visto en animales (Tasdemiroglu et al., 1992. Am. J. PhvsioL 263:H533-6; Tsuchidate et al., 1997. J. Cereb. Blood Flow. Metab., 17: 1066-1073). En humanos, Ia hiperperfusión después de una trombolisis se encontró en el 40% de los pacientes (Kidwell et al., 2001. Neurology, 57: 2015- 2021 ).

El CR-6 es un derivado sintético de Ia vitamina E con capacidad de secuestrar especies reactivas de nitrógeno. Se ha demostrado previamente que CR-6 tiene efectos beneficiosos contra el daño causado por el estrés oxidativo in vitro (Montoliu et al., 1999. Biochem. Pharmacol.. 58: 255-61 ; Sanvicens et al., 2006. J. Neurochem., 98: 735-747) e in vivo (Miranda et al., 2007. Free Radie. Biol. Med., 43: 1494-1498). Los ensayos clínicos con otros compuestos antioxidantes para el tratamiento de Ia isquemia/reperfusión han fracasado, pese a las evidencias preclínicas de sus beneficios. Por tanto, sería necesario aumentar el número de recuperaciones de pacientes que sufran lesiones como consecuencia de haber padecido una isquemia.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al uso del compuesto CR-6 (3, 4-dihidro-6- hidroxi-7-metoxi-2, 2-dimetil-1(2H)-benzopirano) o de un compuesto derivado, para el tratamiento de una lesión producida como consecuencia de una hiperperfusión ocurrida después de una isquemia. En Ia presente invención se demuestra que no todos los individuos que han sufrido isquemia van a responder favorablemente al tratamiento con CR-6 o de un compuesto derivado, sino solamente aquellos que presenten signos de lesión por reperfusión, donde Ia reperfusión es hiperperfusión o hiperemia reactiva. La hiperperfusión se considera que tiene lugar cuando el flujo sanguíneo cerebral aumenta por encima de un 20% de los valores básales, condición que no se da en todos los sujetos que han sufrido isquemia/reperfusión cerebral.

CR-6 o compuestos derivados mejoran Ia eficacia del tratamiento de daños por isquemia con reperfusión consiguiendo un efecto sorprendente en el tratamiento de las lesiones. El significado del término eficacia que se emplea en Ia presente invención se refiere al mayor número de recuperaciones de individuos, tratados con CR-6 o derivados, que sufren lesiones asociadas a hiperemia post-isquémica, respecto del colectivo de pacientes con isquemia con reperfusión que no muestran signos que anticipan que se va a producir lesión por reperfusión. Gracias a este aumento de Ia eficacia se pueden seleccionar antioxidantes derivados de CR-6, no contemplados en el estado de Ia técnica para este uso, para poder curar las lesiones citadas y asimismo, esta selección evitaría el posible abandono del tratamiento de Ia isquemia con reperfusión con estos compuestos por falta de eficacia en el colectivo de pacientes que padezcan isquemia con reperfusiones de cualquier tipo, con hiperemia o sin ella.

Es decir, Ia selección de pacientes con las características citadas, es un aspecto determinante en el tratamiento de Ia isquemia con reperfusión mediante CR-6 o sus derivados cuando aparecen signos precoces que anticipan que se va a producir lesión por reperfusión. Un signo precoz es Ia hiperperfusión o hiperemia reactiva cuando ocurre Ia reperfusión post- isquémica. La hiperperfusión se considera que tiene lugar cuando el flujo sanguíneo cerebral aumenta por encima de un 20% del valor basal.

Como se muestra en los ejemplos, se ha ensayado el compuesto CR-6 en ratas sometidas a un episodio de isquemia cerebral por oclusión de Ia arteria cerebral media de 90 minutos de duración, seguido de reperfusión. CR-6 se ha administrado de forma oral dos horas después del comienzo de Ia isquemia. De estos resultados se deriva que es factible trasladar este tratamiento a Ia práctica clínica. Además, se ha valorado el déficit neurológico de los animales, se ha cuantificado el volumen de infarto cerebral, el flujo sanguíneo durante Ia isquemia y en Ia reperfusión, y se ha correlacionado Ia hiperperfusión con un mayor daño cerebral. También se ha determinado el contenido tisular de glutatión, y se ha determinado Ia expresión en el cerebro de proteínas pro- inflamatorias como Ia isoforma inducible de Ia ciclooxigenasa (Cox-2), que se ha localizado primordialmente en neuronas de Ia zona afectada por Ia isquemia.

Los resultados muestran que CR-6 atenúa el déficit neurológico, reduce el volumen de infarto cerebral, reduce el consumo de glutatión, así como ciertos procesos inflamatorios, y previene Ia rotura de Ia barrera hematoencefálica, particularmente en los sujetos que desarrollan hiperemia reactiva. En determinados sujetos, Ia reperfusión puede inducir un daño adicional denominado 'lesión por reperfusión' caracterizada por mayor estrés oxidativo, mayor consumo de antioxidantes endógenos (glutatión), mayor rotura de barrera hematoencefálica, mayor activación de ciertas vías de señalización relacionadas con estrés oxidativo y con inflamación, y como consecuencia de todo ello se produce mayor daño cerebral y mayor déficit neurológico. Uno de los marcadores de este tipo de lesión es Ia hiperemia reactiva que se asocia a esta lesión por reperfusión. Por tanto, el tratamiento con CR-6 en Ia isquemia/reperfusión sería adecuado si se detecta hiperemia reactiva u otro signo precoz de lesión por reperfusión. La hiperemia reactiva se detecta con técnicas que permiten valorar Ia perfusión cerebral, por ejemplo, pero sin limitarse, con láser Doppler o técnicas no invasivas de neuroimagen como por ejemplo pero sin limitarse, Ia tomografía computerizada o resonancia magnética. Estas técnicas se aplican de manera rutinaria en Ia práctica clínica.

En este sentido, un aspecto de Ia presente invención es el uso de un compuesto de fórmula general (I), para Ia elaboración de un medicamento destinado al tratamiento de una lesión producida por una reperfusión post- isquémica, donde el flujo sanguíneo de Ia reperfusión es igual o mayor de un 20 % del valor basal,

El compuesto tiene Ia fórmula general (I), donde Ri y R ₄ son iguales o diferentes y se seleccionan de entre H ó un alquilo que tiene de entre 1 y 4 átomos de carbono (Ci-C ₄ );

R2 y R3 son iguales o diferentes y se seleccionan de entre H, OH, un alquilo que tiene de entre 1 y 4 átomos de carbono (CrC ₄ ) o un alcoxilo (OR ₃ ); Rs se selecciona de entre H ó un grupo alquilo que tiene de entre 1 y 4 átomos de carbono (CrC ₄ ) y

Re es un grupo alquilo lineal o ramificado que tiene de entre 1 y 10 átomos de carbono (C1-C10).

El término "alquilo" se refiere, en Ia presente invención, a cadenas alifáticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, tere-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n- hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 4 átomos de carbono.

El término "alcoxilo" se refiere en Ia presente invención a un grupo de fórmula -OR _a en Ia que R _a es un alquilo (CrC ₄ ), por ejemplo, pero sin limitarse a metoxilo, etoxilo ó propoxilo.

Una realización preferida de Ia presente invención es el uso del compuesto de fórmula general (I), o de cualquiera de sus sales, donde Ri es H, R2 es un alcoxilo (0-(Ci)), R3 es un hidroxilo, R ₄ es H, R ₅ es un grupo alquilo (CrC ₄ ) y Re es un grupo alquilo (CrC ₄ ). Una realización aún más preferida es el uso del compuesto de fórmula general (I), donde R5 es un grupo metilo y Re es también un grupo metilo.

En adelante, se hará referencia a cualquiera de los compuestos anteriores como "compuestos de Ia invención" o "compuestos de Ia presente invención".

El medicamento comprende, al menos, cualquiera de los compuestos de Ia invención. Cualquiera de los compuestos de Ia presente invención, derivados farmacéuticamente aceptables o sus profármacos, se formulan en una composición farmacéutica apropiada, en Ia cantidad terapéuticamente efectiva, junto con uno o más vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables. El medicamento se emplea para el tratamiento de una lesión por reperfusión (post-isquémica) que se manifiesta con signos como Ia hiperemia reactiva (hiperperfusión post-isquémica), donde el flujo sanguíneo de Ia reperfusión es igual o mayor de un 20 % del valor basal.

Por un "derivado farmacéuticamente aceptable" se entiende cualquier sal, farmacéuticamente aceptable o cualquier otro compuesto que después de su administración, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) cualquiera de los compuestos de Ia invención.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en Ia elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos.

El término "tratamiento" tal como se entiende en Ia presente invención supone combatir los efectos causados como consecuencia de una reperfusión post- isquémica para estabilizar el estado de los individuos o prevenir daños posteriores. El término "prevención" tal como se entiende en Ia presente invención consiste en evitar Ia aparición de daños cuya causa sea Ia reperfusión post-isquémica.

La perfusión es Ia acción de introducir lenta y continuamente un líquido, como Ia sangre o una sustancia medicamentosa, por vía intravenosa o en el interior de órganos, cavidades o conductos. El término "reperfusión" hace referencia a Ia restauración del flujo sanguíneo después de Ia ocurrencia de una isquemia. La restauración del flujo sanguíneo se produce de forma espontánea, aunque en este caso Ia restauración es muy lenta, o se produce de forma inducida por medio de Ia administración de compuestos que se encargan de deshacer el trombo cuando ésta es Ia causa de Ia isquemia. En este último caso, se suele administrar un tratamiento trombolítico con activador de plasminógeno tisular recombinante rt- PA y a partir del momento en el que se administra el compuesto trombolítico se comienza Ia restauración del flujo sanguíneo a Ia zona afectada. En Ia presente invención, Ia reperfusión post-isquémica donde el flujo sanguíneo de Ia reperfusión es igual o mayor de un 20 % del valor basal se denomina hiperperfusión. El término "hiperperfusión" tal como se entiende en Ia presente invención es el fluir de Ia sangre por el interior de órganos, cavidades o conductos con un flujo sanguíneo superior al flujo que se da en un individuo en condiciones normales (valores básales). En Ia presente invención, el término hiperemia puede emplearse como un sinónimo de hiperperfusión.

El término "post-isquémica" indica que Ia hiperperfusión se da después de una isquemia. La isquemia es una reducción del flujo sanguíneo hasta niveles que son insuficientes para mantener el metabolismo necesario para Ia función y estructura normales de un tejido o de un órgano. La reducción del flujo sanguíneo causa Ia disminución del aporte de oxígeno a las células de un tejido biológico y como consecuencia se puede llegar a Ia muerte celular. La causa de una isquemia puede ser, pero sin limitarse, una embolia causada por un émbolo que provoca Ia oclusión o bloqueo de un vaso sanguíneo de menor diámetro al del émbolo.

El término "hiperperfusión post-isquémica" se utiliza como sinónimo de "hiperemia reactiva". A Io largo de Ia memoria, estos dos términos se pueden utilizar indistintamente.

En Ia presente invención, el medicamento se destina al tratamiento de una lesión producida por una reperfusión post-isquémica, donde dicha reperfusión presenta un flujo sanguíneo igual o mayor de un 20 % del valor basal. El término "valor basal" tal como se entiende en Ia presente invención se refiere al valor del flujo sanguíneo de un individuo antes de que se produzca Ia isquemia o bien al valor del flujo sanguíneo de Ia región homologa del hemisferio cerebral contralateral. El valor del flujo sanguíneo de Ia vasculatura del hemisferio en el que no se produce Ia isquemia puede servir para establecer el valor basal con el que comparar el valor del flujo sanguíneo cuando se produce Ia reperfusión. Tal como se ha comentado anteriormente, en los casos en que Ia causa de Ia isquemia es un trombo se suele administrar un tratamiento trombolítico con activador de plasminógeno tisular recombinante rt-PA y a partir del momento en el que se administra el compuesto trombolítico se comienza Ia restauración del flujo sanguíneo a Ia zona afectada. En ese momento se puede llevar a cabo Ia medida del flujo sanguíneo para compararla con el flujo basal.

La hiperperfusión reactiva se puede detectar con técnicas que permiten valorar el flujo sanguíneo cerebral de Ia reperfusión cerebral como por ejemplo, pero sin limitarse, láser Doppler o técnicas no invasivas de neuroimagen como Ia tomografía computerizada o resonancia magnética.

La hiperperfusión puede ocurrir en cualquier parte del cuerpo de un animal después de sufrir una isquemia que se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, isquemia cerebral, isquemia miocárdica o isquemia renal. Preferiblemente el animal es un mamífero. Preferiblemente el mamífero es un humano.

Los ejemplos que se presentan en Ia presente invención se llevan a cabo in vivo en ratas. El efecto conseguido mediante Ia administración del compuesto de Ia presente invención al mamífero rata, puede extrapolarse al resto de mamíferos ya que los mecanismos de acción de cualquiera de los compuestos de Ia invención, se conservan en todos los mamíferos. Por otra parte se ha demostrado que Ia hiperperfusión en pacientes después de sufrir una isquemia, no sólo ocurre en ratas sino que también puede ocurrir en pacientes, o bien de forma espontánea, o después de administración de un tratamiento trombolítico con activador de plasminógeno tisular recombinante rt-PA (Kidwell et al., 2001. Neuroloαv. 57:2015-2021 ).

Otra realización preferida se refiere al uso del compuesto donde Ia hiperperfusión post-isquémica es cerebral. A título informativo, las causas más frecuentes de isquemia cerebral son: infarto lacunar (en pacientes con hipertensión vascular), infartos dependientes de las carótidas (por mecanismos hemodinámicos) o embolias cerebrales de origen cardíaco.

Según otra realización preferida, el medicamento se presenta en una forma adaptada a Ia administración oral o parenteral. Una realización más preferida se refiere a un compuesto donde el medicamento se presenta en una forma adaptada a Ia administración oral.

En cada caso Ia forma de presentación del medicamento se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, Ia composición de Ia presente invención se puede presentar bajo Ia forma de soluciones o cualquier otra forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente eficaz.

La forma adaptada a Ia administración oral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración oral. La forma adaptada a Ia administración oral se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, gotas, jarabe, tisana, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, granulado, sello, pildora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado.

La forma adaptada a Ia administración parenteral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración inyectable, es decir, preferiblemente en estado líquido. La administración parenteral se puede llevar a cabo por vía de administración intramuscular, intraarterial, intravenosa, intradérmica, subcutánea o intraósea pero sin limitarse únicamente a estos tipos de vías de administración parenteral. El compuesto de fórmula general (I) puede ir asociado, por ejemplo, pero sin limitarse, con liposomas o micelas. Un liposoma es una vesícula esférica con una membrana fosfolipídica. El liposoma contiene un núcleo de solución acuosa. La micela es un lípido esférico que contiene material no acuoso. Tanto los liposomas como las micelas pueden utilizarse como transportadores de diversas sustancias entre el exterior y el interior de Ia célula. Otra posibilidad es que el medicamento se presente en una forma adaptada a Ia administración sublingual, nasal, intracatecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada. La forma adaptada a Ia administración rectal se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, supositorio, cápsula rectal, dispersión rectal o pomada rectal. La forma adaptada a Ia administración transdérmica se selecciona de Ia lista que comprende, pero sin limitarse, parche transdérmico o iontoforesis.

Otra realización preferida se refiere al uso del compuesto, donde el medicamento incluye al menos un excipiente farmacológicamente aceptable.

El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a Ia absorción de cualquiera de los compuestos de Ia presente invención (sustancia activa), estabiliza dicha sustancia activa o ayuda a Ia preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que Io hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener Ia función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o Ia humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar Ia disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El término excipiente "farmacológicamente aceptable" hace referencia a que el excipiente esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.

Además, el excipiente debe ser farmacológicamente adecuado, es decir, un excipiente que permita Ia actividad del principio activo o de los principios activos, es decir, que sea compatible con el principio activo, en este caso, el principio activo es cualquiera de los compuestos de Ia presente invención. Otra realización preferida se refiere al uso de cualquiera de los compuestos de Ia invención, donde el medicamento incluye al menos un vehículo farmacológicamente aceptable.

El vehículo, al igual que el excipiente, es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los compuestos de Ia presente invención hasta un volumen o peso determinado. El vehículo farmacológicamente aceptable es una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos de Ia presente invención. La función del vehículo es facilitar Ia incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. Cuando Ia forma de presentación es líquida, el vehículo farmacológicamente aceptable es el diluyente.

Según otra realización preferida, el vehículo farmacológicamente aceptable es una sustancia grasa y el medicamento se presenta en una forma adaptada a Ia administración oral. Una realización más preferida se refiere al uso de un compuesto para Ia elaboración de un medicamento donde Ia sustancia grasa del vehículo farmacológicamente aceptable es aceite de oliva.

Cualquiera de los compuestos de Ia presente invención es liposoluble, es decir, es capaz de disolverse en una solución que tenga una sustancia grasa. El término "sustancia grasa" tal como se entiende en Ia presente invención es una sustancia formada mayoritariamente por ácidos grasos. La sustancia grasa se selecciona, por ejemplo, pero sin limitarse, de grasa de origen animal, grasa de origen vegetal o grasa de origen artificial.

Otra realización preferida de Ia presente invención se refiere al uso del compuesto descrito anteriormente donde el medicamento comprende además otra sustancia activa. Esta sustancia activa debe permitir Ia actividad de cualquiera de los compuestos de Ia invención, es decir, debe ser compatible. Otra realización preferida se refiere al uso del compuesto descrito anteriormente donde el medicamento se administra en dos tomas de 100 mg de compuesto por kilogramo (Kg) de peso corporal, por vía oral. Según una realización más preferida, Ia primera toma se administra a partir de entre el momento en el que se produce Ia reperfusión y 60 minutos después del inicio de Ia reperfusión. Una realización aún más preferida se refiere al uso donde el medicamento se administra a partir de entre 15 y 45 minutos después del inicio de Ia reperfusión.

Según otra realización preferida las dos tomas se administran con una diferencia de tiempo de entre 4 y 8 horas. Es decir, si Ia primera toma se realiza a los 30 minutos desde el inicio de Ia reperfusión, Ia segunda toma se realizará entre las 4 horas y 30 minutos desde el inicio de Ia reperfusión y las 8 horas y 30 minutos desde el inicio de Ia reperfusión.

La administración del medicamento se lleva a cabo en un animal. Preferiblemente el animal es un mamífero. Preferiblemente el mamífero es un humano. El término "toma" tal como se entiende en Ia presente invención es cada una de las veces que se administra el medicamento por vía oral. La dosis de cada una de las tomas es de 100 mg de cualquiera de los compuestos de Ia presente invención por kilogramo (Kg) de de peso corporal. El medicamento se administra en dos tomas que se realizan después del inicio de Ia reperfusión post-isquémica, a partir de entre 15 y 45 minutos después del inicio. Las dos tomas se administran separadas por un intervalo de tiempo de entre 4 y 8 horas.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Con Ia intención de complementar Ia descripción que se ha llevado a cabo, así como de ayudar a un mejor entendimiento de las características de Ia invención, de acuerdo con algunos ejemplos realizados, se muestran aquí, con carácter ilustrativo y no limitante, las siguientes figuras:

FIG. 1. Muestra el volumen de infarto después de Ia isquemia transitoria y permanente. ^** p<0.01

A: En el eje de ordenadas, se representa el volumen de infarto (I) en mm ³ en función del tipo de isquemia.

B: En el eje de ordenadas se representa Ia puntuación obtenida en el test neurológico en función del tipo de isquemia. En Ia isquemia permanente se analizan 5 individuos. En Ia isquemia transitoria se analizan 18 individuos.

FIG. 2. Muestra el efecto de Ia administración del agente antioxidante CR- 6 (dos dosis a las 2 y 8h después de Ia oclusión de Ia ACM).

Volumen infartado (p<0.05) (A): (I). Valoración neurológica (p≤0.05)(2B) (N). Medidas del volumen infartado en córtex (C): (IC). Medidas del volumen infartado en subcórtex (D): (IS). Volumen infartado después de Ia isquemia permanente (E): (I). Valoración neurológica (F): (N). En A, B, C y D se analizan 16 individuos a los que se les ha administrado sólo el vehículo y 14 individuos a los que se les ha administrado CR-6 junto con el vehículo. En E y F se analizan 5 individuos control y 4 individuos a los que se les ha administrado CR-6 junto con el vehículo. FIG. 3. Muestra el efecto de una dosis única de CR-6 sobre el volumen de infarto y sobre el déficit neurológico.

A. Efecto de una dosis única de CR-6 sobre el volumen de infarto. En el eje de ordenadas se representa el volumen infartado (I) en mm ³ . En el eje de abcisas se representan los valores medios del volumen infartado de 18 individuos a los que se les ha administrado el vehículo, 16 individuos a los que se les ha administrado CR-6 y 8 individuos a los que se les administró CR-6 únicamente 30 minutos después de Ia reperfusión.

B: En el eje de ordenadas se representa Ia puntuación obtenida en el test neurológico con una dosis única del vehículo (6 individuos) o de CR-6 con el vehículo (8 individuos).

FIG. 4. Muestra Ia influencia de Ia administración de CR-6 en los niveles de GSH.

A: En el eje de ordenadas se representa Ia concentración de GSH cortical (nmol/mg de proteína) en el córtex. CR-6 previene Ia caída de GSH en el córtex después de que los individuos sufran una isquemia.

B: En el eje de ordenadas se representa Ia concentración de GSH (nmol/mg de proteína) en el núcleo estriado. Hay dos regiones cerebrales afectadas por Ia isquemia: Ia corteza (o córtex) y el estriado. CR-6 previene Ia caída de GSH en el córtex después de que los individuos sufran una isquemia. C: En el eje de ordenadas se representa el volumen de infarto (I) en mm ³ frente a Ia concentración de GSH tanto para individuos a los que se administra el vehículo como a los que se administra CR-6 más el vehículo.

FIG. 5. Muestra Ia expresión neuronal de Cox-2 después de Ia isquemia y el efecto de CR-6. Magnifcación x200.

FIG. 6. Muestra el resultado de Ia isquemia en función de si hubo (Sl) o no (NO) hiperemia. A: En el eje de ordenadas se representa el infarto de volumen (Log mm ³ ) frente al flujo sanguíneo en Ia reperfusión (Log del porcentaje de incremento respecto del flujo sanguíneo basal) en el eje de abcisas. B: En el eje de ordenadas se representa el porcentaje de flujo en Ia reperfusión de 5 individuos sin hiperemia (NO) y de 13 individuos con hiperemia (Sl), todos ellos administrados con el vehículo.

C: En el eje de ordenadas se representa el volumen de infarto en los grupos que se han comentado para Ia figura B. D: En el eje de ordenadas se representa Ia puntación de Ia valoración neurológica en los grupos que se han comentado anteriormente.

E: En el eje de ordenadas se representa el volumen de infarto cortical en los grupos que se han comentado anteriormente.

F: En el eje de ordenadas se representa el volumen de infarto subcortical en los grupos que se han comentado anteriormente.

FIG. 7. Muestra el efecto de CR-6 y vehículo (aceite de oliva) en animales hiperémicos (Sl) y no hiperémicos (NO).

Los términos Sl y NO siempre hacen referencia a si hubo o no hiperemia. Por ejemplo, vehículo-SI = administrado con vehículo, con hiperemia; vehículo-NO = administrado con vehículo, sin hiperemia.

En los ejes de abcisas se representan los valores medios de determinados parámetros en los siguientes grupos de individuos: 5 individuos a los que se les administra el vehículo y que no desarrollan hiperemia, 13 individuos a los que se les administra el vehículo y que sí desarrollan hiperemia, 7 individuos a los que se les administra CR-6 y que no desarrollan hiperemia, y 7 individuos a los que se les administra CR-6 y que sí desarrollan hiperemia. Los parámetros que se representan en cada uno de los ejes de ordenadas son: porcentaje de flujo sanguíneo respecto del flujo basal en Ia reperfusión (A), porcentaje de flujo sanguíneo respecto del flujo basal durante Ia oclusión de Ia arteria cerebral media, MCA (B), volumen de infarto (C), valoración neurológica (D), medidas del volumen infartado en córtex (E) y medidas del volumen infartado en subcórtex (F).

FIG. 8. Muestra cómo Ia hiperemia (Sl) se asocia a rotura de BHE y cómo CR-6 atenúa dicho efecto.

En el eje de ordenadas se representa Ia concentración de Evans Blue (Azul de Evans) en el grupo de individuos a los que no se administra ni vehículo ni CR-6 y a los que sí que se les administra vehículo o CR-6 (junto con su vehículo).

FIG. 9. Muestra el número de neutrófilos por área de tejido isquémico en función de si los animales desarrollaron hiperemia y del tratamiento recibido.

En el eje de ordenadas se representa el valor medio del n° de células MPO+ por área En las imágenes de microscopía en las que se ha realizado una tinción para ver los neutrófilos marcados por inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-mieloperoxidasa (MPO) se ha contado el número de células positivas por área.

FIG. 10. Muestra Ia formación de ion superóxido en Ia arteria cerebral media (MCA) en el grupo de ratas tratadas sólo con el vehículo pero no en el grupo de ratas tratadas con CR-6, según tinción con dihidroetidio (DHE).

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos ilustrativos y de carácter no limitante, realizados por los inventores que describen el uso de prolactina para Ia hepatoprotección y regeneración de células hepáticas. EJEMPLO 1. MÉTODOS

1.1. Animales

Fueron usadas ratas macho adultas Sprague-Dawley (Harían, Spain) de entre 300 y 350 gramos de peso. El trabajo con los animales se llevó a cabo de acuerdo con Ia legislación local y con Ia aprobación del Comité Ético de Ia Universidad de Barcelona y de acuerdo con Ia legislación Europea vigente. Los animales se mantuvieron respetando el ciclo de vigilia/sueño de 12 h, y controlando las condiciones ambientales de temperatura y humedad, y se les dio agua y comida ad libitum. La anestesia utilizada en las intervenciones quirúrgicas fue isofluorano.

1.2. Inducción de Ia isquemia focal.

La isquemia cerebral focal fue inducida por oclusión intraluminal de Ia arteria cerebral media (ACM) derecha (Justicia et al., 2006 J. Cereb. Blood Flow Metab., 26: 321-32). Un grupo de ratas fueron sometidas a 90 minutos de isquemia seguida de reperfusión, mientras que otro grupo fue sometido a una isquemia permanente. Las ratas fueron anestesiadas con isofluorano e intubadas por Ia tráquea bajo ventilación controlada. Durante todo el procedimiento quirúrgico se obtuvieron varias muestras sanguíneas para Ia determinación de gases en sangre. La presión arterial fue monitorizada durante todo el procedimiento y Ia temperatura corporal mantenida entre 36,5 y 37,5 ⁰ C. La arteria carótida común y externa fueron expuestas y Ia arteria pterigopalatina fue ligada. Un filamento de nylon (4/0, looksutures, Havard- Apparatus) de 21 mm se introdujo a través de Ia arteria carótida externa hasta el nivel donde se ramifica Ia ACM. Este filamento fue cautelosamente retirado en el grupo sometido a Ia reperfusión tras 90 minutos de Ia oclusión, y Ia ligadura de Ia ACM fue desecha permitiendo Ia reperfusión. En el grupo sometido a una isquemia permanente el filamento intraluminal se mantuvo en su sitio sin ser retirado. Las ratas se recuperaron de Ia anestesia, y a las 8, 24 ó 48 horas después de Ia oclusión de Ia ACM fueron profundamente anestesiadas con isofluorano y sacrificadas por perfusión coronaria con bomba de infusión de 60 ml_ de salino heparinizado (30 U/mL) a un volumen de infusión de 10 mL/min seguido por 120 ml_ de salino para retirar Ia sangre de los tejidos cerebrales.

1.3. Medida de Ia perfusión cortical.

La perfusión cortical fue medida con un sistema de láser-Doppler (Perimed, Sweden) en las ratas sometidas a Ia oclusión de ACM. El día anterior a Ia inducción de Ia isquemia, las ratas se anestesiaron para Ia implantación de una guía en Ia superficie del cráneo después de reducir 1 mm el grosor del hueso con una pequeña broca. La guía se fijó al cráneo con cemento dental y 2 pequeños tornillos siguiendo las coordenadas: 2 mm posterior y 3,5 mm lateral con relación a bregma, sobre el hemisferio ipsilateral (derecho). Al día siguiente se introdujo una sonda láser-Doppler a través de Ia guía y se empezó el registro. Después de un registro estable, Ia isquemia fue inducida. La perfusión fue continuamente monitorizada antes de Ia isquemia, durante los 90 minutos de ésta y los primeros 15 minutos de reperfusión. Algunos datos de Ia perfusión se usaron para Ia exclusión de algunos animales del estudio como por ejemplo:

1 ) ratas que después de Ia introducción del filamento para Ia oclusión de MCA no recuperaron Ia perfusión hasta el 40% o más del nivel basal; éstos animales fueron excluidos del estudio ya que se consideró que Ia isquemia no había sido exitosa posiblemente debido a factores individuales de Ia anatomía cerebrovascular. El porcentaje de disminución del flujo sanguíneo necesario para causar infarto según nuestras condiciones experimentales fue del 40%, verificando que con una caída inferior las ratas no desarrollaron un infarto.

2) Las ratas que no mostraron una recuperación a Ia reperfusión por encima del 80% del nivel basal fueron excluidas del estudio ya que sólo mostraron una restauración parcial del flujo sanguíneo. Estos criterios de exclusión son independientes del tratamiento que se inició a los 30 minutos de Ia reperfusión, una vez que se obtuvieron datos del flujo sanguíneo. 1.4. Tratamiento

CR-6 fue sintetizado químicamente como previamente se refirió (Casas et al., 1992. J. Agrie. Food Chem., 40: 585-90). CR-6 fue disuelto en aceite de oliva comestible y comercializado (Carbonell, España) y se administró oralmente a las ratas a una dosis de 1 mL (100 mg/Kg) usando un medidor de comida. El mismo aceite fue usado como vehículo. Cada animal fue tratado dos veces a las 2 h y 8 h del comienzo de Ia isquemia, ó sólo a las 2 h. Las ratas recibieron un código que no revelaba el tipo de tratamiento asignado a cada animal.

1.5. Evaluación del volumen de infarto

Para Ia determinación del volumen de infarto, las ratas fueron anestesiadas con isofluorano y sacrificadas por decapitación a las 24 h. El cerebro se retiró y se cortó en secciones coronales de 2 mm de grosor, que fueron teñidos con una solución al 1 % de cloruro de 2, 3, 5-triphenyltetrazolio (TTC) durante 10 minutos a 37 ⁰ C. Los cortes se sumergieron toda Ia noche en una solución al

4% de paraformaldehído en tampón fosfato y después se lavaron y se guardaron en tampón fosfato 0,1 M a un pH de 7.4. Las mitocondrias de los tejidos isquémicos no reaccionaron a Ia tinción con TTC, mientras que se adquirieron color rojo en los tejidos sanos. En las imágenes de las secciones, se midieron las zonas blancas o claras de cada sección, rectificando Ia zona del edema producido en Ia zona cerebral infartada por el ratio entre las áreas contralateral e ipsilateral. Las áreas fueron integradas para calcular el volumen infartado.

1.6. Valoración neurológica

Un simple test neurológico en una escala de 0 a 9 puntos (0 = no déficit y 9 = Ia deficiencia más alta) se realizó como se indicaba previamente (Justicia et al., 2006. J Cereb. Blood Flow Metab.. 26: 321-32) antes de Ia muerte de los animales. Se siguieron 4 test para Ia evaluación: 1 ) Actividad espontánea (movimiento/exploración = 0; movimiento sin exploración = 1 ; no movimiento ó sólo cuando se Ie tira de Ia cola = 2).

2) Rotación hacia Ia izquierda (si no hace nada = 0; si hay elevación de Ia cola o Ia rata se estira o se arrastra {push & pulí) = 1 ; espontáneamente = 2; rotación sin desplazamiento (spinning top) = 3.

3) Resistencia a Ia extensión de Ia pata izquierda (si no se puede realizar Ia extensión = 0; si se puede realizar extensión = 1 ; si no hay resistencia a Ia extensión = 3). 4) Reflejo a Ia caída (simétrico = 0; asimétrico = 1 ; pata delantera contralateral retraída = 3)

1.7. Análisis de permeabilidad de Ia barrera hematoencefálica

Para el análisis de Ia permeabilidad de Ia barrera hematoencefálica (BBB, siglas del término en inglés), se inyectaron 4 mL/Kg (por Kg de peso corporal) de solución de Evans Blue al 2% en solución salina a través de Ia vena femoral 4 h después Ia inducción de Ia reperfusión. 2 h más tarde, las ratas fueron anestesiadas y se realizó perfusión transcardíaca para eliminar Ia sangre del tejido. El cerebro se cortó en secciones coronales y en cortes de 2mm de grosor y dos de las secciones (coordenadas de Bregma) fueron usadas para Ia extracción de Evans Blue, mientras una tercera sección fue guardada para Ia extracción de RNA. El córtex ipsilateral y contralateral y el estriado se diseccionaron, se pesaron y se sumergieron en una solución al 50% de ácido tricloroacético (TCA) (1.3 ml_ por gramo de tejido). El tejido se homogenizó por medio de un polytron y se centrifugó a 12000 x g durante 20 minutos. El sobrenadante se mezcló con etanol (1 :3). La intensidad de fluorescencia fue medida en un fluorímetro a 680 nm usando una alícuota de 110 μl de muestra. La concentración de Evans Blue (ng/mL) se calculó usando una curva estándar con las concentraciones conocidas de este colorante.

1.8. Determinación de Ia concentración de GSH 24 horas después de provocar Ia isquemia, las ratas fueron anestesiadas y perfundidas a través del corazón usando una bomba de infusión a una frecuencia de 10 mL/min con 60 ml_ de solución salina heparinizada a Ia concentración de (30 U/mL) seguido de 120 ml_ de solución salina para extraer toda Ia sangre del cuerpo. El tejido cerebral se extrajo y se diseccionó separando el córtex y el estriado ipsilateral y contralateral y fue rápidamente congelado y almacenado a -8O ⁰ C hasta su análisis. La concentración de GSH fue estimada según Ia siguiente fórmula: GSH = GSH - (2xGSSG).

1.9. Inmunohistoquímica

La expresión de Ia proteína ciclooxigenasa-2 (Cox-2) se estudió por inmunoquímica como previamente se describe (Planas et al., 2002. J. Cereb. Blood Flow Metab., 22: 918-925) a las 24 h post-isquemia. Se sumergieron 2 mm de una sección coronal de cerebro en 4% de paraformaldehído en tampón fosfato a pH 7.4 durante toda Ia noche y después se lavaron en el mismo tampón. La inmunohistoquímica de Cox-2 se realizó en secciones flotantes obtenidas en el vibratomo. Se obtuvieron secciones de 50 μm de grosor y se sometieron a inmunotinción usando anticuerpos monoclonales contra Cox-2 (Cayman) diluido 1 :200. La inmunohistoquímica contra Ia mieloperoxidasa (MPO) (Pharmingen) se realizó en secciones de parafina que se obtuvieron después de incluir 2 mm de cerebro en parafina y de obtener cortes de 5 μm de grosor en el microtomo. Se usaron anticuerpos monoclonales de ratón contra MPO a una dilución de 1 :500. Después del anticuerpo primario, las secciones fueron incubadas con anticuerpos secundarios biotinilados seguidos por el procedimiento de ABC (Serotec). La reacción de revelado se llevó a cabo con diaminobencidina como se describe en (Planas et al., 2002. J. Cereb. Blood Flow Metab., 22: 918-925). El número de células por área se contó en tres áreas de cada sección.

1.10. Determinación de Ia formación de anión superóxido en Ia arteria cerebral media aislada La ACM ipsilateral al hemisferio isquémico se aisló de algunos animales después de 24 h post-isquemia. Los segmentos de Ia arteria se colocaron en solución KHS (de las siglas en inglés de Krebs-Henseleit solution) conteniendo sacarosa al 30% durante Ia noche y se transfirieron a un criomolde (Bayer Química Farmacéutica, Barcelona, Spain) relleno de medio de inclusión (Tissue Tek OCT embedding médium, Sakura Finetek Europe, The Netherlands) durante 20 minutos, y después se congelaron en nitrógeno líquido y se guardaron a -7O ⁰ C. El colorante fluorescente dihidroetidio (DHE) se utilizó para evaluar Ia producción de 02 ^" in situ, tal como se ha descrito previamente (Jimenez-Altayó et al., 2006. J. Pharmacol. Exp. Ther.. 316: 42-52; Martinez- Revelles et al., 2008. Pharmacol. Exp. Ther., 325: 363-369).

1.11. Análisis estadístico

La comparación entre los dos grupos se hizo con Ia realización del t-test ó del test no paramétrico de Mann-Whitney, dependiendo de si los valores pasaron o no pasaron el test de normalidad (D'Agostino &Pearson ómnibus normally test). Las comparaciones entre más de dos grupos se hicieron con one-way ANOVA seguida del análisis post-hoc de Bonferroni's para valores que se ajustaban a Ia normalidad, o con el test de Kruskal-Wallis seguido del Dunn's Múltiple Comparíson Test. Se consideraron significativos aquellos valores p<0.05. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism software.

EJEMPLO 2. RESULTADOS

2.1. Volumen de infarto después de Ia isquemia transitoria y permanente

La oclusión de Ia ACM en rata Sprague-Dawley puede inducir varios grados de lesión tisular y consecuencias funcionales. El volumen infartado (media±desviación estándar) fue menor (p<0.01 ) después de una isquemia transitoria (140.2±64.4 mm ³ ) que en Ia isquemia permanente (265.6±69.2 mm ³ ) (FIG. 1 B). Sin embargo, el déficit neurológico sólo mostró una insignificante tendencia a incrementar después de isquemia permanente comparado con Ia transitoria (p=0.1 ) (FIG. 1C). Esta observación sugiere que, en relación a Ia extensión del tejido lesionado, el déficit funcional fue comparativamente peor después de Ia isquemia transitoria que de Ia permanente.

2.2. CR-6 reduce el volumen de infarto y mejora el déficit neurológico después de Ia isquemia transitoria pero no en Ia permanente

La administración del agente antioxidante CR-6 (dos dosis a las 2 y 8 h después de Ia oclusión de Ia ACM redujo el volumen infartado (p≤0.05) (FIG. 2A) y mejoró Ia valoración neurológica (p<0.05) (FIG. 2B) después de Ia isquemia transitoria. El CR-6 protegió al córtex y al estriado (FIG. 2C, D). No obstante, este tratamiento con CR-6 no tuvo efecto protector después de Ia isquemia permanente (FIG. 2E, F). En el grupo del CR-6, el volumen infartado fue significativamente más extenso (p≤O.001 ) después de Ia isquemia permanente (300.1 ±38.4 mm ³ ) que de Ia isquemia transitoria, pero, de nuevo, Ia valoración neurológica sólo demostró una insignificante tendencia a aumentar después de Ia isquemia permanente vs a Ia transitoria (p=0.06).

Una administración única de CR-6 a las 2 h de Ia reperfusión no fue suficiente para inducir Ia protección, puesto que no redujo el volumen infartado (FIG. 3A) ni tampoco mejoró el déficit neurológico (FIG. 3B). Esto sugiere que una acción prolongada del antioxidante puede ser necesaria para neutralizar los efectos de Ia reperfusión.

2.3. El consumo de glutatión endógeno fue atenuado en los animales tratados con CR-6.

La concentración del glutatión total (GSx) y del oxidado (GSSG) se determinó en el córtex ipsilateral y contralateral y en el estriado a las 24 h post-isquemia en las ratas tratadas con vehículo ó CR-6 y Ia reducción del contenido en glutatión reducido (GSH) se calculó con las medidas previas (ver Métodos). A las 24 h después de Ia isquemia transitoria, Ia concentración de GSH, estaba significativamente reducida en el córtex ipsilateral (p≤0.05) (FIG. 4A) y en el estriado (p≤O.001 ) (FIG. 4B) de las ratas isquémicas que recibieron vehículo. Este efecto fue atenuado por CR-6, ya que el contenido en GSH en este grupo no fue significativamente diferente de los controles no isquémicos. (FIG. 4A, B). Se encontró una relación negativa entre el contenido en GSH y el volumen infartado (FIG. 4C), Io que sugirió que el grado de consumo de GSH era un indicativo de Ia magnitud de Ia lesión tisular después de Ia isquemia/perfusión.

2.4. CR-6 atenuó Ia expresión marcadores de inflamación y de daño cerebral

La isquemia induce Ia expresión de Ia proteína Cox-2 a las 24 h (FIG. 5) y este efecto fue altamente atenuado por CR-6 (FIG. 5). Cox-2 fue principalmente detectado en neuronas (FIG. 5) sugiriendo que el estrés oxidativo está involucrado en Ia inducción de Cox-2 neuronal y que el efecto de CR-6, también directa ó indirectamente alcanza las neuronas.

2.5. Relación de Ia hiperemia reactiva después de una isquemia transitoria y volumen infartado.

El estudio de Ia perfusión cortical antes (basal), durante y después de Ia isquemia, demostró que algunas ratas muestran valores de flujo sanguíneo en Ia reperfusión muy similar a los valores básales, mientras que otras ratas muestran valores muy por encima de los básales. En el grupo vehículo (n=18), se encontró una relación entre el grado de incremento del flujo sanguíneo a Ia reperfusión y el volumen infartado, ya que el logaritmo de estos valores está positivamente correlacionado (p<0.002) (FIG. 6A). Esto indica que el aumento del flujo sanguíneo en Ia reperfusión por encima de los niveles básales (i.e hiperemia reactiva) se asocia a una mayor extensión del volumen infartado. Sin embargo, no se encontró relación entre el desarrollo de Ia hiperemia reactiva y Ia bajada del flujo sanguíneo durante Ia isquemia, indicando que Ia magnitud de Ia hiperemia no depende del grado de caída de flujo durante Ia isquemia. La hiperperfusión se definió como un aumento de flujo superior al 20% del basal, por encima de Ia cual se consideró que las ratas mostraban hiperemia reactiva (para referirse a este término, en Ia presente invención también se utiliza el término hiperperfusión) (FIG. 6B). La media ±desviación estándar (DE) de flujo sanguíneo durante Ia isquemia fue similar en el grupo de ratas con hiperemia (44.1±17.5 % del flujo basal) que en el grupo sin ella (53.4±10.7 % del flujo basal). Entonces los volúmenes infartados fueron comparados en función de Ia presencia o ausencia de hiperemia reactiva, de acuerdo con nuestra definición. El volumen infartado (valor medio±SD) fue más extenso (p≤0.01 ) en el grupo de ratas que mostró hiperemia (162.7±56.6) que en el grupo que no mostró hiperemia (81.7±45.5 mm ³ ) (FIG. 6C). Además, Ia valoración neurológica (valor medio±SD) fue peor (p<0.05) en el grupo con hiperemia (5.4±1.5 puntos) que en el no-hiperémico (3.6±1.3 puntos). (FIG. 6D). La hiperemia se refiere a Ia hiperperfusión cortical ya que con Ia sonda del láser Doppler se midió el flujo de sanguíneo cortical. De acuerdo con esto, el infarto cortical (valor medio±SD) fue más extenso (p≤0.01 ) en el grupo hiperémico (93.7±48.4 mm ³ ) que en el no hiperémico (17.6±16.0 mm ³ ) (FIG. 6E). En cambio, no se encontraron diferencias significativas en el volumen infartado (valor medio±SD) entre el estriado del grupo con hiperemia (67.4±17.8 mm ³ ) y el grupo no hiperémico (56.5±28.4 mm ³ ) (FIG. 6F). Estos resultados sugieren que Ia hiperemia cortical en Ia reperfusión tiene valor predictivo de Ia exacerbación del daño cortical por reperfusión y por Io tanto es un marcador de daño de Ia reperfusión.

2.6. CR-6 es protector en aquellos animales que muestran hiperemia reactiva

Tomando todos los animales juntos (n=33), Ia incidencia de hiperemia fue del 62%. No obstante, Ia hiperemia no fue equitativamente distribuida en los dos grupos. Así, Ia hiperemia fue retrospectivamente encontrada en el 72% de las ratas asignadas en el grupo vehículo (n=18) mientras que sólo fue del 50% en el grupo del CR-6 (n=14) las que Ia habían desarrollado. El aumento de Ia perfusión en los grupos hiperémicos fue similar entre el grupo del CR- 6 y el del vehículo (FIG. 7A). Además, el grado de caída del flujo sanguíneo durante Ia isquemia fue similar en todos los grupos (FIG. 7B). En el grupo de animales que fueron tratados con CR-6, el volumen infartado (valor medio±SD) fue similar tanto si previamente habían desarrollado hiperemia (85.7±39.2 mm ³ ) como si no Ia habían desarrollado (73.8±40.6 mm ³ ) (FIG. 7C). Sin embargo, las ratas hiperémicas tratadas con CR-6 mostraron una reducción del volumen infartado (p≤0.01 ) respecto a las ratas hiperémicas tratadas con vehículo (FIG. 7C). En cambio el volumen de infarto fue similar en Ia ratas no hiperémicas tratadas con CR-6 ó vehículo (FIG. 7C).

Resultados similares se encontraron para Ia valoración neurológica, ya que las ratas hiperémicas tratadas con CR-6 tenían un déficit neurológico menor que aquellas que recibieron vehículo. Sin embargo no hubo grandes diferencias en Ia valoración entre las ratas no hiperémicas tratadas con CR-6 o con vehículo (FIG. 7D). La proteína CR-6 protegió de una manera más efectiva el córtex (i.e Ia región que desarrolló más lesión con Ia hiperemia) que el estriado (FIG. 7E, F). Estos resultados mostraron que CR-6 protegió de manera más efectiva a las ratas hiperémicas que a las no hiperémicas, sugiriendo que éste antioxidante ejerce más efecto en condiciones en las que aparecen signos de lesión por reperfusión como se ha visto en el córtex en el presente modelo experimental.

2.7. CR-6 atenúa las alteraciones de Ia permeabilidad de Ia barrera hematoencefálica

Los animales con hiperemia desarrollaron alteraciones de Ia permeabilidad de Ia barrera hematoencefálica, BHE (BBB, de las siglas en inglés), según se observó con extravasación de Evans Blue (FIG. 8). La extravasación de Evans Blue tendió a ser menor después de Ia administración de CR-6. Las diferencias que se vieron con el grupo vehículo no fueron significativas. Los signos de Ia permeabilidad de Ia barrera hematoencefálica no se observaron en todas las ratas.

2.8. CR-6 reduce Ia infiltración de neutrófilos

La expresión de mieloperoxidasa (MPO) se examinó para valorar Ia infiltración de neutrófilos al tejido lesionado. En los animales hiperémicos se detectó un aumento en Ia infiltración de neutrófilos comparado con los no hiperémicos. El número de células MPO-positivas (MPO+) por área fue mayor en el grupo vehículo que en el grupo CR-6. Se demuestra que los individuos que no sufren hiperemia tienen menor número de células MPO+ que los individuos que sí que han sufrido una hiperemia.

2.9. CR-6 atenuó el estrés oxidativo en Ia ACM aislada.

Se procedió con el aislamiento de Ia ACM de ratas tratadas con CR-6 o con vehículo a las 24 h post-isquemia. Comparado con las ratas operadas del grupo control, Ia isquemia transitoria indujo Ia formación de superóxido (que detectamos con Ia técnica de dihidroetidio; DHE) en Ia ACM en el grupo vehículo (FIG. 10), mientras que el CR-6 inhibió Ia formación de superóxido en Ia ACM.

En base a todos estos hallazgos, se concluye que Ia hiperemia reactiva a una temprana reperfusión es un signo de lesión por reperfusión. Dado el beneficio de Ia supresión prolongada del estrés oxidativo después de Ia reperfusión que hemos descrito aquí, tenemos Ia hipótesis de que una isquemia transitoria puede inducir alteraciones del flujo sanguíneo cerebral que se producen durante varias horas después de Ia reperfusión y que pueden contribuir significativamente a Ia lesión por reperfusión. La hiperperfusión en Ia reperfusión post-isquémica no es un fenómeno que ocurre sólo en ratas, ya que algunos pacientes pueden desarrollar una hiperperfusión después una trombólisis con rt-PA (Kidwell et al.2001. Los resultados que se muestran en Ia presente invención muestran que sólo algunos individuos (ratas) que desarrollan hiperperfusión son diana para el tratamiento con antioxidantes, Io que significa que los efectos beneficiosos del

CR-6 en Ia afectación neurológica y el volumen infartado sólo se dieron en esos animales, pero no en animales que no desarrollaron hiperperfusión en Ia reperfusión ó en animales que no presentaron reperfusión.

En conclusión, los presentes resultados muestran que el antioxidante CR-6 es protector en Ia isquemia/reperfusión en ratas, que esta protección es especifica para un subgrupo de animales que desarrollaron hiperemia en el momento de Ia reperfusión, que el daño cerebral fue mayor en esos animales comparado con los animales que no mostraron hiperperfusión, que el tratamiento con antioxidante se debe mantener durante varias horas después de Ia reperfusión y que CR-6 confiere beneficios en Ia interfase entre Ia sangre y el cerebro previniendo Ia generación de estrés oxidativo y nitrosativo en los vasos sanguíneos y previniendo el colapso o ruptura de Ia BHE.