MEDICAMENTOS

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de 1,2-derivados de ácidos grasos poliinsaturados como medicamentos, preferentemente en el tratamiento de enfermedades cuya etiología común está basada en alteraciones de los lípidos de la membrana celular como, por ejemplo: alteraciones en el nivel, en la composición o en la estructura de dichos lípidos y las proteínas que con ellos interaccionan; así mismo en el tratamiento de enfermedades en las que la regulación de la composición y estructura lipídica de la membrana, así como de las proteínas que interaccionan con ella, induzca la reversión del estado patológico.

Así, la presente invención, debido a su amplio espectro de aplicación, es susceptible de ser englobada de forma general en el campo de la medicina y la farmacia.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las membranas celulares son estructuras que definen la entidad de las células y de los orgánulos en ellas contenidas. En las membranas o en sus proximidades ocurren la mayoría de los procesos biológicos. Los lípidos no sólo tienen un papel estructural, sino que regulan la actividad de importantes procesos. Es más, la regulación de la composición lipídica de la membrana también influye en la localización o la función de importantes proteínas implicadas en el control de la fisiología celular, como las proteínas G o la PKC (Escriba et al., 1995; 1997; Yang et al; 2005; Martínez et al., 2005). Estos y otros estudios demuestran la importancia que tienen los lípidos en el control de importantes funciones celulares. De hecho, numerosas enfermedades en humanos tales como, entre otras, el cáncer, enfermedades cardiovasculares, procesos neurodegenerativos, obesidad, desórdenes metabólicos, procesos y enfermedades de tipo inflamatorio, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes, se han relacionado con alteraciones en los niveles o en la composición de los lípidos presentes en las membranas biológicas, evidenciándose, además, los efectos beneficiosos que presentan los tratamientos con otros ácidos grasos distintos a los de la presente invención y que regulan la composición y estructura de los lípidos de membrana, pudiendo ser empleados para revertir dichas enfermedades (Escriba, 2006).

Los lípidos que se ingieren en la dieta regulan la composición lipídica de las membranas celulares (Alemany y cois., 2007). Asimismo, diferentes situaciones fisiológicas y patológicas pueden cambiar los lípidos presentes en las membranas celulares (Buda y cois., 1994; Escriba, 2006). A modo de ejemplo de situación fisiológica que induce cambios en los lípidos de membrana se puede mencionar los peces que viven en ríos con temperatura variable, cuyos lípidos experimentan importantes cambios (cambios en la cantidad y en los tipos de lípidos de membrana) cuando la temperatura baja desde 2O ⁰ C (verano) hasta 4 ⁰ C (invierno) (Buda et al. 1994). Estos cambios permiten el mantenimiento de sus funciones en tipos celulares de muy diversa naturaleza. Ejemplos de procesos patológicos que pueden influir en la composición lipídica son las patologías neurológicas o inducidas por drogas (Rapoport, 2008). Por ello, se podría decir, que los lípidos de membrana pueden determinar el buen o mal funcionamiento de múltiples mecanismos de señalización celular.

Los cambios en la composición lipídica de las membranas influyen sobre la señalización celular, pudiendo dar lugar al desarrollo de enfermedades o bien a revertirías (Escriba, 2006). Diferentes estudios realizados durante los últimos años indican que los lípidos de membrana desempeñan un papel mucho más importante del que se les había asignado hasta ahora (Escriba et al, 2008). La visión clásica de la membrana celular asigna a los lípidos un papel meramente estructural, como soporte de las proteínas de membrana, que serían los únicos elementos funcionales de la membrana. La membrana plasmática tendría un papel adicional, como aislante, impidiendo que penetren al interior celular agua, iones y otras moléculas. Sin embargo, las membranas tienen otras funciones de gran relevancia en el mantenimiento de la salud, en la aparición de enfermedades y en su curación. Dado que un organismo enfermo lo es porque sus células están enfermas, las alteraciones en los lípidos de membrana producen alteraciones en las células y éstas pueden dar lugar a la aparición de enfermedades. De forma análoga, intervenciones terapéuticas, nutracéuticas o cosméticas enfocadas a regular los niveles de lípidos de membrana pueden prevenir y revertir (curar) procesos patológicos. Además, numerosos trabajos indican que el consumo de grasas saturadas y írans-monoinsaturadas está relacionado con el deterioro de la salud. Además de las enfermedades neurológicas, arriba indicadas, las patologías vasculares, tumorales y otras, también se han relacionado directamente con los lípidos de membrana (Stender y Dyerberg, 2004). El deterioro de un organismo se manifiesta en la aparición de éstos y otros tipos de enfermedades, que pueden incluir metabolopatías, inflamación, neuro degeneración, etc.

Las membranas celulares constituyen la barrera selectiva a través de la cual una célula intercambia metabolitos e información con otras células y con el medio extracelular que la rodea. Sin embargo, las membranas desempeñan otras funciones muy importantes para la célula. Por una parte, sirven de soporte a proteínas implicadas en la recepción o emisión de mensajes que controlan importantes parámetros orgánicos. Dichos mensajes, mediados por numerosas hormonas, neurotransmisores, citoquinas, factores de crecimiento, etc., activan proteínas de membrana (receptores), que propagan la señal recibida al interior celular a través de otras proteínas (proteínas periféricas de membrana), algunas de las cuales también se ubican en la membrana. Dado que (1) estos sistemas funcionan como cascadas de amplificación y (2) que los lípidos de membrana pueden regular la localización y función de dichas proteínas periféricas, la composición lipídica de las membranas puede tener un impacto importante en la funcionalidad celular. En concreto, la interacción de ciertas proteínas periféricas, como las proteínas G, la proteína kinasa C, la proteína Ras, etc., con la membrana celular depende de la composición lipídica de la misma (Vógler et al., 2004; Vógler et al, 2008). Por otro lado, la composición lipídica de las membranas celulares está influenciada por el tipo y la cantidad de los lípidos ingeridos (Escriba et al, 2003). De esto se deduce, que la ingesta de lípidos puede regular la composición lipídica de las membranas, que a su vez puede controlar la interacción (y por ello la actividad) de importantes proteínas de señalización celular (Yang et al., 2005).

El hecho de que los lípidos de membrana puedan controlar la señalización celular, supone que también puedan regular el estado fisiológico de las células y por ende, del estado general de salud. De hecho, se han descrito efectos tanto negativos, como positivos de los lípidos sobre la salud (Escriba et al, 2006; Escriba et al, 2008). Estudios preliminares han demostrado que el ácido 2-hidroxioleico, que es un ácido graso monoinsaturado, es capaz de revertir ciertos procesos patológicos, como el sobrepeso, la hipertensión o el cáncer (Alemany et al, 2004; Martínez et al, 2005; Vógler et al, 2008).

Las enfermedades cardiovasculares están frecuentemente asociadas a la hiperproliferación de las células que constituyen los tejidos cardíaco y vascular. Esta hiperproliferación de células cardiovasculares da lugar a depósitos en el lumen interno de los vasos y cavidades del sistema cardiovascular que se traducen en una amplia gama de enfermedades, como la hipertensión, la aterosclerosis, la isquemia, aneurismas, ictus, infartos, anginas de pecho, accidentes cerebrovasculares etc. (Schwartz et al, 1986). De hecho, se ha sugerido el desarrollo de medicamentos que eviten la proliferación celular para la prevención y tratamiento de enfermedades cardiovasculares (Jackson y Schwartz, 1992).

La obesidad se produce por una alteración entre el balance de ingesta y gasto energético que se debe, en parte, a alteraciones en los mecanismos que regulan estos procesos. Por otro lado, esta patología se caracteriza por la hiperplasia (aumento en el número de células) o hipertrofia (aumento en el tamaño) de las células del tejido adiposo, los adipocitos. Numerosos estudios demuestran que los ácidos grasos, bien libres o como parte de otras moléculas, pueden influir sobre una serie de parámetros relacionados con la homeostasis energética, como la masa de grasa corporal, el metabolismo lipídico, la termogénesis o la ingesta, entre otros (Vógler et al, 2008). En este sentido, la modificación de ácidos grasos podría ser una estrategia para regular la homeostasis energética, es decir el balance entre la ingesta y el gasto energético, y por ello procesos relacionados como el apetito o el peso corporal.

Los procesos neurodegenerativos dan lugar a una serie de enfermedades con diferentes manifestaciones, pero con la característica común de estar ocasionadas por degeneración o disfunciones de las células del sistema nervioso central y/o periférico.

Algunos de estos procesos neurodegerativos suponen una merma importante de la capacidad cognitiva de los pacientes o alteraciones de tipo motor. Los procesos neurodegenerativos, desórdenes neurológicos y neuropsiquiátricos tienen una base común de degeneración neuronal o alteraciones de sus componentes, como lípidos

(por ejemplo la mielina) o proteínas de membrana (por ejemplo los receptores adrenérgicos, receptores serotonérgicos, etc.). Estas patologías del sistema nervioso central incluyen, entre otras, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis múltiple, la esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis del hipocampo y otros tipos de epilepsia, la esclerosis focal, la adrenoleucodistrofia y otros tipos de leuco distrofia, la demencia vascular, la demencia senil, los dolores de cabeza incluida la migraña, traumatismo del sistema nervioso central, desórdenes del sueño, vértigo, dolor, accidentes cerebrovasculares, la depresión, la ansiedad, las adicciones, etc. Además, ciertas enfermedades neurológicas y neurodegenerativas pueden derivar en procesos en los que se desarrolla ceguera, problemas de audición, desorientación, alteraciones en el estado de ánimo, etc. Un ejemplo de desorden neurodegenerativo bien caracterizado lo constituye la enfermedad de Alzheimer, en la que se ha observado la formación de placas seniles, formadas por restos de proteínas de membrana (p.ej., el péptido β-amiloide) que proceden de un procesamiento peptídico erróneo, seguido de una acumulación en el exterior de las células, y de ovillos de neuro filamentos de proteína Tau, que aparecen en el interior celular. Este proceso se ha asociado a alteraciones en el metabolismo del colesterol y la consecuente alteración de los niveles de ciertos lípidos de membrana, como el colesterol y el ácido docosahexaenóico (Sagin y Sozmen, 2008; Rapoport, 2008). Por otro lado, varias patologías neurodegenerativas, como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la demencia senil (o de cuerpos de Lewy), se han relacionado con la acumulación patológica de agregados fibrilares de la proteína α-sinucleína, que dan lugar a una alteración importante en el metabolismo de los triglicéridos celulares (Coles et al., 2001). De hecho, el desarrollo de estas y otras enfermedades neurodegenerativas está relacionado con alteraciones de los niveles séricos o celulares de lípidos, como el colesterol, los triglicéridos, la esfmgomielina, la fosfatidiletanolamina, etc. Esto, de nuevo, sugiere que los lípidos tienen un papel crucial en el correcto funcionamiento de las neuronas, nervios, cerebro, cerebelo y médula espinal, lo cuál resulta lógico teniendo en cuenta la gran abundancia de lípidos en el sistema nervioso central. Las moléculas de la presente invención presentan un potencial alto o muy alto para revertir muchas de las alteraciones asociadas a procesos neurológicos, neurodegenerativos y neuropsiquiátricos.

Por otro lado, diferentes tipos de esclerosis y otros procesos neurodegenerativos se relacionan con la "desmielinización", cuyo resultado neto es la pérdida de lípidos en la cubierta de los axones neuronales, con las consiguientes alteraciones en el proceso de propagación de señales eléctricas que ello supone. La mielina es una capa lipídica que rodea los axones de muchas neuronas y que está formada por una sucesión de repliegues en espiral de la membrana plasmática de células de la glia (células de Schwann). Por todo ello, está claro que los lípidos juegan un papel importantísimo en el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas. Es más, se ha comprobado que los AGPI naturales no modificados tienen un moderado efecto preventivo sobre el desarrollo de procesos neurodegenerativos (Lañe y Farlow, 2005). De hecho, el lípido más importante del sistema nervioso central es el ácido docosahexaenoico, que es un AGPI natural y cuya abundancia está alterada en muchos procesos neuro degenerativo s .

Las enfermedades metabólicas forman un conjunto de patologías caracterizadas por la acumulación o el déficit de ciertas moléculas. Un ejemplo típico lo constituye la acumulación de glucosa, colesterol y/o de triglicéridos por encima de los niveles normales. El aumento en los niveles de glucosa, colesterol y/o triglicéridos, tanto a nivel sistémico (p.ej., aumento en los niveles plasmáticos) como a nivel celular (p.ej., en las membranas celulares) se asocia a alteraciones en la señalización celular que desembocan en disfunciones a varios niveles, y que se deben normalmente a errores en la actividad de ciertos enzimas o el control de dichas proteínas. Entre las metabolopatías más importantes se encuentran la hipercolesterolemia (elevados niveles de colesterol) y la hipertrigliceridemia (elevados niveles de triglicéridos). Estas enfermedades tienen tasas de incidencia, de morbilidad y mortalidad elevadas, por lo que su tratamiento es una necesidad de primer orden. Otras metabolopatías importantes son la diabetes y la resistencia a la insulina, caracterizada por problemas en el control de los niveles de glucosa. Estas metabolopatías están implicadas en la aparición de otros procesos patológicos, como el cáncer, la hipertensión, la obesidad, la arteriosclerosis, etc. Recientemente, se ha identificado otro proceso patológico con estrecha relación con las metabolopatías anteriormente descritas y que podría constituir per se una nueva metabolopatía, que es el síndrome metabólico. El papel protector de ciertos ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) sobre ciertas enfermedades ya ha sido descrito por diferentes investigadores. Por ejemplo, los AGPI ralentizan el desarrollo de cáncer y tienen efectos positivos contra el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, patologías neurodegenerativas, metabólicas, obesidad, inflamación, etc. (Trombetta et al., 2007; Jung et al., 2008; Florent et al., 2006). Estos estímulos indican el importante papel que tienen los lípidos (AGPI) tanto en la etiología de diferentes enfermedades como para el tratamiento de las mismas. Sin embargo, la actividad farmacológica de estos compuestos (AGPI) es muy limitada debido a su rápida metabolización y escaso tiempo de vida media en la sangre. Por lo tanto se antoja necesario el desarrollo de AGPI con una metabolización más lenta, consecuencia de la cual su presencia en la membrana celular se vea aumentada, en comparación a los AGPI hasta ahora utilizados, y que faciliten la interacción de proteínas periféricas de señalización celular. Las moléculas de esta invención son derivados sintéticos de AGPI y presentan una metabolización más lenta que éstos, teniendo un efecto terapéutico marcada y significativamente superior a ellos.

Dada la relación existente entre las alteraciones tanto estructurales como funcionales de los lípidos localizados en la membrana celular con el desencadenamiento de varias enfermedades de diversa tipología, pero unitariamente relacionadas por dicha etiología ligada a la alteración estructural y/o funcional de los lípidos de las membranas celulares, como por ejemplo: cáncer, enfermedades cardiovasculares, obesidad, procesos inflamatorios, enfermedades neurodegenerativas y metabólicas; la presente invención se focaliza en el uso de nuevos ácidos grasos poliinsaturados sintéticos capaces de solventar los problemas técnicos asociados a los ácidos grasos conocidos arriba mencionados y, por lo tanto, que se muestren útiles para tratar eficazmente dichas enfermedades.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Breve descripción de la invención

La presente invención se focaliza en 1,2-derivados de ácidos grasos poliinsaturados (en lo sucesivo: D-AGPI) para ser usados en el tratamiento de enfermedades cuya etiología común se relaciona con alteraciones estructurales y/o funcionales de los lípidos de la membrana celular, o de las proteínas que interaccionan con ellos, particularmente seleccionadas entre: cáncer, enfermedades vasculares, enfermedades neurodegenerativas y neurológicas, enfermedades metabólicas, enfermedades inflamatorias, obesidad y sobrepeso. Los D-AGPI tienen menor tasa de metabolización que los ácidos grasos poliinsaturados naturales (en lo sucesivo: AGPI), ya que la presencia de átomos diferentes del hidrógeno (H) en los carbonos 1 y/o 2 bloquea su degradación a través de la β-oxidación. Esto hace que se produzcan cambios importantes en la composición de la membrana, regulando la interacción de proteínas periféricas de señalización celular. Esto puede dar lugar, por ejemplo, a diferencias en el empaquetado de la superficie de la membrana, modulando el anclaje de proteínas periféricas que participan en la propagación de mensajes celulares. Así, los D-AGPI que constituyen el objeto de la presente invención tienen una actividad mucho mayor que los AGPI, mostrando efectos farmacológicos significativamente superiores para el tratamiento de las enfermedades indicadas.

Como se ha mencionado anteriormente, las enfermedades tratadas con los D-AGPI de la invención comparten etiología la cual se relaciona con alteraciones estructurales y/o funcionales (o de cualquier otro origen) de los lípidos de la membrana celular o de proteínas que interaccionan con ellos. A modo de ejemplo se exponen las siguientes enfermedades:

• El cáncer: cáncer hepático, cáncer de mama, leucemia, cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, etc.

• Enfermedades vasculares: arterieesclerosis, isquemias, aneurismas, ictus, cardiomiopatías, angiogénesis, hiperplasia cardiaca, hipertensión, infartos, anginas de pecho, accidente cerebrovascular, etc.

• Obesidad, sobrepeso, control del apetito y celulitis.

• Enfermedades metabólicas: hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia, diabetes, resistencia a insulina, etc. • Enfermedades neurodegenerativas, neurológicas y neuropsiquiátricas: enfermedad de Alzheimer, demencia vascular, síndrome de Zellweger, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, la esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis del hipocampo y otros tipos de epilepsia, la esclerosis focal, la adrenoleuco distrofia y otros tipos de leuco distrofia, la demencia vascular, la demencia senil, demencia de Lewy, atrofia múltiple sistémica, enfermedades priónicas, los dolores de cabeza incluida la migraña, traumatismo del sistema nervioso central, desórdenes del sueño, vértigo, dolor, accidentes cerebrovasculares, la depresión, la ansiedad, las adicciones, problemas de memoria, de aprendizaje o cognitivos y en general enfermedades que requieran la parada de neurodegeneración o la neuroregeneración inducida por los compuestos de la invención para su tratamiento.

• Enfermedades inflamatorias, que incluyen inflamación, procesos inflamatorios cardiovasculares, inflamación de naturaleza tumoral, inflamación de origen reumatoide, inflamación de origen infeccioso, inflamación respiratoria, inflamación aguda y crónica, hiperalgesia de naturaleza inflamatoria, edemas, procesos inflamatorios derivados de traumas o quemaduras, etc.

Los D-AGPI de la presente invención se caracterizan por la siguiente Fórmula (I):

COORi-CHR ₂ -(CH ₂ ) «-(CH=CH-CH ₂ ) ₆ -(CH ₂ ) _C -CH ₃ , (I) donde a, b y c pueden tener valores independientes entre 0 y 7, y Ri y R ₂ puede ser un ion, átomo o grupo de átomos cuyo peso molecular es igual o inferior a 200 Da de forma independiente.

En una realización preferida de la invención a, b y c pueden tener valores independientes entre 0 y 7, Ri es H y R ₂ es OH.

En otra realización preferida de la invención a, b y c pueden tener valores independientes entre 0 y 7, Ri es Na y R ₂ es OH.

En otra realización preferida de la invención a y c pueden tener valores independientes entre 0 y 7, b puede tener valores independientes entre 2 y 7, y Ri y R ₂ puede ser un ion, átomo o grupo de átomos cuyo peso molecular es igual o inferior a 200 Da de forma independiente.

La administración de los ácidos grasos de la invención puede llevarse a cabo por cualquier vía como, por ejemplo: vía enteral, vía oral, vía rectal, vía tópica, vía inhalatoria, vía inyección intravenosa, vía inyección intramuscular o vía inyección subcutánea. Además la administración puede realizarse bien según la fórmula arriba indicada o bien en cualquier tipo de derivado farmacéuticamente aceptable de la misma, como por ejemplo: esteres, éteres, alquilos, acilos, fosfatos, sulfates, etilos, metilos, propilos, sales, complejos, etc.

Además los ácidos grasos de la invención pueden administrarse de forma independiente o formulados en composiciones farmacéuticas o nutracéuticas donde se combinan entre sí y/o con excipientes como por ejemplo: ligantes, rellenos, desintegradores, lubricantes, recubridores, edulcorantes, saborizantes, colorantes, transportadores, etc. y combinaciones de los mismos. Asimismo, los ácidos grasos de la invención pueden formar parte de composiciones farmacéuticas o nutracéuticas, en combinación con otros principios activos.

A efectos de la presente invención se define el término "nutracéutico" como un compuesto que se ingiere de forma periódica durante la alimentación y que sirve para prevenir enfermedades, en este caso, cuya etiología está unida a alteraciones de los lípidos de la membrana celular. A los efectos de la presente invención se entiende por "cantidad terapéuticamente eficaz" aquella que revierte la enfermedad o la previene sin mostrar efectos secundarios adversos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Efecto de los compuestos de la Tabla 1 sobre el crecimiento de células tumorales. Se representa en el eje de ordenadas las células viables (% del control) en función del compuesto utilizado (eje de abscisas). Las células de cáncer de pulmón humano (A549) se cultivaron en medio RPMI-1640 con 10% de suero durante 48 horas en ausencia (control) o presencia de 250 μM de los compuestos de la invención. La gráfica representa el número de células viables (media y error estándar de la media de 3 experimentos). La línea punteada representa la eliminación total de células (0% de viabilidad).

Figura 2. Efecto de ciertos AGPI y D-AGPI de la presente invención sobre la proliferación de células vasculares AlO. Se representa en el eje de ordenadas las células (% del control) en función del ácido graso utilizado (eje de abscisas). Las células se incubaron en medio completo (control, C), medio incompleto sin suplemento (CSS) o de medio completo en presencia de AGPIs (182, 183 A, 183G, 204, 205 y 226) o de D-AGPIs (182Al, 183Al, 183A2, 204Al, 205Al y 226A1). La reducción de la proliferación, pero aún por encima de los valores de CSS, indica que estas moléculas tienen capacidad para regular la proliferación anormal de células cardiovasculares sin llegar a ser tóxicas.

Figura 3.

A. Proliferación de adipocitos en cultivo en ausencia (control, C) o presencia de diferentes AGPI y D-AGPI. Se representa en el eje de ordenadas las células (% del control) en función del ácido graso utilizado (eje de abscisas). Como control de no proliferación se empleó un medio deficiente en suero (medio con porcentaje de suero bajo, MSB).

B. En el eje de ordenadas se represente el peso corporal (% del control no tratado) y en el eje de abscisas los compuestos utilizados en el tratamiento de los animales de experimentación. En el eje de abscisas, de izquierda a derecha, se representa en primer lugar el tratamiento con vehículo (C) y posteriormente con varios de los compuestos de la invención. Las ratas SHR se trataron durante un mes con 200 mg/kg de cada uno de los 24 compuestos indicados en la figura. Cada grupo experimental constó de 6 animales y para cada serie se utilizó un grupo de animales tratados con vehículo (agua), y se compararon los resultados con el peso de animales que no habían recibido tratamiento alguno. Las letras A, B, C y P indican la combinación de radicales Ri y R ₂ atendiendo a la Tabla 3.

Figura 4.

A. Muerte de células Pl 9 en cultivo en ausencia de factores externos (control, C: 0% de muerte neuronal) y en presencia de NMDA (100% de muerte neuronal). Se representa en el eje de ordenadas las muerte neuronal (% del control) en función del ácido graso utilizado (eje de abscisas) La presencia de AGPI indujo reducciones modestas en la supervivencia de células Pl 9 en presencia de NMDA. Los D-AGPI indujeron reducciones importantes en los valores de supervivencia celular, llegando a superar reducciones en más del 200% en el caso de 226Al . Dado que el número de células en los cultivos de células tratadas es mayor que en células control, se puede afirmar que estos compuestos, además de prevenir la muerte neuronal inducida por NMDA (anti-neurodegenerativos), son agentes neuroregeneradores.

B. Efecto del D-AGPI 226Bl en la mejora de la realización del ejercicio en el laberinto radial en un modelo animal de Alzheimer. En el eje de ordenadas de la figura de la izquierda se muestra el tiempo empleado para completar el ejercicio y en el eje de ordenadas de la figura de la derecha el número total de errores cometidos en la realización del ejercicio programado (media±error estándar de la media) (tiempo de ejecución). En cada una de las dos figuras, de izquierda a derecha, se representa en el eje de abscisas los resultados en ratones sanos (control) (primera columna), ratones con Alzheimer inducido y tratados con agua como vehículo (segunda columna) o con el compuesto 226Bl (tercera columna). Los animales con Alzheimer tardaron más tiempo y cometieron más errores que los ratones sanos de forma estadísticamente significativa (*, P<0,05). En cambio, los ratones con Alzheimer que fueron tratados con el compuesto 226Bl no mostraron diferencias significativas con los animales sanos.

Figura 5.

A. En la parte superior se muestra un inmunoblot que evidencia la inhibición de la expresión de la proteína pro -inflamatoria COX-2, inducida previamente por lipopolisacárido bacteriano o LPS (C+; 100%), en macró fagos humanos derivados de monocitos U937 por diferentes D-AGPI de la presente invención. En la parte inferior se muestra la relación COX-2/COX-1 en % del control (eje de ordenadas) para los siguientes compuestos (ej e de abscisas): OOA (ácido 2-hidroxi-oleico); OLA (182A1), OALA (183A1), OGLA (183A2), OARA (204A1), OEPA (205 Al), ODHA (226A1). B. Se muestra la eficacia anti-inflamatoria de diferentes D-AGPI de la presente invención en un modelo animal de inflamación. Se muestra el efecto inhibitorio en los niveles séricos de TNFα (pg/ml) inducido por LPS en ratones (eje de ordenadas) para diferentes compuestos de la invención (eje de abscisas). La reducción de este factor está directamente relacionada con el efecto anti- inflamatorio de un medicamento. Los compuestos son los mismos que en el panel de la izquierda. Figura 6. Niveles de colesterol (A) y triglicéridos totales (B) en células 3T3-L1. Se representa en el eje de ordenadas el colesterol (A) o los triglicéridos (B) (% lípidos totales) en función del ácido graso utilizado (eje de abscisas). Los valores mostrados son media±error estándar de la media de colesterol y triglicéridos con respecto a los lípidos totales medidos en membranas celulares mediante métodos espectrofotométricos (colesterol) o cromatografía en capa fina seguida de cromatografía de gases (triglicéridos). Los gráficos muestran los valores cuantificados en células cultivadas en ausencia (Control) o presencia de los AGPI o D-AGPI listados arriba. Figura 7.

A. Relación entre la estructura de membrana y los efectos celulares inducidos por los D-AGPI. Se representa en el eje de ordenadas los efectos celulares (% de control) frente a la Temperatura de Transición Hn (eje de abscisas). Se determinó la media del efecto producido por cada uno de los D-AGPI (promedio del efecto de cada lípido en todos los modelos de enfermedad estudiados y en función del número de dobles enlaces) y se representó frente a la temperatura de transición. La reducción en la temperatura de transición Hn indica una mayor inducción de discontinuidades de membrana, lo que genera lugares de anclaje para proteínas periféricas en la membrana y da lugar a una mejor regulación de la señalización celular y, por lo tanto, una mayor eficacia para el control de ciertas enfermedades.

B. Relación entre la eficacia terapéutica de los AGPI (círculos vacíos) y D-AGPI (círculos rellenos). Cada punto corresponde al promedio del efecto observado para todas las enfermedades estudiadas (ordenadas: cambio respecto al control %) en función del número de dobles enlaces que presenta cada molécula (abscisas). En ambos casos las correlaciones fueron significativas (P<0,05). Se observó que el efecto terapéutico depende del número de dobles enlaces que tiene la molécula, que a su vez está relacionado con la capacidad de regular la estructura de membrana. En este sentido, la presencia de un radical en los carbonos 1 y 2, presente en los D-AGPI, pero no en los AGPI, es indispensable para potenciar el efecto terapéutico de estas moléculas. Estos resultados indican que los efectos de los lípidos recogidos en esta invención tienen una base común. Estas correlaciones (con valores de r ² de 0,77 y 0,9 para los D-AGPI y P<0,05 en ambos casos) indican claramente que la estructura de los lípidos utilizados es la base de su efecto y que el mismo se produce a través de la regulación de la estructura de membrana, originada por la relación estructura-función de cada lípido. De hecho, los trabajos de investigación en los que se relacionan las patologías humanas arriba descritas con alteraciones en los niveles de AGPI son numerosos y demuestran el importante papel de los lípidos en la fisiología celular.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El amplio espectro de aplicación terapéutica que ofrecen los D-AGPI de la presente invención permite asumir de forma generalizada que confieren a las membranas unas propiedades estructurales específicas que permiten la correcta actividad de los procesos llevados a cabo en y por dichas membranas. Dicho de otro modo, muchas de las alteraciones que dan lugar a enfermedades de diferente índole son producidas por variaciones significativas en los niveles de ciertos lípidos importantes para la funcionalidad celular y/o de proteínas que interaccionan con membranas y/o están relacionadas con la producción de lípidos. Estas alteraciones patológicas que pueden dar lugar a enfermedades de diferente índole, pueden ser prevenidas o revertidas por los ácidos grasos sintéticos descritos en la presente invención, que pueden ser eficazmente utilizados para el tratamiento o prevención de cualquier enfermedad cuya etiología esté relacionada bien con alteraciones de los niveles, de la composición, de la estructura, o de cualquier otro tipo de alteración, de los lípidos de las membranas biológicas o bien con una regulación alterada de la señalización celular consecuencia de dichas alteraciones en dichos lípidos presentes en las membranas biológicas. De forma adicional, los lípidos recogidos en esta invención también se pueden emplear como medicamentos cuando una enfermedad se produzca como resultado de otra alteración, siempre y cuando el resultado de la modulación de las propiedades y/o funciones de membrana sea capaz de revertir el proceso patológico. Para este estudio de los efectos terapéuticos de los ácidos grasos de la presente invención se emplearon líneas celulares en cultivo y modelos animales de diferentes enfermedades y se investigó la actividad de D-AGPI y AGPI para el tratamiento de diferentes patologías.

La estructura de las moléculas de la invención se muestra en la Tablas 1, 2 y 3. Atendiendo a la Fórmula I los compuestos de la invención presentan preferentemente las combinaciones de los valores de a, b y c mostrados en la Tabla 1.

Además, a lo largo de la invención se nombran los compuestos con un número de tres cifras seguido del símbolo Xl o X2. El número 1 denota a todos los D-AGPI empleados, excepto las series basadas en el C 18:3 ω-6 (ácido γ-linolénico), que aparecen con el número 2. Las dos primeras cifras de dicho número representan el número de carbonos de la molécula. La tercera cifra de dicho número representa el número de dobles enlaces. La letra X se sustituye por cualquiera de las letras de la A a la W (Tabla 3), dichas letras de la A a la W representando la combinación específica de los Ri y R ₂ de la Fórmula I.

Así, los compuestos particularmente preferidos de la presente invención se identifican bajo las abreviaturas: 182X1, 183X1 , 183X2, 204X1 , 205X1, 226X1 y deben interpretarse de acuerdo a las instrucciones del párrafo anterior.

Tabla 1

D-AGPI a b C

Serie 182X1 6 2 3

Serie 183X1 6 3 0

Serie 183X2 3 3 3

Serie 204X1 2 4 3

Serie 205X1 2 5 0

Serie 226X1 2 6 0

La Tabla 2 muestra las estructuras de alguno de los D-AGPI de la invención y AGPI de los que derivan. Como puede observarse dicha tabla ejemplifica algunos compuestos de la invención con diferentes combinaciones de valores de a, b y c y donde los radicales Ri y R ₂ vienen marcados por la letra A, lo que significa, según lo explicado anteriormente, que Ri es H y R ₂ es OH (ver la Tabla 3). Tabla 2

Nombre de la molécula Estructura Prop. Abrev.

Acido 2-hidroxi-9, 12- COOH-CHOH-(CH ₂ ) ₆ -(CH=CH-CH ₂ ) ₂ -(CH ₂ ),-CH, S, OH 182Al octadecadienoico

Ácido 2-hidroxi-9,12,15- COOH-CHOH-(CH ₂ ) ₆ -(CH=CH-CH ₂ ),-CH, S, OH 183Al octadecatrienoico

Ácido 2-hidroxi-6,9, 12- COOH-CHOH-(CH ₂ ),-(CH=CH-CH ₂ )v(CH ₂ )vCH, S, OH 183A2 octadecatrienoico

Ácido 2-hidroxi-5,8,l l,14- COOH-CHOH-(CH ₂ ) ₂ -(CH=CH-CH ₂ ) ₄ -(CH ₂ ),-CH, §, OH 204Al eicosatetraenoico

Ácido 2-hidroxi-5,8,l 1,14,17- COOH-CHOH-(CH ₂ ) ₂ -(CH=CH-CH ₂ ) ₅ -CH, S, OH 205Al eicosapentaenoico

Ácido 2-hidroxi- COOH-CHOH-CH ₂ -(CH=CH-CH ₂ ) ₆ -CH, S, OH 226Al

4,7,10,13,16,19- docosahexaenoico

Ácido 9,12-octadecadienoico COOH- (CH ₂ ) ₇ -(CH=CH-CH ₂ ) ₂ -(CH ₂ ),-CH, N 182

Acido 9,12,15- COOH-(CH ₂ ) ₇ -(CH=CH-CH ₂ ),-CH, N 183 A octadecatrienoico

Ácido 6,912-octadecatrienoico COOH-(CH ₂ ) ₄ -(CH=CH-CH ₂ )v(CH ₂ ) _v CH, N 183G

Ácido 5,8,11,14- COOH-(CH ₂ )v(CH=CH-CH ₂ ) ₄ -(CH ₂ ),-CH, N 204 eicosatetraenoico

Ácido 5,8,11,14,17- COOH-(CH ₂ ),-(CH=CH-CH ₂ ) ₅ -CH, N 205 eicosapentaenoico

Ácido 4,7, 10, 13, 16,19- COOH-(CH ₂ ) ₂ -(CH=CH-CH ₂ ) ₆ -CH, N 226 docosahexaenoico

Prop: Propiedades. S: sintético. N: natural. OH: hidroxilado en el carbono 2 (carbono α).

En la Tabla 3 se muestra las diferentes combinaciones de radicales Ri y R ₂ que pueden combinarse con los valores de a, b y c citados en la Tabla 1. Tabla 3

Ri H Na K CH ₃ O CH ₃ -CH ₂ O OPO(O-CH ₂ -CH ₃ 3)>2 R ₂

OH A B C D

OCH ₃ G H I

0-CH ₃ COOH J K CH ₃ M N Cl 0

CH ₂ OH P Q

OPO(O-CH ₂ -CH ₃ ) ₂ R NOH S

F T

HCOO U V N(OCH ₂ CH ₃ ) ₂ W

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Porcentaje de AGPI totales en membranas de células tratadas con AGPI y D-AGPI.

Los D-AGPI son moléculas sintéticas de carácter hidrofóbico, por lo que las células expuestas a ellos presentan altos niveles de estos ácidos grasos en su superficie.

La Tabla 4 muestra el porcentaje total de AGPI en membranas de células 3T3 tratadas con 100 μM de dichos ácidos grasos durante 48 horas. Para realizar estos experimentos, se extrajeron las membranas y se obtuvieron los ácidos grasos totales por hidrólisis en medio básico. Las bases metanólicas de dichos ácidos grasos se cuantificaron por cromatografía de gases. Los datos mostrados son medias de cuatro medidas independientes de la masa de AGPI dividida por la de ácidos grasos totales y expresada en forma de porcentaje. También se indica el error estándar de la media. En cultivos celulares, las células 3T3 incubadas en presencia de dichos ácidos grasos presentaron niveles mayores de AGPI (incluidos D-AGPI) y menores de ácidos grasos saturados.

El control corresponde a un cultivo sin la presencia de ácidos grasos naturales o sintéticos añadidos. Las células poseen de forma natural AGPI en sus membranas, pero la presencia en el medio de los D-AGPI de la invención hace que aumenten dichos niveles de AGPI en la membrana celular. Por lo tanto, estos resultados indican que las intervenciones nutracéuticas o farmacéuticas con los compuestos de la presente invención pueden regular de forma efectiva la composición de la membrana celular.

Tabla 4

Lípido añadido Porcentaje de AGPI totales

Ninguno (Control) 32,4±2,1

182Al 42,3±3,1

183Al 42,8±2,2

183A2 44,0±2,6

204Al 45,5±2,9

205Al 46,7±3,4

226Al 48,9±3,7

Ejemplo 2. Transición L (lamelar) - Hn (hexagonal) en membranas celulares de DEPE (dielaidoil fosfatidiletanolamina). Las Tablas 5 y 6 muestran la temperatura de transición lamelar-hexagonal (Hn) en membranas modelo de DEPE. La temperatura de transición se determinó mediante calorimetría diferencial de barrido. La proporción DEPE:D-AGPI fue 10:1 (mol:mol) en todos los casos. La transición lamelar-hexagonal es un importante parámetro que refleja propiedades relevantes a la señalización celular de membranas. La propensión a formar fases Hn, que es mayor a medida que baja la temperatura de dicha transición, indica que la presión superficial de membrana es menor, es decir, que las cabezas polares de los fosfolípidos forman una red menos tupida o compacta que las formadas por estructuras lamelares (Escriba et al, 2008). Cuando esto ocurre, ciertas proteínas periféricas de membrana (como las proteínas G, la proteína quinasa C o la proteína Ras) pueden unirse mejor a la membrana, mientras que otras se unen peor (p.ej., la proteína Ga), por lo que cambios en la temperatura de transición Hn son importantes en la regulación de funciones celulares relacionadas con el estado de salud y terapia humana (Escriba et al, 1995; Vógler et al, 2004; Escriba, 2006).

El control corresponde a membranas modelo en ausencia de ácidos grasos. La reducción en la temperatura de transición Hn conseguida mediante el empleo de los D- AGPI de la invención indica una mayor inducción de discontinuidades de membrana, lo que genera lugares de anclaje para proteínas periféricas en la membrana y da lugar a una mejor regulación de la señalización celular y, por lo tanto, una mayor eficacia para el control de ciertas enfermedades.

Así la Tabla 5 muestra la temperatura de transición T _H (lamelar a hexagonal Hn) en membranas de DEPE (4 mM) en presencia o ausencia 200 μM de diversos compuestos de la presente invención de la serie A. Tabla 5

Lípido añadido Temperatura de transición

Ninguno (Control) 64,5

182Al 51,8

183Al 51,6

183A2 50,1

204Al 49,3

205Al 47,9

226Al 44,4

La Tabla 6 muestra la temperatura de transición lamelar-hexagonal en membranas de DEPE en presencia de D-AGPI de varias series. Tabla 6

182 183-1 183-2 204 205 226

B 52,1 5~Ü9 5Ü) 50,2 48,3 45,1

D 51,0 51,1 49,4 48,7 47,5 43,9

E 50,6 49,8 49,3 48,4 46,7 42,9

G 51,0 50,3 50,1 49,6 47,3 44,1

O 51,7 51,2 51,3 49,7 48,6 44,2

R 52,2 51,8 49,9 50,0 48,4 44,7

Ejemplo 3. Unión de la proteína Gii (trímero) a la membrana celular modelo.

La regulación de la composición lipídica de la membrana dio lugar a cambios en la estructura de membrana, medida por calorimetría diferencial de barrido, que origina variaciones en la localización de proteínas G en membranas celulares modelo como se muestra en la Tabla 7. El resultado neto es una regulación de la señalización celular que da lugar a la reversión de diferentes procesos patológicos como se muestra más adelante. En esta Tabla 7 se muestra la unión de proteína Gii heterotrimérica a membranas modelo de fosfatidilcolina:fosfatidiletanolamina (6:4, mol:mol) medidas por ensayos de centrifugación, seguida de inmunoblot, visualización por quimioluminiscencia y cuantificación por análisis de imagen. Para estos experimentos se empleó 2 mM de fosfolípidos y 0,1 mM de los diferentes D-AGPI indicados en la Tabla 7. El control corresponde a una muestra de membranas modelo sin la presencia de ácidos grasos.

Estos resultados indican que la modificación que se induce en las propiedades estructurales y funcionales de la membrana aumenta a medida que aumenta el número de dobles instauraciones. Tanto la presencia de instauraciones como las modificaciones de los carbonos 1 y 2 disminuyen la tasa de metabolización de los AGPI. Este hecho, unido al efecto particular de estos lípidos sobre la estructura de membrana, indica que la acción sobre las células patológicas tiene una raíz común.

De hecho, se observó una buena correlación entre el efecto farmacológico y el efecto que los lípidos tienen sobre la estructura de membrana. Tabla 7

Lípido añadido Unión de proteína G

Ninguno (Control) 100±5

182Al 312±12

183Al 328±9

183A2 357±17

204Al 385±22

205Al 406±14

226Al 422±26

Ejemplo 4. Uso de 1,2-derivados de AGPI para el tratamiento de cáncer.

El cáncer es una patología que se caracteriza por la proliferación incontrolada de células transformadas. Como se ha indicado anteriormente, además de ciertas alteraciones génicas, el cáncer se caracteriza por la presencia de niveles alterados de lípidos de membranas que podrían influir en la señalización celular. En este sentido, los AGPI naturales mostraron una cierta eficacia frente al desarrollo de células humanas de cáncer (A549) a las concentraciones empleadas en este estudio, aunque su uso metabólico probablemente impidió que su efectividad fuera muy elevada (Figura 1). Sin embargo, los D-AGPI mostraron una eficacia marcada y significativamente superior a las moléculas no modificadas en los carbonos 1 y 2 (Figura 1 y Tabla 8) a las mismas concentraciones. Estos resultados indican que las modificaciones introducidas sobre ácidos grasos poliinsaturados naturales dan lugar a moléculas con una potencia antitumoral marcada y significativamente superior a la de los AGPI naturales, por lo que tienen una gran utilidad en el tratamiento y prevención de enfermedades tumorales a través de aproximaciones farmacéuticas y nutracéuticas en humanos y animales.

Para los experimentos mostrados en la Figura 1, se cultivaron células de adenocarcinoma pulmonar humano no microcítico (A549) en medio RPMI 1640, suplementado con 10% de suero fetal bovino y antibióticos, a 37 ⁰ C y con un 5% de CO ₂ . Las células se mantuvieron en cultivo durante 48 horas en presencia o ausencia de los AGPI y D-AGPI indicados en la Tabla 2, a una concentración de 250 μM. Al final del tratamiento, se realizó el recuento celular y el estudio de los mecanismos implicados en la actividad antitumoral de los compuestos a través de citometría de flujo. La Figura 1 muestra el porcentaje de supervivencia celular (siendo asignado el 100% a las células tumorales no tratadas). Estos valores corresponden a medias de 3 experimentos independientes.

En una serie independiente, se emplearon los compuestos listados en la Tabla 3 frente a diferentes tipos de tumores mostrados en las Tablas 8A, 8B y 8C. Estas tablas muestran la eficacia antitumoral de los compuestos de esta invención frente al crecimiento de células de cáncer de mama, cerebro (glioma) y pulmón. Los datos de eficacia se expresan como valores de IC50 (valores μM de concentración, que producen la muerte del 50% de las células tumorales) a 72 horas de incubación. El resto de condiciones experimentales son idénticas a las indicadas en el párrafo anterior.

Los resultados obtenidos indican claramente que todos los D-AGPI tienen una alta eficacia frente al desarrollo de tumores. En líneas generales, se puede observar que las series A y B de compuestos son las mejores, por lo que se probó la eficacia de estas series frente al desarrollo de leucemia y cáncer hepático (Tablas 9 y 10). Asimismo, también se puede afirmar que los compuestos de las series 204 y 226, es decir, los D- AGPI con número de instauraciones par de mayor número de tamaño, son las más eficaces. Estos resultados indican la existencia de una relación estructura-función en la actividad farmacológica de la presente invención, lo que también va a favor de un mecanismo de acción común relacionado con la estructura de cada compuesto y, por ello, de la unidad de invención en este apartado.

La Tabla 8A muestra la eficacia de los compuestos de la invención frente al crecimiento de células de cáncer de mama MD A-MB-231 , expresado en valores de IC50 micromo lares. Tabla 8A

Serie de molécula 182 183(1) 183(2) 204 205 226

Subserie

A 388 380 347 381 390 187

B 379 267 156 345 208 195

C 386 289 168 389 223 210

D 277 245 175 281 237 224

E 289 319 193 299 284 207

F 311 323 181 326 275 226

G 378 364 159 372 219 213

H 402 308 170 363 282 199

I 411 274 210 315 261 241

J 287 296 221 285 228 235

K 375 381 238 317 240 208

L 343 306 173 332 253 216

M 362 407 164 321 216 267

N 297 278 186 274 289 222

O 286 267 217 298 264 249

P 419 349 214 370 301 250

Q 328 312 205 306 247 263

R 371 305 172 285 245 204

S 388 291 189 293 270 211

T 391 290 216 317 233 199

U 410 344 228 369 272 227

V 442 326 241 352 298 215

W 391 311 203 311 256 246

La Tabla 8B muestra la eficacia de los compuestos de la invención frente al crecimiento de células de cáncer de cerebro (glioma) Ul 18, expresado en valores de IC50 micromolares. Tabla 8B

Serie de molécula 182 183(1) 183(2) 204 205 226

Subserie

A 197 397 372 197 400 214

B 198 202 377 396 391 196

C 208 n.d. 379 287 442 237

D 221 n.d. 385 311 467 241

E 213 n.d. n.d. 224 513 265

F 236 354 401 275 498 261

G 205 329 394 342 426 278

H 267 408 443 263 439 294

I 240 321 432 328 510 327

J 254 296 426 296 487 283

K 221 257 418 380 474 272

L 229 231 460 247 435 269

M 238 349 407 309 462 306

N 247 324 385 315 513 285

O n.d. 370 n.d. n.d. n.d. 277

P n.d. 285 389 291 432 290

Q n.d. 282 392 324 419 254

R 255 307 454 501 468 267

S 203 316 416 462 475 315

T 214 368 423 385 427 263

U 212 343 380 263 454 342

V 231 274 402 345 510 269

W 246 n.d. 438 287 443 318

La Tabla 8C muestra la eficacia de los compuestos de la invención frente al crecimiento de células de cáncer de pulmón A549, expresado en valores de IC50 micromo lares. Tabla 8C

Serie de molécula 182 183(1) 183(2) 204 205 226

Subserie

A 944 200 192 243 394 195

B 196 195 197 413 202 198

C 635 281 241 521 325 214

D 541 326 267 372 364 221

E 387 294 243 475 413 209

F 354 347 259 392 338 286

G 439 273 295 427 407 273

H 462 319 219 398 290 247

I 673 348 276 459 351 298

J 321 281 259 362 416 215

K 274 276 237 414 275 250

L 385 285 283 326 362 221

M 286 322 248 375 293 208

N 329 379 255 420 384 236

O 452 344 318 461 418 264

P 328 317 272 387 339 291

Q 293 273 314 348 365 252

R 317 258 274 364 417 219

S 458 341 246 439 293 265

T 379 367 279 352 322 243

U 255 294 287 270 426 270

V 340 320 291 326 325 298

W 416 352 212 341 420 302

La Tabla 9 muestra la eficacia de los compuestos de la invención frente al desarrollo de leucemia humana (células Jurkat). Valores de IC50 micromolares a 72 horas. Tabla 9

Serie de molécula

Subserie ^{182 183(} ^ ¹⁸³ ^ ^{204 205 226}

A 713 198 184 62 376 85 ^~

B 377 196 184 104 294 175

La Tabla 10 muestra la eficacia de los compuestos de la invención frente al desarrollo de cáncer hepático (células HepG2). Valores de IC50 micromolares a 72 horas.

Tabla 10

Compuesto 182 183(1) 183(2) 204 205 226

A 212 380 380 192 401 164

Todos estos resultados indican que los D-AGPI son útiles para la prevención y tratamiento de cáncer incluidos en composiciones nutracéuticas y farmacéuticas en humanos y animales. Asimismo, se observó que la potencia de acción de los D-AGPI correlaciona con el aumento del número de dobles enlaces y que la presencia modificaciones en los carbonos 1 y 2 es esencial para que la potencia antitumoral de los lípidos tenga relevancia a nivel terapéutico. Dado que estos compuestos tienen un efecto anti-tumoral frente a una gama variada de células tumorales, se puede afirmar que son moléculas con amplio espectro anti-tumoral y que pueden ser de aplicación general frente al desarrollo de cualquier tipo de cáncer.

Ejemplo 5. Uso de 1,2-derivados de AGPI para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

Para investigar la utilidad de los D-AGPI para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, se emplearon varias aproximaciones experimentales. En primer lugar, se investigó la eficacia de los compuestos de la invención en células de aorta en cultivo (línea celular A-10). Estas células se mantuvieron en cultivo con medio completo (C, suplementado con 10% de suero fetal bovino y PDGF) y medio incompleto (CSS, suplementado con 1% de suero fetal bovino sin PDGF). Los cultivos se realizaron de forma similar a como se describe en el apartado anterior, durante un período de 72 horas. Tras dicho período de incubación, se realizó el recuento de células mediante citometría de flujo.

En el medio incompleto (CSS, control sin suplemento de PDGF), las células tienen un comportamiento no proliferativo, similar al que se produce en un organismo sano. El comportamiento proliferativo que se produce en medio completo sería una situación similar a la que se produce en un organismo patológico. La presencia de D-AGPI produjo una reducción considerable de la proliferación de células normales de aorta A-IO en medio de cultivo completo, con agentes proliferativos presentes en el suero fetal incluido en el medio de cultivo. En presencia de agentes proliferativos (citoquinas, factores de crecimiento, etc.), los recuentos de células Al O fueron similares a los obtenidos medio incompleto (CSS) en los casos en los que en el medio de cultivo estaban presentes los D-AGPI de la presente invención (Figura 2). A diferencia de éstos, los AGPI mostraron una baja o nula eficacia antiproliferativa, lo que demuestra que las modificaciones introducidas sobre estos ácidos grasos aumentan sustancialmente su potencial farmacológico para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares, como la hipertensión, la arteriosclerosis, la isquemia, las cardiomiopatías, aneurismas, ictus, angiogénesis, hiperplasia cardiaca, infartos, anginas de pecho, accidente cerebrovascular etc.

Los efectos en esta línea celular no se pueden considerar tóxicos por dos motivos: (1) En medio completo, los D-AGPI no indujeron nunca reducciones en la proliferación celular por debajo de los niveles celulares de las células incubadas en medio incompleto; y (2) las células de aorta (AlO) tratadas con D-AGPI no mostraron signos moleculares o celulares de necrosis, apoptosis o cualquier otro tipo de muerte celular. Dado que la proliferación de células vasculares está implicada en el desarrollo de numerosas patologías cardiovasculares, los D-AGPI son útiles para la prevención y tratamiento de dichas enfermedades a través de aproximaciones nutracéuticas y farmacéuticas en humanos y animales.

En una serie independiente, se aislaron cardiomiocitos de rata y se cultivaron in vitro durante 24 horas, tras las cuales se determinaron una serie de parámetros. En primero lugar, se midió en número, la longitud y anchura de las células en cultivo. Se pudo observar que todos los compuestos de la serie A y B (182 a 226) eran capaces de aumentar el número de células en cultivo (entre un 12% y un 33%) y la longitud y anchura de las células (entre un 18% y un 42%). Además, inducen disminuciones en la liberación de lactato deshidrogenada (LDH) inducida por anoxia (reducciones entre el 9% y 68% para todos los compuestos de la serie A y B). Estos resultados indican que los D-AGPI de la presente invención tienen un efecto protector de las células cardiovasculares y que aumentan su elasticidad, lo que puede servir para prevenir y tratar enfermedades cardíacas y vasculares de diferente índole, como la hipertensión, la arteriosclerosis, la isquemia, las cardiomiopatías, aneurismas, ictus, angiogénesis, hiperplasia cardiaca, infartos, anginas de pecho, accidente cerebrovascular, fallos en la circulación, etc.

En una serie experimental independiente, se estudió el efecto de los D-AGPI de la presente invención sobre la presión arterial de ratas SHR. En estos animales, se midió la presión arterial, por un lado, y los niveles de Apolipoproteína A-I (apoA-I) por otro lado. Para estos experimentos se emplearon ratas espontáneamente hipertensas (SHR) que se trataron durante 30 días con vehículo (agua, control) o con los compuestos de la invención (200 mg/kg, día, p.o.). Al final de este período, se midió la presión arterial de los animales y los niveles séricos de apoA-I. Los resultados obtenidos muestran el efecto de los compuestos de la presente invención para reducir la presión arterial e inducir la expresión de apoA-I, lo que indica que son moléculas de utilidad en el tratamiento de hipertensión y de arteriosclerosis (Tabla 11). Para estos experimentos, se emplearon métodos de determinación de la presión arterial no invasivos (método cuff-tail) y de la expresión génica de apoA-I por (RT-PCR) descritos en la literatura científica (Teres et al, 2008). La utilidad de las moléculas de la presente invención para el tratamiento de patologías cardiovasculares viene reforzada por el efecto reductor de los niveles de colesterol y triglicéridos séricos que tienen estos compuestos (ver adelante).

La Tabla 11 muestra la presión arterial (mm Hg) y niveles de apoA-I (%) en ratas SHR. Se indica el valor de presión arterial en mmHg (número superior) y los niveles de apoA-I (en tanto por ciento). Los valores promedio de ratas SHR antes de los tratamientos fueron 214 mmHg y 100%, respectivamente. Tabla 11

Compuesto 182 183(1) 183(2) 204 205 226

A 204 201 189 205 193 194

146 134 311 131 346 324

B 201 197 182 202 187 186

178 151 285 144 264 333

F 198 203 191 199 195 202

192 146 279 163 319 357

L 207 205 194 197 198 200

131 125 268 188 376 296

N 187 208 194 201 189 199

159 189 296 174 293 348

P 202 201 187 203 194 193

184 178 347 153 337 382

V 207 199 198 198 191 195

166 152 282 161 315 324

Ejemplo 6. Uso de 1,2-derivados de AGPI para el tratamiento de obesidad. La Figura 3A muestra como los AGPI (tanto los naturales como los sintéticos) son capaces de inhibir la hiperplasia e hipertrofia de células adiposas. Para este estudio se empleó la línea celular de adipocitos 3T3-L1. Este efecto ya era conocido y había sido descrito con anterioridad para los AGPI naturales no modificados (HiIl et al., 1993). Sin embargo, los D-AGPI tienen una mayor potencia para inhibir la proliferación de células grasas (Figura 3A). Este efecto no es tóxico en ningún caso, ya que la inhibición del crecimiento de adipocitos no produjo reducciones de la proliferación celular por debajo de los niveles de células cultivadas en medio incompleto (con 1% de suero). Los medios y condiciones empleadas para el cultivo de estas células fueron similares a las descritas anteriormente. Estos resultados demuestran que los D-AGPI tienen una elevada potencia para inhibir el crecimiento de células grasas y, por ello, para la prevención y el tratamiento de la obesidad y otros procesos relacionados con la acumulación de adipocitos (por ejemplo celulitis) corporales o alteraciones del apetito a través de aproximaciones nutracéuticas o farmacéuticas en animales y humanos. El efecto, de nuevo, correlacionó con el número de dobles enlaces de las moléculas empleadas y con la presencia de modificaciones en los carbonos 1 y 2 en la molécula lipídica.

De forma adicional, se emplearon varios de los compuestos relativos a la presente invención para estudiar su efecto sobre el peso corporal de ratas (Figura 3B). En este sentido, ratas espontáneamente hipertensas (SHR) tratadas con los compuestos 182 a 226 (series A, B, N y P) mostraron reducciones en el peso corporal tras tratamientos de 1 mes con 200 mg/kg (reducciones del 3,2% al 6,9%) originadas en parte por una disminución de la ingesta y en parte por la inhibición de la proliferación de adipocitos (en animales no tratados alimentados con cantidad idéntica de pienso la bajada de peso no fue tan marcada como en los animales tratados). Estos resultados demuestran que estos compuestos pueden emplearse en el control del peso corporal (obesidad y sobrepeso), del apetito y de la grasa corporal (celulitis).

Ejemplo 7. Uso de 1,2-derivados de AGPI para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.

En estos estudios, se emplearon modelos diferentes de neurodegeneración. Por una parte, se estudiaron células P 19, cuya diferenciación neuronal se indujo con ácido trans-retinoico. Para ello, las células P19 se incubaron en medio esencial mínimo α (α-MEM), suplementado con 10% de suero fetal bovino, y 2 μM de ácido trans- retinoico, a 37 ⁰ C en presencia de 5% de CO ₂ . Las células se incubaron en presencia o ausencia de varios AGPI o D-AGPI a diferentes concentraciones durante 24 horas. El efecto neurotóxico se indujo con 1 mM de NMDA. Posteriormente, se contó el número de células mediante microscopia óptica en presencia de azul de tripan. Estos experimentos demostraron que los AGPI tienen un efecto protector sobre la degeneración neuronal, aunque el efecto mediado por los D-AGPI es mucho mayor (Figura 4A y Tabla 12). En esta figura y tabla queda claro que los D-AGPI de la presente invención protegen frente a la muerte neuronal, ya que se inhibe la muerte neuronal inducida por NMDA, por lo que estas sustancias pueden ser de utilidad para la prevención y tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis, el Parkinson, la leuco distrofia, etc. Además, se ha observado que el número de células en los cultivos tratados es superior a los cultivos en los que no se añadía un agente neurodegenerativo. En concreto, los valores de muerte celular negativos indican que el número de células P19 es mayor que en una situación control. Por ello, los D-AGPI de la presente invención se pueden utilizar para favorecer los procesos neuroregenerativos, como por ejemplo aquellos producidos por procesos traumáticos (accidentes) o por agente tóxicos.

La Tabla 12 muestra el efecto protector frente a la muerte neuronal en células P 19: inhibición de muerte neuronal (células P 19) con D-AGPI de la presente invención tras tratamiento con NMDA (100% muerte). Las células control, sin NMDA, mostraron un nivel de muerte celular de 0%. Todos los porcentajes inferiores a 100% indican protección frente a muerte neuronal. Los valores negativos indican que además que no sólo hay protección a la muerte neuronal si no que incluso hay proliferación neuronal. Por otro lado, los compuestos de la presente invención disminuyen los niveles de α- sinucleína (Tabla 13), una proteína que está relacionada con procesos neurodegenerativos, como el Parkinson, Alzheimer, demencia de Lewy, atrofia múltiple sistémica, enfermedades priónicas, etc. Por ello, las moléculas de la presente invención se pueden aplicar para la prevención y tratamiento de procesos neurodegenerativos, neuroregenerativos, neurológicos y neuropsiquiátricos.

Tabla 12

182 183-1 183-2 204 205 226 C

(NMDA)

A -60 -55 -70 -70 -50 -230 100

B -62 -58 -66 -71 -52 -222 100

F -45 -35 -36 -46 -44 -189 100

L -32 -21 -29 -27 -35 -117 100

V -17 -9 -18 -11 -27 -86 100

La Tabla 13 muestra la expresión de α-sinucleína en cultivos neuronales (células P 19). C (control) representa el % de α-sinucleína en células sin tratar (100%). Tabla 13

182 183-1 183-2 204 205 226 C

A 50 45 40 41 35 23 100

B 61 43 38 36 41 31

F 71 61 52 52 57 41

L 80 76 73 69 67 64

V 83 87 89 82 81 77

Para comprobar la eficacia de los compuestos de la presente invención para inducir la neuroregeneración o inhibir la neuro degeneración, se empleó un modelo animal de enfermedad de Alzheimer. En este modelo se produce una neurodegeneración, debido a que se expresan una serie de proteínas mutadas que dan lugar al deterioro cerebral (ratones Alzh). Como control de animal sano, se emplearon ratones B6. Ambos grupos de animales se trataron desde que tenían una edad de 3 meses durante un período de 3 meses con vehículo (agua) o con varios D-AGPI (20 mg/kg, diarios, p.o.). Para establecer si se han producido mejoras cognitivas tras el tratamiento, se monitorizó el comportamiento de los animales en el laberinto radial. Los animales se mantienen en régimen hipocalórico para que tengan apetito. En un laberinto radial de 8 brazos simétricos, se colocaron marcas visuales para favorecer la orientación del animal y se puso comida (pastilla de 15 mg) en cuatro de los brazos. Empleando una cámara acoplada a un sistema computerizado, se midió el tiempo que cada animal tardaba en realizar el ejercicio, así como el número de errores cometidos. En este sentido, animales con Alzheimer tienen unos valores aproximadamente un 50% superiores a los animales sanos, tanto por el tiempo que tardan en realizar el ejercicio como por el número de errores realizados (Figura 4B). Por el contrario, los ratones con Alzheimer tratados con 226Bl (Alzh+LP226) presentaban parámetros similares a los de animales controles y significativamente (P<0,05) inferiores a los animales tratados con vehículo (Alzh). En este sentido, también se probó la eficacia de los compuestos 183Bl, 205Al, 205Bl, 226Al, 226Vl, observándose mejoras en los animales con Alzheimer (tiempos de 98, 92, 93, 86 y 89 segundos, respectivamente). Por otro lado, es interesante que estos mismos compuestos (183Bl, 205Al, 205Bl, 226Al, 226Bl y 226V1 ) también produjeran reducciones en el tiempo de realización del experimento en animales control (ratones sanos B6) de 8 s, 11 s, 12 s, 18 s, 16 s y 14 s, respectivamente. Por ello, se puede concluir que estos compuestos tienen una importante actividad contra la neuro degeneración y neuroregeneración. Entre los procesos neurodegenerativos que podrían prevenirse y tratarse con los D-AGPI de la presente invención se encuentran la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, el síndrome de Zellweger, la esclerosis múltiple, la esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis del hipocampo y otros tipos de epilepsia, la esclerosis focal, la adrenoleucodistrofia y otros tipos de leucodistrofia, la demencia vascular, la demencia senil, demencia de Lewy, atrofia múltiple sistémica, enfermedades priónicas, etc. Por su parte, la actividad neuroregeneradora, evidenciada por el efecto tanto en ratones con Alzheimer como ratones B6 sanos, se puede aplicar al tratamiento de procesos en los que ha habido pérdida neuronal como consecuencia de un accidente, de una intervención quirúrgica, traumatismos de diversa índole o de determinadas toxinas. Asimismo, se pueden utilizar los D-AGPI de la presente invención para la prevención o tratamiento de diferentes problemas neurológicos y/o neuropsiquiátricos, como los dolores de cabeza incluida la migraña, traumatismo del sistema nervioso central, desórdenes del sueño, vértigo, dolor, accidentes cerebrovasculares, la depresión, la ansiedad, las adicciones, problemas de memoria, de aprendizaje o cognitivos como reforzar la memoria y la capacidad cognitiva de seres humanos.

Ejemplo 8. Uso de 1,2-derivados de AGPI para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

La ciclooxigenasa (COX) es un enzima que se puede unir a membranas, tomando ciertos lípidos de ella y catalizando su conversión en moléculas que pueden tener actividad inflamatoria. La unión de este enzima a lípidos de membrana se debe en parte a la estructura de los lípidos de membrana. La actividad aumentada de las isoformas 1 y 2 de COX se ha relacionado como parte de la etiopatología de un número de enfermedades inflamatorias al inhibir el metabolismo del ácido araquidónico y la producción de mediadores lipidíeos pro -inflamatorios. Los D-AGPI de la presente invención producen una serie de señales celulares que alteran el metabolismo del ácido araquidónico y como resultado inhiben la actividad y expresión de la COX en monocitos en cultivo (Tabla 14 y Figura 5). Asimismo, los D-AGPI de la presente invención inhibieron la producción de citocinas pro-inflamatorias (TNF-α) "in vivo" (Tabla 15 y Figura 5). Para ello se trataron ratones de la cepa C57BL6/J con los distintos derivados (200 mg/kg, p.o.) después de haber producido en ellos una reacción inflamatoria mediante la inyección intraperitoneal de 20 μg de lipopolisacárido bacteriano (LPS). Estos resultados claramente indican la eficacia de los D-AGPI de la presente invención para prevenir o revertir procesos y patologías inflamatorias.

La Tabla 14 muestra la expresión de COX-2 en monocitos en cultivo. Inhibición de la expresión de COX-2 en monocitos. Porcentajes de inhibición (comparado al control positivo en presencia de LPS; 100%) de la concentración de proteína COX-2 (expresión) por los distintos derivados de ácidos grasos.

Tabla 14

182 183-1 183-2 204 205 226 C (LPS)

A 24 20 23 17 31 23 100

B 39 33 29 28 39 37

F 56 46 36 41 47 49

L 67 65 48 47 53 69

V 81 79 68 43 76 85

La Tabla 15 muestra la producción de TNF-α (%) en ratones: porcentajes de TNF- α en suero, después de la inyección de LPS (20 μg) intraperitoneal en ratones C57BL6/J (100%).

Tabla 15

Estos resultados demuestran que las moléculas de la presente invención pueden ser de utilidad para la prevención o el tratamiento de enfermedades inflamatorias, que incluyen inflamación, procesos inflamatorios cardiovasculares, inflamación de naturaleza tumoral, inflamación de origen reumatoide, inflamación de origen infeccioso, inflamación respiratoria, inflamación aguda y crónica, hiperalgesia de naturaleza inflamatoria, edemas, procesos inflamatorios derivados de traumas o quemaduras, etc.

Ejemplo 9. Uso de 1,2-derivados de AGPI para el tratamiento de enfermedades metabólicas. Los lípidos son moléculas cruciales en correcto mantenimiento del metabolismo. Los tratamientos con ciertos AGPI produjeron reducciones modestas en los niveles de colesterol y triglicéridos en células 3T3-L1. Sin embargo, los tratamientos con D- AGPI dieron lugar a reducciones marcadas y significativas en los niveles de colesterol y triglicéridos en estas células. Para estos experimentos, se incubaron las células arriba indicadas en medio RPMI 1640 en presencia de 10% de suero fetal bovino, a 37 ⁰ C y con 5% CO ₂ , y en presencia o ausencia de 150 μM de diferentes AGPI o D-AGPI. Las células se incubaron durante 24 h y posteriormente se realizó la extracción de lípidos y se midieron los niveles de colesterol y triglicéridos siguiendo procedimientos descritos anteriormente (Folch et al, 1951). En una serie experimental independiente, se trataron ratas SHR con diversos compuestos de la presente invención (200 mg/kg diarios, 28 días, p.o.) y se midieron los niveles de colesterol, triglicéridos y glucosa en suero mediante métodos colorimétricos. Se pudo observar que estos compuestos inducen reducciones significativas y en muchos casos marcadas de los niveles de estos metabolitos (Tabla 16).

Los resultados mostrados en la Figura 6 y la Tabla 16 indican claramente que los D- AGPI pueden utilizarse como fármacos para el tratamiento o la prevención de metabolopatías, como la hipercolesterolemia, la hipertrigliceridemia, la diabetes y resistencia a insulina en humanos y animales, a través de aproximaciones farmacéuticas o nutracéuticas. La combinación de colesterol y triglicéridos altos, de glucosa elevada, junto a alteraciones cardiovasculares y/o del peso corporal da lugar al denominado síndrome metabólico, que está empezando a incrementar en las sociedades occidentales. Los compuestos de la presente invención tienen un gran potencial terapéutico para el tratamiento del síndrome metabólico.

La Tabla 16 muestra los niveles de colesterol, triglicéridos y glucosa en ratas SHR. Se indica el valor de colesterol (número de arriba), triglicéridos (numero central) y de glucosa (número de abajo) en suero de ratas SHR tratadas con las moléculas arriba indicadas (200 mg/kg diarios, p.o., 28 días). Los valores están expresados en tanto por ciento, y en las ratas no tratadas (controles) se consideraron siempre como 100%.

Tabla 16

Compuesto 182 183(1) 183(2) 204 205 226

A 78 76 79 72 69 64

91 81 78 77 74 71

84 87 82 85 82 79

B 89 75 77 71 58 59

72 66 76 69 65 62

87 84 86 89 87 81

F 92 78 84 76 71 67

88 71 87 81 83 78

89 76 85 84 82 86

L 89 82 83 83 79 71

93 77 79 82 78 74

94 85 92 91 85 87

N 92 72 89 82 80 75

93 69 85 81 73 72

90 84 92 82 86 83

V 94 75 84 84 85 81

93 70 92 81 79 84

93 79 88 87 84 89 Ejemplo 10. Bases estructurales de los efectos terapéuticos de los 1,2-derivados de AGPI.

Numerosos estudios han demostrado que la ingesta o tratamiento con lípidos da lugar a cambios en la composición lipídica de las membranas celulares. Por otro lado, dicha composición tiene un efecto directo sobre la estructura lipídica de la membrana, que a su vez regula la señalización celular y está relacionada con la aparición de numerosas enfermedades. La Figura 7 muestra la correlación existente entre los cambios que producen en la estructura de membrana los diferentes D-AGPI (medidos por la temperatura de transición Hn) y los efectos celulares observados en este estudio. Para ello, se determinó la media del efecto producido por cada uno de los D-AGPI (promedio de cada lípido para todas las enfermedades estudiadas en función del número de dobles enlaces) y se ha representado frente a la temperatura de transición. La reducción en la temperatura de transición Hn indica una mayor inducción de discontinuidades de membrana, lo que genera lugares de anclaje para proteínas periféricas en la membrana y da lugar a una mejor regulación de la señalización celular y, por lo tanto, una mayor eficacia para el control de ciertas enfermedades. De todas formas, el hecho de que en organismos complejos los fármacos puedan ser metabolizados y que ciertos mecanismos adicionales puedan operar en tipologías (subtipos) de algunas enfermedades, sugiere que alguna de las moléculas con menor número de dobles enlaces pueda tener mayor actividad farmacológica. Sin embargo, y en líneas generales, se ha observado que el efecto terapéutico depende del número de dobles enlaces que tiene la molécula, que a su vez está relacionado con la capacidad de regular la estructura de membrana. En este sentido, la presencia de radicales en los carbonos 1 y/o 2, que tienen los D-AGPI de la presente invención, pero no los AGPI, es indispensable para potenciar el efecto terapéutico de estas moléculas.

Estos resultados indican que los efectos de los lípidos recogidos en esta invención tienen una base común. Estas correlaciones (con valores de r ² de 0,77 y 0,9 para los D-AGPI y P<0,05 en ambos casos) indican claramente que la estructura de los lípidos utilizados es la base de su efecto y que el mismo se produce a través de la regulación de la estructura de membrana, originada por la relación estructura- función de cada lípido. Así, la presente invención se refiere en un primer aspecto a compuestos de Fórmula (I), o sus derivados farmacéuticamente aceptables donde a, b y c pueden tener valores independientemente entre 0 y 7 y Ri y R2 puede ser un ion, átomo o grupo de átomos cuyo peso molecular es igual o inferior a 200 Da de forma independiente, para ser usados en el tratamiento de enfermedades basadas en alteraciones estructurales y/o funcionales de los lípidos de la membrana celular seleccionadas entre: cáncer, enfermedades vasculares, inflamación, enfermedades metabólicas, obesidad y enfermedades neurodegenerativas y neurológicas.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere al uso de al menos un compuesto de Fórmula (I), o sus derivados farmacéuticamente aceptables, donde a, b y c pueden tener valores independientemente entre 0 y 7, y Ri y R2 puede ser un ion, átomo o grupo de átomos cuyo peso molecular es igual o inferior a 200 Da de forma independiente, para la elaboración de una composición farmacéutica y/o nutracéutica destinada al tratamiento de enfermedades basadas en alteraciones estructurales y/o funcionales de los lípidos de la membrana celular seleccionadas entre: cáncer, enfermedades vasculares, inflamación, enfermedades metabólicas, obesidad y enfermedades neurodegenerativas y neurológicas.

El último aspecto de la presente invención se refiere a un método para el tratamiento terapéutico de enfermedades en humanos y animales cuya etiología común está relacionada con alteraciones estructurales y/o funcionales de los lípidos localizados en la membrana celular seleccionadas entre: cáncer, enfermedades vasculares, inflamación, enfermedades metabólicas, obesidad y enfermedades neurodegenerativas y neurológicas; que comprende la administración al paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un compuesto de Fórmula (I), y/o de sus sales o derivados farmacéuticamente aceptables, donde a, b y c pueden tener valores independientes entre 0 y 7, y Ri y R2 puede ser un ion, átomo o grupo de átomos cuyo peso molecular es igual o inferior a 200 Da de forma independiente. REFERENCIAS

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