La presente invención se enmarca en el campo de la Biología Molecular, la Biología Celular, la Biotecnología y la Biomedicina. La presente invención se refiere al uso de inhibidores de EDG2 para el tratamiento de la artritis reumatoide, particularmente en aquellos pacientes que presentan niveles elevados de moléculas proinflamatorias a pesar de haber sido tratados con antiinflamatorios. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La Artritis Reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria crónica que afecta a las articulaciones periféricas y cursa con dolor, inflamación y, en muchos casos, incapacidad funcional, consecuencia de la destrucción progresiva del cartílago y hueso de las articulaciones afectas (Firestein GS; Nature 2003, 423:356-61 ; Huber LC et al. Rheumatology 2006, 45:669-675; Pope RM. Nature Rev Immunol 2002, 2:527-535).

La AR se caracteriza por la hiperplasia de los sinoviocitos residentes y por la infiltración de células inflamatorias del torrente circulatorio. Los sinoviocitos y las células inflamatorias secretan interleuquinas, quimioquinas, moléculas de adhesión y metaloproteasas que perpetúan la inflamación. La hiperplasia sinovial es un factor decisivo en la destrucción articular y hay evidencias que parecen indicar que el mecanismo responsable de dicha hiperplasia es la resistencia a la apoptosis de las células sinoviales. Estudios in vitro e in vivo han mostrado que solamente un pequeño porcentaje de células sinoviales sufren apoptosis dependiente del ligando de Fas, TNFa (del inglés "tumor necrosis factor a") y TRAIL (del inglés "TNF-related apoptosis-inducing ligand'), a pesar de expresar receptores de muerte celular (Baier A et al. Curr Opin Rheumatol 2003, 15:274- 279; Korb A et al. Apoptosis 2009, 14:447-454).

La apoptosis es un proceso muy regulado y fundamental en muchas situaciones fisiológicas. Se pueden distinguir dos vías principales, la vía extrínseca, mediante la activación de receptores de muerte, y la vía intrínseca o mitocondrial. En la vía extrínseca, la unión de FasL, TNFa y TRAIL a sus receptores lleva al reclutamiento de FADD (del inglés "Fas associated Death Domain") y pro-caspasa-8, los cuales forman el DISC (del inglés "Death-Inducing Signalling Comp/ex"), donde la caspasa-8 se activa. A su vez, la caspasa-8 activa la caspasa-3, que causa finalmente la fragmentación del ADN y la muerte celular. La vía mitocondrial se induce en situaciones de hipoxia, privación de factores de crecimiento y exposición a drogas citotóxicas, llevando a la liberación del citocromo c y a la activación de caspasa-9 mediada por Apaf-1 (del inglés "Apoptosis protease-activating factor-1") (Ashkenazi A. et al. Science 1998, 281 :1305-1308; Green DR et al. Science 2004, 305:626-629; Wajant H. Science 2002, 296:1635-1636).

En los últimos años se han desarrollado nuevos tratamientos biológicos basados en la inhibición de citoquinas inflamatorias como TNFa, interleuquina 1 (IL-1 ) e interleuquina 6 (IL-6), que han permitido prevenir en muchos casos la progresión de la enfermedad hacia la destrucción del cartílago y hueso. Sin embargo, alrededor de un 40% de los pacientes no responden a estas terapias y, en un porcentaje aún mayor, la respuesta es parcial (Chen YF et al. Health Technol Assess, 2006, 10(42): iii-iv, xi-xiii, 1-229.; Rubbert-Roth A et al. Arthritis Res Ther 2009, 1 1 Sup 1 :S1 ).

El receptor de ácido lisofosfatídico 1 (LPAi , LPAR1 , EDG2, Gpcr26,

GPR26, Mrec1 .3, red .3, vzg-1 , VZG1 ) es un receptor acoplado a proteínas G que en humanos está codificado por el gen LPAR1 o EDG2. Nochi y colaboradores (J. Immunology, 2008, 181 (7):511 1 -9) han descrito que el receptor de ácido lisofosfatídico 1 (LPAR1 o EDG2) se expresa en altos niveles en los sinoviocitos de pacientes con AR y que la unión del ácido lisofosfatídico (LPA) a este receptor activa la expresión de la ciclooxigenasa 2, una molécula implicada en la inflamación. Además, Zhao C y colaboradores (Mol Pharmacol, 2008; 73:587-600) han mostrado que la unión del LPA a este receptor también induce, en sinoviocitos de pacientes con AR, la secreción de otras citoquinas inflamatorias como IL-6 e IL-8. Mototani y colaboradores (Hum Mol Genet. 2008, 15; 17(12): 1790-7) han descrito que determinados polimorfismos en el gen EDG2 aumentan la probabilidad de padecer osteoartritis de rodilla. Ikegawa y Mototani (EP2153847A1 ) han descrito el uso de agentes inhibitorios de EDG2 para el tratamiento de una variedad de afecciones que cursan con destrucción del cartílago y el hueso, entre las que se menciona la artritis reumatoide. Estos autores describen el efecto antiinflamatorio de los agentes inhibitorios de EDG2 y proponen su uso para disminuir la inflamación en todos aquellos pacientes que sufran enfermedades del cartílago y el hueso. La mayor parte de los tratamientos de la AR, tanto farmacológicos como biológicos, están dirigidos a disminuir la inflamación, por lo que aquellos pacientes que no responden a tratamientos antiinflamatorios no disponen de ninguna solución. Por ello, se necesita un nuevo enfoque terapéutico para controlar la enfermedad en la totalidad de los pacientes con AR, incluidos aquellos que no responden a tratamientos antiinflamatorios.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al nuevo uso de inhibidores de EDG2 para el tratamiento de la artritis reumatoide (AR), particularmente en aquellos pacientes que presentan niveles elevados de moléculas proinflamatorias tras el tratamiento con antiinflamatorios, es decir, que no responden a dichos tratamientos.

Los autores de la presente invención han demostrado que la inhibición de EDG2 corrige la hiperplasia de los sinoviocitos en un ambiente inflamatorio, con TNFa elevado, el cual media la apoptosis de dichas células. Por tanto, los autores de la presente invención han demostrado que la inhibición de EDG2 es eficaz para mejorar la evolución clínica de la AR en un ambiente inflamatorio donde hay niveles elevados de moléculas inflamatorias y, más concretamente, donde hay niveles elevados de TNFa.

Además, los autores de la presente invención han observado que la inhibición de EDG2 no corrige la inflamación, y por tanto no disminuye los niveles de las moléculas inflamatorias.

Por tanto, la presente invención pretender aportar una solución al tratamiento de la AR de forma específica en aquellos pacientes que no responden a las terapias convencionales, conocidas en el estado de la técnica, y cumplen con los requisitos especificados a lo largo de la invención relacionados con los niveles de moléculas proinflamatorias, aportando con ello al campo de la técnica una herramienta muy útil en la solución de un problema todavía sin resolver. Así pues, el uso de los inhibidores de EDG2 en este tipo de pacientes supone una mejora de la calidad de vida de los mismos, aspecto que hasta la fecha ha permanecido desatendido.

En este sentido, la presente invención se refiere al uso de una composición farmacéutica (en adelante composición farmacéutica de la invención) que comprende al menos un inhibidor de una proteína cuya secuencia tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID NO: 1 para preparar un medicamento para el tratamiento de la AR. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende al menos un inhibidor de una proteína cuya secuencia tiene al menos un 97%, más preferiblemente un 98%, aún más preferiblemente un 99% de identidad con SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende al menos un inhibidor de una proteína cuya secuencia es SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos del receptor de ácido lisofosfatídico 1 o EDG2 de humano. Las secuencias de aminoácidos de EDG2 de chimpancé, vaca, perro, ratón, rata y gallo presentan una alta homología con la secuencia de humano, como muestra la tabla 1 .

Tabla 1 . % de identidad de secuencia para el gen y la proteína EDG2 de humanos con distintas especies.

El término "inhibidor" se refiere a una sustancia o molécula capaz de reducir o eliminar la actividad del receptor EDG2, bien bloqueando su función o bien reduciendo su presencia. Se han descrito numerosas moléculas inhibidoras de EDG2 hasta la fecha, tanto fármacos como anticuerpos bloqueantes de la vía de señalización del receptor, o como secuencias nucleotídicas que interfieren en la traducción del propio receptor a partir del ARN mensajero (ARNm) que lo codifica. Un experto en la materia sabe reconocer un inhibidor del receptor EDG2 por ejemplo, pero sin limitarse, empleando el ensayo descrito en McAllister et al. 2000. Molecular Pharmacology 58:407^112.

La expresión "% de identidad de secuencia" se refiere al porcentaje de aminoácidos de una secuencia candidata que es idéntico a los aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , después de alinear las secuencias para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. El % de identidad de secuencia se puede determinar por cualquiera de los procedimientos o algoritmos establecidos en la técnica, tales como ALIGN o BLAST. En el presente documento, el % de identidad de secuencia se calcula dividiendo el número de aminoácidos que son idénticos después de alinear SEQ ID NO: 1 y la secuencia candidata, entre el número total de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , y multiplicando el resultado por 100.

En una realización preferida, la composición farmacéutica de la invención se usa para el tratamiento de la AR de pacientes que presentan mayor cantidad de al menos una molécula proinflamatoria, respecto de un control, a pesar de haber sido tratados con al menos un agente antiinflamatorio. Preferiblemente, la molécula proinflamatoria es TNF. Aún más preferiblemente, es TNFa.

El término "cantidad", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere al valor absoluto o relativo que se obtiene al detectar y cuantificar una molécula proinflamatoria en una muestra aislada de un paciente de AR. Este dato se puede comparar con el obtenido para individuos sanos, que sirven de control.

Un agente antiinflamatorio puede ser cualquier molécula conocida que tenga un efecto antiinflamatorio. Se conocen múltiples agentes antiinflamatorios, entre los que se encuentran los AINES (antiinflamatorios no esteroides), corticoides, metotrexato, anti-TNF o anti-interleuquina 6 (anti-IL-6). Las dos últimas son terapias basadas en el bloqueo de TNF o de IL-6 mediante el uso de anticuerpos.

En la presente descripción, se entiende por moléculas proinflamatorias aquellas moléculas que participan en la inflamación, promoviendo dicho proceso. Existe una gran variedad de moléculas proinflamatorias, entre las que se encuentran la interleuquina 1 (IL-1 ), interleuquina 8 (IL-8), las prostaglandinas, el óxido nítrico, el interferón y y el TNF. Además, existen algunas enzimas proinflamatorias, como la fosfolipasa de tipo II o PLA ₂ , la ciclooxigenasa 2 (COX- 2) o la sintasa de óxido nítrico inducible (¡NOS), que activan la síntesis de factor activador de plaquetas, leucotrienos, prostanoides u óxido nítrico. Dentro de los mediadores inflamatorios implicados en la patogénesis de la AR se encuentran las quimioquinas. Estas moléculas son potentes quimioatrayentes de las células implicadas en la respuesta inflamatoria y se ha detectado la expresión de quimioquinas y de sus receptores en el líquido sinovial y en los sinoviocitos de pacientes con AR. El factor de necrosis tumoral o TNFa (del inglés "tumor necrosis factor alpha") es el primer miembro de la superfamilia de TNF, a la que pertenecen algunas citoquinas implicadas en la fase aguda del proceso inflamatorio. Los miembros de esta superfamilia tienen un origen filogenético común y la mayoría tienen también una función común: promueven la apoptosis y la activación del factor de transcripción NF-KB.

Los autores de la presente invención han estudiado los niveles de algunas moléculas proinflamatorias, como son la IL-6, la IL-8, la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1 o CCL2), la COX-2, la colagenasa 1 (MMP-1 ) y la estromelisina-1 (MMP-3).

La IL-6 es una glucoproteína segregada por los macrófagos, células T, células endoteliales y fibroblastos. Su liberación está inducida por la interleuquina 1 y se incrementa en respuesta a TNFa. Es una citoquina con actividad antiinflamatoria y proinflamatoria.

La IL-8 es una citoquina de la familia de las quimioquinas, de naturaleza proinflamatoria. Su síntesis se realiza en fibroblastos, células endoteliales, monocitos y macrófagos. Es un potente factor quimiotáctico de neutrófilos, regula la producción de proteínas de adhesión, la formación de lípidos bioactivos y amplifica la respuesta inflamatoria local.

MCP-1 induce a los monocitos a entrar en el tejido desde el torrente sanguíneo para convertirse en macrófagos tisulares.

COX-2 es responsable de la biosíntesis de prostanoides implicados en respuesta inflamatoria.

La MMP-1 y la MMP-3 son enzimas proteolíticas encargadas de la degradación de la matriz extracelular en la AR. MMP-3 desempeña un papel importante como mediadora de la respuesta inflamatoria en la articulación.

En una realización preferida, el uso de la invención comprende un aumento en la apoptosis de las células sinoviales. Preferiblemente, dicha apoptosis es mediada por TNFa. Cuando la apoptosis es mediada por TNFa, el ligando TNFa se une a su receptor y activa así la señalización celular que dirige hacia la muerte celular controlada.

En una realización preferida de la invención, el inhibidor es un ácido nucleico (en adelante llamado ácido nucleico de la invención). Preferiblemente, el ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica que codifica para un ARN de interferencia de una proteína cuya secuencia tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la secuencia nucleotídica que codifica para el ARN de interferencia tiene como secuencias diana SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y/o SEQ ID NO: 21 . En otra realización preferida de la invención, el inhibidor es un ARN de interferencia de una proteína cuya secuencia tiene al menos un 95% de identidad con SEQ ID NO: 1 . Preferiblemente, el inhibidor es un ARN de interferencia cuyas secuencias diana son SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y/o SEQ ID NO: 21 .

Un ARN de interferencia es una pequeña molécula de unos 20-25 nucleótidos de ARN de doble cadena que interfiere con la traducción de un ARNm y por tanto impide la producción de un péptido o proteína, provocando su deficiencia. En la presente memoria, siRNA (del inglés "small interfering RNA") se refiere a un ARN de interferencia.

Una secuencia diana de un ARN de interferencia o de un ADN que codifica para un ARN de interferencia es una secuencia del ARNm del gen cuya expresión se interfiere, donde se van a unir los ARN de interferencia para impedir la producción del péptido o proteína codificado por dicho ARNm.

En una realización preferida de la invención, el inhibidor es un vector que comprende el ácido nucleico de la invención. En una realización preferida de la invención, el ácido nucleico es un vector apropiado para la terapia génica. Un vector es una molécula de ácido nucleico usada para transferir material genético a una célula. Aparte de dicho material genético, un vector también puede contener diferentes elementos funcionales que incluyen elementos de control de la transcripción, como promotores u operadores, regiones o potenciadores de la unión a factores de transcripción, y elementos de control para iniciar y terminar la traducción. Los vectores incluyen, pero no se limitan a: plásmidos, cósmidos, virus, fagos, casetes de expresión recombinantes y transposones.

El término "terapia génica", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a la transferencia de un material genético de interés (ADN o ARN) a un huésped para tratar o prevenir una enfermedad o afección genética o adquirida. El material genético de interés codifica un producto (un polipéptido o proteína, un péptido o un ARN funcional) cuya producción in vivo se desea. Por ejemplo, el material genético de interés puede codificar un ARN de interferencia de valor terapéutico.

En otra realización preferida de la invención, el inhibidor es un antagonista de EDG2. Preferiblemente, el antagonista es ki 6425.

El término "antagonista", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a una sustancia que se une a un receptor impidiendo la unión del agonista de dicho receptor, sin provocar ningún efecto. En este caso, el antagonista impide la unión del ácido lisofosfatídico (LPA) a su receptor, EDG2.

En otra realización preferida de la invención, el inhibidor de EDG2 es un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo.

El término "anticuerpo", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión y fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con una proteína. Hay cinco isotipos o clases principales de inmunoglobulinas: inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina D (IgD), inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina A (IgA) e inmunoglobulina E (IgE).

En una realización preferida, el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración oral. En otra realización preferida, el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración parenteral. Preferiblemente, el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración intravenosa. Preferiblemente, el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración intraarticular. La administración oral es aquella que se realiza por la boca. La administración parenteral es aquella que se realiza a través de una inyección o infusión. Algunos ejemplos de administración parenteral son la inyección subcutánea, intravenosa, intraarticular o intramuscular.

En una realización preferida, la composición farmacéutica de la invención se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz. La expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una sustancia suficiente para lograr el propósito pretendido. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un inhibidor de EDG2 es una cantidad suficiente para reducir la activación de la señalización de dicho receptor, que puede ser extrapolada a partir de los datos obtenidos en ensayos in vitro como se describe en Gülden y Seibert, 2003. Toxicology, 189: 21 1 -222. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un inhibidor para tratar una enfermedad o trastorno es una cantidad del inhibidor suficiente para reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad o trastorno. La cantidad eficaz de una sustancia dada variará con factores tales como la naturaleza de la sustancia, la vía de administración, el tamaño y la especie del animal que va a recibir la sustancia y el propósito por el que se da la sustancia. La cantidad eficaz en cada caso individual la puede determinar empíricamente el experto en la materia de acuerdo con los procedimientos establecidos en la técnica.

En una realización preferida, el medicamento además comprende un excipiente farmacológicamente aceptable. El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción del inhibidor, lo estabiliza o ayuda a la preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El término "farmacológicamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia esta permitido y evaluado de modo que es seguro, no es tóxico y no causa efectos adversos a los organismos a los que se administra.

Otra realización preferida se refiere al uso de la composición farmacéutica donde el medicamento comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, el vehículo debe ser farmacológicamente aceptable. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensoactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los inhibidores de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación del inhibidor, así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. En una realización preferida, el medicamento además comprende otra sustancia activa. En una realización preferida, el medicamento se administra como terapia combinada. Una terapia combinada se refiere a que el medicamento se administra junto con otro medicamento. Preferiblemente, este otro medicamento es una sustancia inmunomoduladora, es decir, una sustancia capaz de alterar la respuesta del sistema inmune activándola, suprimiéndola o modificando algunos de sus mecanismos. Más preferiblemente, la sustancia inmunomoduladora es el anticuerpo anti-CD20 (Rituximab) o la proteína de fusión CTLA4-inmunoglobulina (Orencia, abatacept, belatacept).

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG 1. La deficiencia de EDG2 aumenta la apoptosis de los sinoviocitos en presencia de TNFa. Muestra la actividad de caspasa 3/7, que es significativamente mayor en los sinoviocitos deficientes en EDG2 y especialmente en presencia de TNFa (p=0, 00058, test de Wilcoxon). La caspasa 3/7 activada hidroliza el sustrato luminogénico DEVD-aminoluciferina y genera una señal luminiscente directamente proporcional a la actividad de caspasa 3/7, por lo que esta actividad está expresada en RLU (unidades relativas de luminiscencia).

FIG 2. Muestra el cambio en la expresión génica en 7 líneas de sinoviocitos con siRNA de EDG2 relativo a la expresión en las mismas líneas con siRNA inespecífico (control). La deficiencia de EDG2 incrementa la transcripción inducida por TNFa de IL-6, IL-8, MCP-1 , COX-2 y MMP-1 , y reduce la transcripción de MMP-3.

FIG 3. Muestra la cantidad de IL-6, IL-8 y MCP-1 en sobrenadantes de cultivo de cuatro líneas de sinoviocitos reumatoides transfectadas con siRNA EDG2 o con siRNA inespecífico control. La deficiencia de EDG2 incrementa la producción mediada por TNFa de estos mediadores inflamatorios. FIG 4. Muestra una disminución significativa del Score clínico de la artritis reumatoide en los ratones tratados con KM 6425 respecto a los ratones control, tratados con vehículo (p= 0,03, día 3; p=0,0068, día 6; p=0,0018, día 7; p=0,00072, día 8 y p=0,00072, día 9).

FIG 5. La supresión de EDG2 aumenta la expresión proteica de TRAIL (A), TRADD (B) y PYCARD (C) en sinoviocitos con AR. Sinoviocitos con AR transfectados con siRNA control o con siRNA para EDG2 fueron tratados con 10 ng/ml de TNF durante 12 h y se extrajeron las proteínas totales para análisis mediante western blot. Se muestra la cuantificación densitométrica de la intensidad de bandas normalizada con respecto a un control de actina, y los datos se expresan como media (SEM) de sinoviocitos procedentes de 6-8 pacientes con AR. Se muestran blots representativos. ^* indica p < 0,05 y ^*** indica p < 0,001 . FIG 6. TRAIL, TRADD y PYCARD son necesarios para el aumento de apoptosis inducido por TNF en sinoviocitos con AR deficientes en EDG2. Sinoviocitos con AR fueron o bien no transfectados (NT) o bien transfectados con: siRNA control, siRNA para EDG2, siRNA para EDG2-TRADD, siRNA para EDG2-TRAIL, o siRNA para EDG2-PYCARD. La apoptosis fue determinada por cuantificación de la liberación de nucleosomas tras 48 h con 10ng/ml de TNF. Las gráficas muestran la liberación de nucleosomas como número de veces respecto al control no transfectado. Los datos se expresan como la media (SEM) de sinoviocitos de 6-8 pacientes con AR. ^* indica p<0,05 y ^** indica p < 0,01 .

FIG 7. Muestra el aumento de la respuesta inflamatoria inducida por TNF en sinoviocitos con AR con EDG2 suprimido. Sinoviocitos con AR transfectados con siRNA control, siRNA para EDG2 o siRNA para EDG2-TRADD fueron estimulados con 10 ng/ml de TNF durante 12 h y la secreción de IL-6, IL-8 y MCP-1 fue analizada en el sobrenadante de cultivo (A) y la activación de las MAP kinasas fue analizada mediante western blot (B) . Los datos se expresan como la media ± SEM de 6-9 líneas de sinoviocitos distintas con AR. ^* y # indican p<0,05, test de Wilcoxon. Se muestra un blot representativo.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad del uso de inhibidores de EDG2 para el tratamiento de la artritis reumatoide (AR).

EJEMPLO 1 : Deficiencia de EDG2 en sinoviocitos de pacientes con AR in vitro.

Se transfectaron 7 líneas celulares de sinoviocitos tipo fibroblasto (FLS) con siRNA de EDG2 o con un siRNA control inespecífico. Se estimularon con 10 ng/ml de TNFa y se analizó la apoptosis tras 48 horas de tratamiento. Mediante PCR cuantitativa o en tiempo real se valoró la eficiencia de la supresión de EDG2, que fue superior al 90% en todas las líneas celulares transfectadas.

Se analizó la apoptosis de dichas células mediante la determinación de la actividad de caspasa 3/7 y la cuantificación de oligonucleosomas. Se observó un incremento significativo de la apoptosis inducida por TNFa en sinoviocitos deficientes en EDG2 comparados con los controles (Figura 1 , p=0, 00058, test de Wilcoxon). Resultados similares se obtuvieron en el análisis de liberación de nucleosomas.

Para analizar el efecto de la supresión de EDG2 sobre la respuesta inflamatoria inducida por TNFa en sinoviocitos reumatoides, se determinaron los niveles de ARN mensajero (ARNm) de IL-6, IL8/CXCL8, MCP-1/CCL2, COX-2, MMP-1 y MMP-3 (estromielisina 1 ) tras la estimulación con TNFa, mediante PCR cuantitativa en tiempo real.

Como se observa en la Figura 2, la supresión de EDG2 indujo un incremento de la transcripción inducida por TNFa de IL-6, IL-8, MCP-1 , COX-2 y MMP-1 . Sin embargo, se observó una reducción de la transcripción de MMP-3.

Se confirmó el resultado obtenido por PCR cuantitativa analizando por ELISA la producción de IL-6, IL-8 y MCP-1 en sobrenadantes de cultivo de cuatro líneas de sinoviocitos reumatoides transfectados con siRNA EDG2 o con siRNA inespecífico. Como se observa en la Figura 3, la supresión de EDG2 incrementó la producción mediada por TNFa de estos mediadores inflamatorios.

El conjunto de estos resultados indican que la sensibilización a la apoptosis mediada por TNFa tras la supresión de EDG2 en sinoviocitos reumatoides no se acompaña de una reducción de la respuesta inflamatoria mediada por TNFa.

Líneas celulares de FLS.

Este trabajo se llevó a cabo en 7 líneas primarias de FLS procedentes de pacientes con AR. En el laboratorio se aislaron sinoviocitos a partir de tejido sinovial de pacientes con AR sometidos a cirugía de reemplazamiento articular o a biopsia sinovial. Todos los pacientes cumplían los criterios del Colegio Americano de Reumatología (ACR) de 1987 para el diagnóstico de AR (Arnett FC y cois. 1988 Arthritis Rheum. 31 (3):315-24). Los sinoviocitos se utilizaron entre los pases 4 y 8 en todos los experimentos, se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS), 1 % penicilina-estreptomicina y 1 % L-glutamina a 37 C y 5% CO2 para su posterior uso.

Transfección con ARN de interferencia (siRNA) en sinoviocitos reumatoides.

Esta técnica fue utilizada para suprimir la expresión del Receptor de LPA asociado a proteínas G: EDG2 o LPA1 , en sinoviocitos de pacientes con AR. Se sembraron 8,5 x 10 ⁴ células/pocilio en pocilios de placas P6 en DMEM-10% FBS y se incubaron toda la noche a 37° C. Después se retiró el medio y se añadió DMEM 10% FBS sin antibiótico durante 6 horas. Transcurrido este tiempo, las células se transfectaron con 20 nM de siRNA de EDG2 o con siRNA control inespecífico (Dharmacon, Fisher Bioblock Scientific, Cedex, France) en 1 ,25 μg/ml del reactivo de transfección Dharmafect (Dharmacon), diluido en medio OPTI- MEM I (Gibco). Transcurridas 24 horas, se retiró el medio de transfección y se añadió DMEM-10% FBS. Se comprobó la eficiencia del silenciamiento para EDG2 mediante PCR en tiempo real y en todos los casos fue superior al 90%. Los experimentos se realizaron 48-96 horas posteriores a la transfección.

Tratamiento con TNF-α de sinoviocitos reumatoides con siRNA de EDG2 o con un siRNA inespecífico.

Los sinovioctos reumatoides se privaron de suero durante 16 horas en DMEM-1 % FBS. Una vez transcurrido este periodo de tiempo, se estimularon con TNF-α a una concentración de10 ng/ml. El tiempo de tratamiento fue puesto a punto en función del ensayo a realizar. Así pues, los ensayos de expresión y producción de las citoquinas IL-6 e IL-8, la quimioquina MCP-1 y las metaloproteasas MMP-3 y MMP1 , y la enzima COX-2 (del inglés "prostaglandin- endoperoxide synthase 2"), se realizaron a las 12 horas después de iniciado el tratamiento, y los ensayos de apoptosis se llevaron a cabo a las 48 horas de estimulación con TNF-α (Figura 2).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real

Mediante esta técnica se analizaron los niveles de expresión de ARNm de diferentes genes en sinoviocitos reumatoides humanos.

En primer lugar, se comprobó el nivel de silenciamiento para LPA1 en sinoviocitos tratados con el siRNA de EDG2 frente a la expresión basal en sinoviocitos control. Para ello, se extrajo el ARN total de los sinoviocitos, cultivados en pocilios de placas P6 (8,5 x 10 ⁴ células/pocilio), mediante el kit Rneasy Kit y el RNase-Free DNase Set (Qiagen GmbH), siguiendo las instrucciones del fabricante.

La PCR en tiempo real se realizó en un termociclador Mx3005P Real-Time

PCR System (Strategene, La Jolla, CA, USA) utilizando el kit Brilliant II SYBR Green Single Step QRT-PCR Master Mix (Stratagene). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen total de 25 μΙ conteniendo 2-5 ng de ARN; 0,5 μΜ de cada cebador; 1 ,5 mM de MgC^; 30 nM del colorante de referencia ROX; 0,04x de StrataScript RT/RNase block enzyme mixture y 1x de SYBR QRT-PCR master mix. Las muestras se analizaron por duplicado y los cebadores que se utilizaron se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Cebadores empleados para PCR en tiempo real y tamaño de los fragmentos amplificados.

Las condiciones de amplificación para EDG2 fueron las siguientes: Síntesis del ADN copia (ADNc) a 50° C durante 30 minutos; desnaturalización a 95° C durante 10 minutos seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95° C durante 30 segundos, hibridación a 63° C durante 1 minuto y elongación a 72° C durante 30 segundos. Finalmente, se realizó una curva de disociación de 55° C a 95° C incrementando 1° C cada segundo. Se utilizó β-actina como normalizador.

También se analizaron los niveles de ARNm de IL-6, IL-8, MCP-1 , COX-2, MMP-3 y MMP1 en cultivos de sinoviocitos de pacientes con AR tratados con el siRNA de EDG2 o con un siRNA inespecífico, sometidos al estímulo con TNF-a, mediante PCR en tiempo real en un solo paso.

Las condiciones de amplificación para IL-6, IL-8 y MCP-1 fueron: síntesis del ADNc a 50° C durante 30 minutos; desnaturalización a 95° C durante 10 minutos seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95° C durante 30 segundos e hibridación a 63° C durante 1 minuto. Finalmente, se realizó una curva de disociación de 55° a 95° C incrementando 1° C cada segundo.

Las condiciones de amplificación para COX-2 fueron las siguientes: síntesis del ADNc a 50° C durante 30 minutos; desnaturalización a 95° C durante 10 minutos seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95° C durante 30 segundos, hibridación a 60° C durante 1 minuto y elongación a 72° C durante 1 minuto. Finalmente, se realizó una curva de disociación de 55° a 95° C incrementando 1° C cada segundo.

Las condiciones de amplificación para MMP-3 fueron las siguientes: síntesis del ADNc a 50° C durante 30 minutos; desnaturalización a 95° C durante 10 minutos seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95° C durante 30 segundos, hibridación a 63° C durante 1 minuto y elongación a 72° C durante 1 minuto. Finalmente, se realizó una curva de disociación de 55° a 95° C incrementando 1° C cada segundo.

Las condiciones de amplificación para MMP-1 fueron las siguientes: síntesis del ADNc a 50° C durante 30 minutos; desnaturalización a 95° C durante 10 minutos seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95° C durante 30 segundos, hibridación y elongación a 57° C durante 1 minuto. Finalmente se realizó una curva de disociación de 55° a 95° C incrementando 1° C cada segundo.

Se utilizó β-actina como normalizador. La pureza de los productos amplificados se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa y determinación de la curva de disociación de cada muestra. El análisis de los resultados se realizó mediante el método comparativo Ct. 2 , en el que: ¿ _iCt = [Ctg _en — Ct _ac t¡ _na ] sinoviocitos transfectados con siRNA inespecífico " [Ctgen- Ct _ac t¡ _na ] sinoviocitos tramsfectados con siRNA EDG2-

Para los sinoviocitos transefctados con siRNA inespecífico AACt = 0 y 2 ^o =1 . Para las sinoviocitos transfectados con siRNA EDG2 el valor 2 ^" indica el incremento o la disminución en los niveles de expresión génica respecto a los transfectados con siRNA inespecífico.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

Mediante esta técnica se analizaron los niveles de expresión de las citoquinas IL-6, IL-8 y de la quimioquina MCP-1 presentes en el sobrenadante de cultivo de sinoviocitos de pacientes con AR tratados con siRNA de EDG2 o con un siRNA inespecífico. Se sembraron sinoviocitos reumatoides (10 ⁴ células/pocilio) en placas de 96 pocilios en DMEM-10% FBS y se privaron de suero durante 16 horas en DMEM-1 % FBS. Los sinoviocitos tratados con siRNA de EDG2 o con un siRNA inespecífico se estimularon con 10 ng/ml de TNF-α durante 12 horas, momento en el que se recogió el sobrenadante para su análisis posterior.

La determinación de citoquinas se llevó a cabo mediante los kit de ELISA para IL-6, IL-8 y MCP-1 (OptEIA ELISA Sets, BD Pharmingen), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Ensayos de apoptosis

El porcentaje de apoptosis de los sinoviocitos reumatoides se analizó mediante dos técnicas diferentes, ELISA de apoptosis y determinación de la actividad de caspasa 3/7 (FIG 1 ).

Después de suprimir la expresión de EDG2 en sinoviocitos reumatoides mediante siRNA, se sembraron 3x10 ³ células/pocilio en placas P96 en DMEM- 10% FBS y se privaron de suero durante 16 horas en DMEM-1 % FBS. Posteriormente, se retiró el medio y se estimularon con 1 μg/ml de TNF-α durante 48 horas en DMEM-1 % FBS.

El porcentaje de apoptosis se determinó mediante el Kit Cell Death Detection ELISA (Roche Diagnostics, Spain), que detecta los mono y oligonucleosomas liberados al citoplasma durante la apoptosis.

Para cuantificar la actividad de caspasa 3/7, se sembraron 10x10 ³ células/pocilio en placas P96 en DMEM-10% FBS y se privaron de suero durante 16 horas en DMEM-1 % FBS. Posteriormente, se retiró el medio y se estimularon con 1 μ9/ηιΙ de TNF-α durante 48 horas en DMEM-1 % FBS. La actividad de caspasa 3/7 en sinoviocitos tratados con el siRNA de EDG2 o con un siRNA inespecífico fue determinada mediante el kit Caspase-Glo ^R 3/7 Assay (Promega), que determina la presencia de caspasa 3/7 activada mediante el procesado de un sustrato luminogénico (DEVD-aminoluciferina). Para ello, se incubaron las células durante 1 h con el reactivo reconstituido del kit y la caspasa 3/7 activada de las células generó la señal luminiscente tras la hidrólisis del sustrato luminogénico DEVD-aminoluciferina. Dicha señal fue, por lo tanto, proporcional a la actividad de caspasa 3/7 y se midió en un lector de microplacas Fluostar OPTIMA (BMG Labtech, Offenburg, Germany).

EJEMPLO 2: Tratamiento de la AR in vivo con un antagonista de EDG2.

Se indujo artritis en un total de 41 ratones C57BL/6 de 8-10 semanas de edad mediante la inyección de 2 dosis de 100 μΙ de un suero procedente de ratones artríticos K/BxN a día 0 y día 2.

22 ratones fueron tratados con 4 dosis de 20 mg/kg del inhibidor KM 6425 en los días 0, 1 , 2 y 3 y 19 ratones fueron tratados con vehículo siguiendo la misma pauta terapéutica. Se analizó la evolución clínica de la artritis hasta el día 9.

La evolución clínica de la artritis (FIG 4) mostró una disminución significativa del Score clínico de la artritis en los ratones tratados con KM 6425 respecto a los controles tratados con vehículo (p= 0,03, día 3; p=0,0068, día 6; p=0,0018, día 7; p=0, 00072, día 8 y p=0, 00072, día 9), lo que indica una mejora en los resultados clínicos en los animales tratados con el antagonista de EDG2. Inducción de artritis pasiva en ratones y evaluación clínica de la artritis

Se indujo artritis en ratones C57BL/6 machos y hembras de 8-10 semanas de edad utilizando el modelo de artritis pasiva K BxN. Los ratones K/BxN se obtuvieron al cruzar ratones transgénicos KRN en fondo B6 con ratones NOD. Estos ratones transgénicos desarrollan artritis severa, que se inicia precozmente, a las 2-3 semanas de edad. La inyección de suero obtenido de ratones K/BxN de 4-8 semanas de edad en los ratones C57BL/6, provoca el desarrollo de una artritis con características similares a la AR humana.

Los ratones C57BL/6 se trataron con el inhibidor competitivo de los receptores EDG, KM 6425 (Cayman Chemicals, Ann Arbor, Michigan, USA), disuelto en DMSO/PBS (1 :3) o se inyectaron sólo con el vehículo: DMSO-PBS (1 :3). El compuesto KM 6425 (ácido3-[[[4-[4-[[[1 -(2-chorophenyl) ethoxy] carbonilo] amino] -3-methyl-5 isoxazoly] phenyl] metil] thio] -propanoico) es un potente inhibidor de los receptores EDG2/LPA1 (Ki=0,35 μΜ) y EDG-7/LPA3 (Ki=0,93 μΜ) y, en menor medida, inhibe el receptor EDG4/LPA2 (Ki=6,5 μΜ).

Se inyectaron un total de 22 ratones con Ki 16425 y 19 ratones con vehículo, en 5 experimentos diferentes. El esquema terapéutico fue el siguiente: se indujo artritis mediante inyección intraperitoneal de 100 μΙ de suero K/BxN en los días 0 y 2. Los ratones se trataron durante 4 días con KM 6425 a una dosis de 20 mg/kg ratón/día. La primera dosis fue administrada el día 0, 30 minutos antes de la inyección de suero K/BxN. La segunda dosis se administró el día 1 ; la tercera, el día 2, 30 minutos antes de la inyección de suero K/BxN y la última se administró el día 3. Los ratones control se inyectaron con DMSO/PBS (1 :3) siguiendo el mismo esquema terapéutico.

La evolución clínica de la artritis en las patas traseras y delanteras fue evaluada por dos observadores independientes los días 3, 6, 7, 8 y 9, siguiendo una escala semicuantitativa de 0 a 4: grado 0, sin inflamación; grado 1 , ligero edema y eritema en la articulación; grado 2, moderado edema y eritema; grado 3, severo edema y eritema; grado 4, máxima inflamación con rigidez da la articulación. Siguiendo esta escala, se obtiene el "Score clínico" o graduación clínica de la severidad de la artritis. El máximo valor posible de este "Score" para cada ratón es de 16 y corresponde a la suma de los valores máximos obtenidos en cada una de las 4 patas. Los ratones fueron sacrificados a día 9 para la extracción de las articulaciones.

EJEMPLO 3: Sobreexpresión de genes relacionados con apoptosis en sinoviocitos deficientes en EDG2.

Se analizó la expresión de 84 genes relacionados con la apoptosis empleando un array de PCR de apoptosis humano. Se analizaron sinoviocitos procedentes de 6 pacientes con AR tras 12 horas de estimulación con 10 ng/ml de TNF.

Array de PCR de apoptosis humano

La expresión relativa de 84 genes relacionados con la apoptosis fue analizada empleando el array de PCR de apoptosis humano (SABiosciences). Sinoviocitos de pacientes con AR (4x10 ⁵ células/pocilio) se cultivaron con 10 ng/ml de TNF durante 12 horas. El ARN total se aisló empleando el RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Holanda). Los ADNc fueron sometidos a transcripción inversa a partir de ^g de ARN empleando el ReactionReady First Strand cDNA Synthesis Kit (SABiosciences, Tebu-Bio, Boechout, Bélgica). Veinte μΙ de ADNc de cada muestra se mezclaron con RT ² real-time SYBR Green/Rox PCR Master Mix (SABiosciences) y se llevó a cabo la PCR en tiempo real con transcriptasa inversa (qRT-PCR). Los niveles relativos de expresión génica se normalizaron con respecto a 5 genes de referencia empleando el método comparativo de Ct. Los datos en bruto del array fueron procesados y analizados mediante el PCR Array Data Analysis System a través de la página de internet http://sabiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php con el umbral fijado en 2.0. Western blot

Los FLS con AR (8.5 10 ⁴ células/pocilio) fueron cultivados en placas de seis pocilios, tratados o no con 10 ng/ml de TNF-α durante 12 horas, lavados dos veces con PBS frío, y las proteínas extraídas empleando buffer de lisis (50 mM Tris HCI pH 7,5, 250 mM NaCI, 1 % Tritón X-100, 30 mM NaPO, 5 mM EDTA pH 8,0, 100 mM NaF, 1 mM Na ₃ V0 ₄ , 10 μg/ml aprotinina, 10 μg/ml leupeptina, y 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonil). Las concentraciones de proteína en los extractos se determinaron empleando el fluorímetro Qubit (Invitrogen, Prat de Llobregat, Barcelona, España) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Lisados de células completas (10-30μg de proteína) se fraccionaron mediante SDS-PAGE con sodio al 10%, fueron transferidas a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Hybond-P, Amersham Biosciences, Little Chalfont, Reino Unido) e incubadas con anticuerpos frente a P-p38, p38, P-ERK, ERK, β-actina (Sigma- Aldrich) P-JNK, JNK, PYCARD (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), TRAIL (Cell Signaling Technology, New England BioLabs) y TRADD (BD Pharmingen, San José, California, USA). El anticuerpo unido fue revelado con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (Santa Cruz) y el blot con ECL Plus Detection System (Amersham Biosciences, UK) o SuperSignal West Femto Máximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific Inc).

Un total de 17 genes mostraron sobreexpresión significativa en sinoviocitos

FLS transfectados con siRNA de EDG2 en comparación con sinoviocitos transfectados con siRNA control (se consideraron aquellos genes cuya expresión cambió en 2 o más veces la del control y con p<0,05). Entre los 17 genes que mostraron sobreexpresión en sinoviocitos procedentes de pacientes con AR carentes de EDG2, 9 fueron genes pro-apoptóticos (BCL2L11, CASP1, CASPIO, CASP3, CASP7, PYCARD, TNFRSF25, TNFSF10, TRADD), 4 genes anti- apoptóticos (BCL2, BIRC3, XIAP, CFLAR) y 4 fueron genes con función tanto pro- como anti-apoptótica dependiendo del estímulo y tejido analizado (CD40, RIPK2, TNF, CD70). Tres genes con función pro-apoptótica (TRAIL, TRADD y PYCARD; Tabla 3) fueron escogidos para experimentos confirmatorios dado el cambio significativo en su nivel de expresión (p<0,01 ) y dada su localización aguas abajo en la vía apoptótica. Su sobreexpresion fue confirmada por análisis por western blot en sinoviocitos de pacientes con AR. Como se muestra en la Figura 5, los niveles de proteínas TRAIL, TRADD y PYCARD son mayores cuando EGD2 es suprimido mediante siRNA que cuando no es suprimido (Figura 5; p< 0,001 , p<0.015, p<0.015, respectivamente, test de Wilcoxon).

Tabla 3: Los 3 genes pro-apoptóticos (PYCARD, TRAIL y TRADD) seleccionados para confirmación mediante análisis por western blot con sobreexpresion estadísticamente significativa, igual o superior a 2 veces la expresión observada en sinoviocitos transfectados con siRNA control.

EJEMPLO 4: La sensibilización a la apoptosis por supresión de EDG2 es dependiente de TRAIL, TRADD y PYCARD.

El papel de TRAIL, TRADD y PYCARD en la sensibilización a la apoptosis inducida por TNF en sinoviocitos procedentes de pacientes con AR sin EDG2, se estudió mediante la supresión de estos genes mediante siRNA. Sinoviocitos con AR fueron o bien no transfectados o bien transfectados con siRNA control, siRNA para EDG2 solo, o combinado con siRNAs para TRAIL, TRADD o PYCARD. La eficiencia de supresión fue verificada por western blot de las proteínas totales de los sinoviocitos.

La expresión de las proteínas TRAIL, TRADD y PYCARD fue suprimida en un 76,6 ± 0,06%, 95,2 ± 0,03% y 74,9 ± 0,09%, respectivamente. La apoptosis inducida por TNF fue analizada en sinoviocitos con AR en los cuales EDG2 y TRAIL, TRADD o PYCARD fueron suprimidos (Figura 6). La supresión de cualquiera de los tres genes pro-apoptóticos revirtió la sensibilidad a la apoptosis (p=0,03, p=0,03, p=0,008; para TRAIL, TRADD y PYCARD, respectivamente, test de Wilcoxon). Específicamente, la apoptosis mediada por TNF fue suprimida cuando la supresión de EDG2 se combinó con la de TRAIL o PYCARD, ya que, en ambos casos, el nivel de apoptosis fue similar al observado en sinoviocitos con AR no transfectados o transfectados con siRNA control. La supresión de TRADD llevó a una disminución en la apoptosis, pero aún así los niveles de apoptosis fueron significativamente mayores que en sinoviocitos con AR transfectados sólo con siRNA control (Figura 6).

Transfección de sinoviocitos de pacientes con AR con siRNA de TRAIL, TRADD y PYCARD.

siRNAs para Apo2L/TRAIL, TRADD y PYCARD/TMS1/ASC, así como siRNAs control se obtuvieron de Dharmacon (Fisher Bioblock Scientific, Strasbourg, FR). Los sinoviocitos con AR (8,5 x 10 ⁴ células/pocilio en placas de 6 pocilios) fueron transfectados transitoriamente con siRNA para TRAIL (50nM), siRNA para TRADD (100nM), siRNA para PYCARD (100 nM) o siRNA control en medio sérico reducido Opti-MEM I (Gibco) empleando 1 ,25 mg/ml DharmaFECT 1 (Dharmacon). La supresión fue determinada mediante Western blot o PCR cuantitativa en tiempo real. Los experimentos fueron llevados a cabo a las 72-112 horas tras la transfección.

EJEMPLO 5: La supresión de EDG2 aumenta la respuesta a TNF de sinoviocitos con AR.

Los efectos de la supresión de EDG2 en la respuesta a TNF de los sinoviocitos con AR se analizaron mediante la producción de mediadores inflamatorios y la activación de las tres MAPKinasas: p38, JNK y ERK, que se encuentran aguas abajo en la vía de señalización por TNF. Sinoviocitos con AR fueron estimulados con TNF, y la secreción de IL-6, IL-8 y MCP-1 fue determinada en el sobrenadante del cultivo mediante ELISA. Como se muestra en la Figura 7A, la supresión de EDG2 aumenta la producción inducida por TNF de los tres mediadores analizados. Esta mayor respuesta inflamatoria a TNF estuvo acompañada de un aumento de la activación de MAP Kinasa dado que la expresión de p38, pERK y pJNK fue significativamente mayor en sinoviocitos con AR deficientes en EDG2 en comparación con sinoviocitos transfectados con siRNA control (Figura 7B).

Dado que TRAIL, TRADD y PYCARD están también implicados en inflamación, se analizó el impacto de su supresión en el aumento de la respuesta inflamatoria a TNF observada en sinoviocitos con AR deficientes en EDG2. Como se muestra en la Figura 7A, la ausencia de TRADD en sinoviocitos sin EDG2 suprimió completamente el aumento en la respuesta inflamatoria a TNF. Sin embargo, la ausencia de TRAIL o PYCARD no modificó los niveles de producción de IL-6, IL-8 y MCP-1 en sinoviocitos deficientes en EDG2.

ELISA

Los sinoviocitos de pacientes con AR (1 χ 10 ⁴ células/pocilio) fueron estimulados con TNF-a (10 ng/ml, Sigma Aldrich) durante 12 horas. Los sobrenadantes se recogieron a las 12, 24, y 36 horas de tratamiento, y fueron analizados para IL6, IL8/CXCL8 y proteína quemoatrayente de monocito (MCP)- 1/CCL2 mediante ELISA como se ha descrito en el Ejemplo 1 .