Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Thiopeptoliden der Formel R- (Xaa) _n -Pro-X-Gly-S-Y-Z-Gly-(Xaa) _m -Ri (I) als ein Substrat zur Bestimmung der Aktivität von ADAM-TS Proteasen und ein Verfahren zum Auffinden eines ADAM-TS Protease Modulators, insbesondere eines Inhibitors.

Eine intakte Gelenkknorpelmatrix ist die entscheidende Voraussetzung für die Funktion aller Gelenke des tierischen und menschlichen Körpers. Schädigung des Gelenkknorpels führt zu arthritischen Krankheiten, wie Osteoarthrose (Osteoarthritis) und Rheuma, die durch Dysfunktion und schließlich Bewegungsunfähigkeit des betroffenen Tieres oder Menschen gekennzeichnet sind.

Zu den weiteren Krankheiten, die durch einen gestörten Matrixabbau gekennzeichnet sind, müssen auch die vielfältigen Formen der Krebserkrankungen gezählt werden, insbesondere die Metastasierung von Tumoren.

Es ist schon länger bekannt, dass Matrix MetalloProteasen (MMPs) am Abbau des Aggrecans und Collagens im Knorpel beteiligt sind. Hierzu zählt zum Beispiel die Gruppe der Matrixine, die alle bekannten MMPs von MMP-1 , 2 usw. bis MMP-16 umfasst. Eine weitere Gruppe, nämlich die Proteasen der ADAM-TS-Familie (Nagase, H. et al. (2003), Arthritis Research Therapy, 5, 94 - 103), spielt ebenfalls eine entscheidende Rolle beim Abbau von Gewebematrix, wodurch es zu einer Schädigung der Knorpelmatrix kommt. Die Aktivität dieser Proteasen, insbesondere ADAM-TS 1 , ADAM-TS 4 und ADAM-TS 5, die auch als .Aggrecanasen' bezeichnet werden, ist die Ursache für Krankheiten, die durch einen gestörten Matrixabbau gekennzeichnet sind, wie Osteoarthrose, Rheuma und Krebs. ADAM-TS kann insbesondere Proteoglycan, aber auch andere Matrixbestandteile, wie Hyaluronan oder Collagen, spalten. Weitere Wirkungen von ADAM-TS 1 , 4, 5 und 11 , aber auch ADAM-TS 13, sind entscheidend bei Entzündungsprozessen, Angiogenese, Zellmigration und Blutgerinnung, bzw. Blutcoagulation (Apte, S. S. (2004), The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 36, 981-985.

Es ist daher eine wichtige Aufgabe der Arzneimittelforschung, dass einerseits die enzymatische Aktivität der an den Krankheiten beteiligten Proteasen im gefährdeten oder bereits erkrankten Gewebe, z. B. Knorpelgewebe, oder Blut nachgewiesen werden kann. Andererseits ist es aber auch von besonderer Bedeutung, Arzneimittel zu entwickeln, die in der Lage sind, einzelne, mehrere oder alle relevanten Proteasen zu inhibieren.

Die enzymatische (proteolytische) Aktivität der beteiligten Proteasen kann in vitro gemessen werden, indem die betreffende Protease mit den entsprechenden hochmolekularen Matrixkomponenten, z.B. Proteoglycan oder Collagen, inkubiert wird und die Entstehung der Abbauprodukte gemessen wird.

Für die Isolierung und Quantifizierung der heterogenen Abbauprodukte, also z. B. Collagenbruchstücke und Proteinfragmente, stehen dem Fachmann verschiedene Verfahren zur Verfügung, die regelmäßig aufwändige Prozeduren, wie Antikörpererkennung von spezifischen Schnittstellen bzw. massenspektrometrische Untersuchungen erforderlich machen.

Es ist z. B. bereits beschrieben worden, dass zur Bestimmung der Aktivität von ADAM- TS 4 ein recombinantes Substrat verwendet werden kann, das wichtige

Strukturelemente der interglobulären Domäne des natürlichen Aggrecans enthält. Das recombinante Aggrecan vom Molekulargewicht 72 kDa wird in COS-Zellen exprimiert.

Die Bestimmung der Aggrecanaseaktivität erfordert neben dem Einsatz des hochmolekularen Aggrecan-Moleküls weitere aufwändige Schritte, wie Strukturelemente, die die Signalsequenz von CD5, das FLAG-epitop für die M1 monoclonale Antikörper-Bestimmung, die Hinge-Region des humanen IgGI , cDNA für das erwähnte recombinante Substrat, einschließlich deren Vectoren, wie dies im Detail in EP 0785 274 und auch in Hörber, Chr. et al. (2000) Matrix Biology, 19, 533-543 beschrieben ist.

Auch die Verwendung kürzerer Fragmente des Aggrecan-Moleküls ist bereits bekannt. In WO 00/05256 ist beschrieben worden, dass diese Peptidfragmente aus 20 bis 40

Aminosäurebausteine bestehen können. Allerdings ist es nicht möglich, Peptide, die weniger als 20 Aminosäuren enthalten, mit Aggrecanase umzusetzen, was besonders nachteilig ist. Dies konnte bestätigt werden (siehe experimenteller Teil).

Für die Bestimmung der Proteasen der Matrixin-Familie werden gemäß dem Stand der Technik zur Bestimmung der enzymatischen (proteolytischen) Aktivität niedermolekulare, synthetisch einfach zugängliche Moleküle als Substrate der Proteasen gespalten, wobei auf Grund der besonderen Beschaffenheit dieser Substrate durch die Spaltung z. B. ein optisches Signal in der Regel im sichtbaren oder ultravioletten Wellenlängenbereich freigesetzt wird, das quantifiziert werden kann.

Ein bekanntes Beispiel ist das von Knight, C. G. et al. (1992) FEBS, 296, 263-266 beschriebene (7-methoxycoumarin-4-yl)acetyl-Pro-Leu-Gly-Leu-3-(2' ₎ 4'-dinitro-phenyl)- L-2,3-diaminopropionyl-Ala-Arg-NH ₂ (Bachern, Heidelberg, Deutschland), das, durch bestimmte Matrixmetalloproteinasen gespalten wird, und dabei ein messbares fluorimetrisches Signal freisetzt, das zur Berechnung der Enzymaktivität herangezogen wird. So konnte bestätigt werden, dass es möglich ist, (7-methoxycoumarin-4-yl)acetyl- Pro-Leu-Gly-Leu-S^'^'-dinitrophenyO-L^.S-diamino-propionyl-A la-Arg-NHa mit den Proteasen MMP-3 und MMP-8 umzusetzen (siehe experimenteller Teil). Auch zahlreiche weitere derartige Substrate konnten von MMP-3 bzw. MMP-8 umgesetzt werden.

Es ist auch schon bekannt, dass gewisse Substrate aus der Stoffklasse der Thiopeptolide von Collagenase bzw. membranständigen Matrixmetalloproteinasen umgesetzt werden, vgl. EP 0149593 sowie US 2002/0142362. Ein auf 16 Aminosäuren N-terminal zur Aggrecanase-Schnittstelle verkürztes Peptid wird von Aggrecanase jedoch nicht mehr gespalten.

Auch in eigenen Experimenten konnte bestätigt werden, dass kürzerkettige Peptide, selbst wenn sie die Sequenz GIu-AIa enthielten, von ADAM-TS nicht gespalten werden konnten. Hingegen ist es bereits bekannt, dass die Mitglieder anderer Protease- Familien, z. B. die Matrixine oder die Cathepsine, Oligopeptide spalten können.

Die Verwendung von Oligopeptiden in derartigen Experimenten ist deshalb besonders erwünscht, weil sie einer chemischen Synthese leicht zugänglich sind. Ein weiterer Vorteil der Oligopeptide ist, dass einzelne Peptidbausteine chemisch verändert werden können, z. B. auch mit solchen chromophoren Gruppen verknüpft werden können, die es erlauben, die Spaltung des Peptides mittelbar oder unmittelbar spektrometrisch, z. B. kolorimetrisch zu verfolgen.

In entsprechender Weise kann auch die Wirkung von Enzyminhibitoren oder - aktivatoren leicht bestimmt werden, indem man die proteolytische Aktivität der betreffenden Protease nach Zusatz des Inhibitors mit der vor Zusatz des Inhibitors gemessenen Aktivität vergleicht.

Ein Beispiel hierfür sind die Thiopeptolide R-Pro-X-Gly-S-Y-Z-Gly-R1 (EP 0149593), die von Vertebraten-Collagenase gespalten werden, sowie Acetyl-prolyl-leucyl-glycyl- [2-mercapto4-methyl-pentanoyl]-leucyl-glycyl-ethylester (US 2002/0142362), das durch bestimmte Matrixine gespalten wird, wodurch sich eine freie SH-Gruppe bildet, die mittels bekannter Verfahren, z. B. Reaktion mit DTNB, quantifiziert werden kann.

Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, dass die Thiopeptolide R-(Xaa) _n -Pro-X-Gly-S- Y-Z-Gly-(Xaa) _m -Ri der Formel (I) durch ADAM-TS-Proteasen, insbesondere durch ADAM-TS1 , ADAM-TS4, ADAM-TS5, ADAM-TS11 und/oder ADAM-TS13, vor allem durch ADAM-TS1 , ADAM-TS4 oder ADAM-TS5 gespalten und so über die freie SH- Gruppe leicht nachgewiesen werden können. Dies ist umso überraschender, als der Stand der Technik beschreibt, dass Peptide, die weniger als 16 Aminosäure-Einheiten umfassen, von ADAM-TS nicht gespalten werden können.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft daher die Verwendung eines Thiopeptolids der Formel

FKXaaXrPro-X-Gly-S-Y-Z-Gly-CXaaVR., (I) ₁

wobei R = H oder eine N-Schutzgruppe, vorzugsweise eine Carboxylgruppe insbesondere von Ci-C ₅ -Alkylen, vor allem von Ci-C ₃ -Alkylen, besonders bevorzugt eine Acetylgruppe ist,

Xaa = eine beliebige, natürlich vorkommende Aminosäure, n, m = gleich oder verschieden eine ganze Zahl von 0-2415, vorzugsweise von 0-35, insbesondere von 0-14, vor allem von 0- 11 und ganz besonders bevorzugt gleich 0, X = Leu, He, Phe, VaI, GIn, AIa, Z = Leu, He, Phe, VaI, GIn, AIa, Ri = terminale Amid-, Carboxyl- oder Estergruppe, vorzugsweise von Cr

C ₅ -Alkylen, insbesondere von Ci-C- ₃ -Alkylen, vor allem ein Ethylester,

I

S-Y = R ₂ -CH-COO-,

wobei R ₂ = die Seitenkette einer natürlich vorkommenden

Aminosäure darstellt, insbesondere -CH ₂ CH(CHa) ₂ ,

-CH(CH ₃ )C ₂ H ₅ , -CH ₂ CeHs, -CH(CHs) ₂ , oder -CH ₃ ,

oder ein Salz davon, als ein Substrat für eine ADAM-TS Protease.

Als N-Schutzgruppen sind im allgemeinen alle gängigen Aminosäure-Schutzgruppen geeignet, wie z. B. Fmoc (9-Fluorenylmethyloxycarbonyl), Mtt (4-Methyltrityl), Pmc (2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl), tBu (t-Butyl), Boc (t-Butyloxycarbonyl), Tos (Tosyl), Mbzl (4-Methylbenzyl), Born (Benzyloxymethyl), 2-Chloro-Z (2- Chlorobenzyloxycarbonyl) oder For (Formyl), wie sie z. B. von Bachern Distribution Services GmbH, Weil am Rhein, erhalten werden können.

Besonders bevorzugt ist ein Thiopeptolid der Formel (I), bei dem

X = Leu oder AIa, Z = Leu, AIa oder Phe, und

R ₂ = -CH ₂ CH(CHa) ₂ .

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform entspricht (Xaa) _n und/oder (Xaa)m die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2, welche die Aminosäuresequenz für das humane Aggrecan darstellt. ,

Weitere bevorzugte Thiopeptolide weisen folgende Struktur auf:

Ac-Pro-Leu-Gly-S-Y-Leu-Gly-OC ₂ H ₅ , worin R ₂ = CH ₂ CH(CH ₃ ) _2| und Ac generell eine Acetylgruppe bedeutet

oder

Ac-Pro-Leu-Gly-S-Y-Phe-Gly-OC ₂ H _5> worin R ₂ = CH ₂ CH(CH ₃ ) ₂ ,

oder

Ac-PrO-AIa-GIy-S-Y-PrIe-GIy-OC ₂ H ₅ , worin R ₂ = CH ₂ CH(CH ₃ )2,

oder

Ac-PrO-AIa-GIy-S-Y-AIa-GIy-OC ₂ H ₅ , worin R ₂ = CH ₂ CH(CH ₃ ) ₂ .

Gemäß der vorliegenden Erfindung eignen sich alle bekannten ADAM-TS Proteasen wie die ADAM-TS Protease 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19 und/oder 20. Bevorzugt sind die ADAM-TS Proteasen 1 , 4, 5, 11 und/oder 13, insbesondere die ADAM-TS Protease 1 , ADAM-TS Protease 4 oder ADAM-TS Protease 5.

Die erfindungsgemäße Verwendung eignet sich insbesondere zur Bestimmung der Aktivität einer ADAM-TS Protease, zur Reinigung einer ADAM-TS Protease, zum funktionellen Klonieren einer Nukleotidsequenz kodierend für eine ADAM-TS Protease, zum Auffinden eines ADAM-TS Protease Modulators, insbesondere eines ADAM-TS

Proteaseinhibitors, oder zur Beobachtung des Einsetzens oder des Verlaufs einer Krankheit, die mit einer beschädigten Gewebematrix einhergeht, insbesondere

Osteoarthritis, Rheuma, Krebs, Entzündungen, Angiogenese, Zellmigration,

Blutgerinnung und/oder Blutkoagulation, vor allem Osteoarthritis, Rheuma oder Krebs.

Letztendlich wird bei allen diesen Methoden, z. B. während der enzymatischen

Reinigung einer ADAM-TS Protease oder nach Klonierung eines Gens kodierend für eine ADAM-TS Protease in einen allgemein bekannten Expressionsvektor, die Aktivität der ADAM-TS Protease mit Hilfe der beschriebenen Thiopeptolide gemessen.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität einer ADAM-TS Protease, wobei das Verfahren folgende Schritte enthält: (a) Inkubieren einer ADAM-TS Protease mit einem Thiopeptolidsubstrat gemäß Formel

I bzw. wie oben näher beschrieben, und (b) Durchführen einer Aktivitätsmessung oder- bestimmung der ADAM-TS Protease.

Als bevorzugte ADAM-TS Proteasen eignen sich die ADAM-TS Proteasen, die oben bereits näher beschrieben wurden. Die Durchführung der Aktivitätsmessung oder - bestimmung erfolgt vorzugsweise spektrophotometrisch.

Bei der spektrophotometrischen Bestimmung wird in der Regel ein Nachweisreagens, hier für Thiolgruppen eingesetzt. Als vorteilhaft haben sich hierbei 4,4'-Dithiodipyridin oder insbesondere 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB), das auch als Ellmanns Reagenz bekannt ist, erwiesen. Es können jedoch auch beliebig andere, geeignete Thiol-reaktive Reagenzien eingesetzt werden, wie ein Jodacetamid, z. B. 5- Jodacetamidofluorescein (5-IAF), ein Maleimid, z. B. Fluorescein-5-maleimid, oder andere Thiol-reaktive Reagenzien wie N,N'-Didansyl-L-Cystin oder 5- (Brommethyl)fluorescein. Erhältlich sind derartige Reagenzien beispielsweise von Invitrogen GmbH, Karlsruhe.

Mit Hilfe der genannten Thiopeptolide können in einem geeigneten Testsystem besonders einfach Modulatoren der ADAM-TS Protease aufgefunden werden. Als Modulatoren gemäß der vorliegenden Erfindung werden insbesondere Aktivatoren der ADAM-TS Protease und vor allem Inhibitoren der ADAM-TS Protease verstanden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung bezieht sich daher auf ein Verfahren zum Auffinden eines ADAM-TS Proteasemodulators, insbesondere eines ADAM-TS Proteaseinhibitors, bei dem das Verfahren folgende Schritte enthält:

(a) Inkubieren einer ADAM-TS Protease mit einem Thiopeptolidsubstrat gemäß Formel I bzw. wie oben näher beschrieben in Anwesenheit einer Testverbindung und

(b) Messen oder Bestimmen des Einflusses der Testverbindung auf die Aktivität der ADAM-TS Protease.

Als bevorzugte ADAM-TS Proteasen eignen sich die ADAM-TS Proteasen, die oben bereits näher beschrieben wurden. Die Durchführung der Aktivitätsmessung oder - bestimmung erfolgt vorzugsweise spektrophotometrisch, wie oben bereits näher beschrieben. Als Nachweisreagenz für Thiolgruppen eigenen sich wiederum die oben beschriebenen Verbindungen, besonders 4,4'-Dithiodipyridin oder 5,5'-Dithiobis(2- nitrobenzoesäure) (DTNB).

Die Testverbindung kann jede denkbare chemische, biochemisch, natürlich vorkommende oder synthetische, hoch- oder niedermolekulare Verbindung sein.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Testverbindungen in Form einer chemischen Verbindungsbibliothek zur Verfügung gestellt wird, aus der dann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens die gewünschte Verbindung, z. B. ein Inhibitor der getesteten ADAM-TS Protease, aufgefunden werden kann.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren auf einem Array durchgeführt, welcher das Auffinden und Isolieren der gewünschten Verbindung besonders erleichtert. Der Einsatz eines Roboters für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens führt ebenso zu einer weiteren Erleichterung und zu einer Erhöhung des Durchsatzes und ist daher besonders vorteilhaft. Mit Hilfe der Mikrofluidtechnik ggf. in Verbindung mit miniaturisierten Plattenvertiefungen („wells") gelingt auch eine Verkleinerung und weitere Automatisierung des Testsystems, was wiederum besonders vorteilhaft ist. Im allgemeinen wird das Verfahren in einem Hochdurchsatzscreening nach einem ADAM-TS Proteasemodulator, insbesondere einem ADAM-TS Proteaseinhibitors eingesetzt.

Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, der auf dem erfindungsgemäßen Verfahren beruht, betrifft die Herstellung eines Medikamentes, das folgende Schritte enthält: (a) Durchführen des oben genannten Verfahrens zum Auffinden eines ADAM-TS Modulators, insbesondere eines Inhibitors,

(b) Isolieren einer gemäß Schritt (a) aufgefundenen geeigneten Testsubstanz und

(c) Formulieren der gemäß Schritt (b) isolierten Testsubstanz mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern oder Hilfssubstanzen.

Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgefundenen pharmazeutisch wirksamen Verbindungen, vorzugsweise Inhibitoren, eignen sich vor allem zur Behandlung einer Krankheit, die mit einer beschädigten Gewebematrix einhergeht, insbesondere Osteoarthritis, Rheuma, Krebs, Entzündungen, Angiogenese, Zellmigration, Blutgerinnung und/oder Blutkoagulation, vor allem Osteoarthritis, Rheuma oder Krebs.

Als pharmazeutisch akzeptabler Träger oder Hilfssubstanz eignen sich alle bekannten Mittel, die zur Formulierung von Arzneimitteln üblicherweise eingesetzt werden.

Beispiele sind eine Natriumchloridlösung, insbesondere eine isotonische Salzlösung (0,9%ige Natriumchloridlösung), demineralisiertes Wasser, Stabilisatoren wie Protease- oder Nukleaseinhibitoren, vorzugsweise Aprotinin, ε-Aminokapronsäure oder Pepstatin A, oder Maskierungsagentien wie EDTA, Gelformulierungen wie weißes Vaselin, niederviskoses Paraffin und/oder gelbes Wachs, abhängig von der Art der Verabreichung.

Weitere geeignete Additive sind beispielsweise Detergentien wie Triton X-100 oder

Natriumdeoxycholat aber auch Polyole wie Polyethylenglycol oder Glycerin, Zucker

-wie Sukrose oder Glukose, zwitterionische Verbindungen wie Aminosäuren, z. B.

Glycin oder insbesondere Taurin oder Betain und/oder ein Protein wie Rinderserumalbumin oder humanes Serumalbumin. Detergentien, Polyole und/oder zwitterionische Verbindungen sind besonders bevorzugt.

Die physiologische Pufferlösung hat vorzugsweise einen pH von ungefähr 6.0-8.0, insbesondere einen pH von ungefähr 6.8-7.8, vor allem einen pH von ungefähr 7.4 und/oder eine Osmolarität von ungefähr 200-400 Milliosmol/Liter, vorzugsweise ungefähr 290-310 Milliosmol/Liter. Der pH-Wert des Medikamentes wird im allgemeinen mit Hilfe geeigneter organischer oder anorganischer Puffer eingestellt, z. B. vorzugsweise mit Hilfe von Phosphatpuffer, Tris-Puffer (Tris(hydroxy- methyl)aminomethan), HEPES-Puffer ([4-(2-Hydroxyethyl)piperazino]ethansulphon- säure) oder MOPS-Puffer (3-Morpholino-1-propansulphonsäure). Die Wahl des entsprechenden Puffers hängt im allgemeinen von der gewünschten Puffermolarität ab. Phosphatpuffer ist z. B. für Injektions- und Infusionslösungen geeignet.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, der auf dem erfindungsgemäßen Thiopeptolidsubstrat gemäß Formel I bzw. wie oben näher beschrieben und einer ADAM-TS Protease wie oben beschrieben beruht und gegebenenfalls einen oder mehrere Puffer, z. B. TNCB-Puffer (siehe Beispiel), enthält.

Der Puffer dient als Stabilisierungs- oder Reaktionsmedium zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Vorzugsweise enthält der Kit zusätzlich ein Nachweisreagenz für Thiolgruppen, z. B. mindestens eines der oben beschriebenen Nachweisreagenzien, insbesondere 4,4'-Dithiodipyridin und/oder 5,5'-Dithiobis(2- nitrobenzoesäure) (DTNB). Eine weitere Komponente des Kits kann eine Gebrauchsanleitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere des Aktivitätstest, sein.

Die folgenden Ausführungen und Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern ohne sie darauf zu beschränken:

Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 1 entspricht dem Thiopeptolid gemäß Formel (I) SEQ ID NO: 2 stellt die Aminosäuresequenz des Aggrecan Kernproteinvorläufers (Knorpel-specifisches Proteoglycan Kernprotein, CSPCP oder Chondroitinsulfate Proteoglycan Kernprotein 1) dar.

Beispiele

BEISPIEL 1 (VERGLEICHSBEISPIEL)

Testbedingungen

Die katalytischen Domänen des humanen rekombinanten MMP-3 und MMP-8 Proteins, MMP-3cd und MMP-8cd, sind käuflich bei z. B. Biomol International L. P.

Pennsylvania, USA; Katalognummer SE-109 bzw. SE-255 erhältlich. Die verkürzten

Formen der ADAM-TS1 und ADAM-TS4 Protease sind ebenso käuflich bei z. B.

Invitek, Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH, Berlin, Deutschland,

Katalognummer 30400402 bzw. 30400102 erhältlich.

Herstellung der Puffer bzw. Lösungen

TNCB Puffer:

10OmM Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, eingestellt mit HCl auf pH 7.5 10OmM NaCI

1OmM CaCI ₂ ^H ₂ O 0.015% Brij 35

Substrat-Lösung: 10mM Substrate (siehe Tabelle) in DMSO. Unmittelbar vor Gebrauch wurden 2μL der Substratstammlösung mit 130μL H ₂ O verdünnt.

Enzym-Lösung:

MMP-3cd (2.3μg/mL), MMP-8cd (0.6μg/mL), ADAMTS-1 (2.3μg/mL) und ADAMTS-4 (3.3μg/mL) wurden mit TNCB-Puffer verdünnt.

Durchführung des Tests

Es wurden 10μL Enzymlösung und 10μL H ₂ O vorgelegt und die Reaktion durch Zugabe von 10 μL Substratlösung gestartet.

Fluorometrische Analyse

Die Messung der Fluoreszenz erfolgte in dem Fluoreszenzgerät TECAN Spectrafluor Plus; Exitation/Emmission (siehe Tabelle). Hierbei wurde die Fluoreszenz für jeweils 5 Minuten gemessen.

Ergebnisse zum Vergleichsbeispiel 1

Erwartungsgemäß und gemäß dem Stand der Technik wurden die MMP Substrate nicht von ADAMTS umgesetzt.

BEISPIEL 2

Herstellung der Puffer bzw. Lösungen

TNCB Puffer (siehe Beispiel 1 )

Enzym-Lösung:

ADAMTS (Invitek Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH, Berlin, Deutschland)

Es wurden 5μg ADAMTS-1 mit 2200μL, bzw. 5μg ADAMTS-4 mit 600μl TNCB Puffer verdünnt.

Substrat- Lösung

1 ) DTNB Lösung (5,5'-Dithio-bis(2-Nitrobenzoesäure):

Es wurde eine 4OmM Stammlösung in DMSO hergestellt:

Anschließend wurden 27.5μL DTNB Stammlösung mit 522μL Wasser verdünnt.

2) Thiopeptilid- Lösung: (Bachern Distribution Services GmbH, Weil am Rhein,

Deutschland):

Es wurde eine 10OmM Stammlösung in DMSO hergestellt. Zum Gebrauch wurden

55μL Thiopeptilid Stammlösung mit 500μL TNCB Puffer verdünnt.

Unmittelbar vor dem Gebrauch wurden 550μl DTNB mit 550μl Thiopeptilid gemischt.

Durchführung des Tests

Die Messungen wurden in 96-Multiwellplatten (half area plates, flat bottom, clear, polystyrene, No.3695) durchgeführt (Corning Costar, Acton, USA).

Es wurden 10μL Enzymlösung und 10μL H ₂ O vorgelegt und die Reaktion durch Zugabe von 10 μL Substratlösung gestartet.

Colorimetrische Analyse

Mikrotiterplattenphotometer: Molecular Devices Sunnyvale, USA. SpectraMax 190. Die Absorption wurde für 5min bei einer Wellenlänge von 415nm beobachtet.

Ergebnisse zu Beispiel 2

Strukturformel der Verbindung 1

Strukturformel der Verbindung 2 (Vergleichsbeispiel)

Verbindung 2 wurde von ADAMTS nicht umgesetzt. Überraschenderweise wurde jedoch Verbindung 1 von ADAMTS umgesetzt.

SEQ ID NO: 1

Xaa-Pro-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly-Xaa

SEQ ID NO: 2

1 MTTLLWVFVT LRVITAAVTV ETSDHDNSLS VSIPQPSPLR VLLGTSLTIP CYFIDPMHPV 61 TTAPSTAPLA PRIKWSRVSK EKEWLLVAT EGRVRVNSAY QDKVSLPNYP AIPSDATLΞV

121 QSLRSNDSGV YRCEVMHGIE DSEATLEWV KGIVFHYRAI STRYTLDFDR AQRACLQNSA

181 IIATPEQLQA AYEDGFHQCD AGWLADQTVR YPIHTPREGC YGDKDEFPGV RTYGIRDTNE

241 TYDVYCFAEE MEGEVFYATS PEKFTFQEAA NECRRLGARL ATTGHVYLAW QAGMDMCSAG

301 WLADRSVRYP ISKARPNCGG NLLGVRTVYV HANQTGYPDP SSRYDAICYT GEDFVDIPEN 361 FFGVGGEEDI TVQTVTWPDM ELPLPRNITE GEARGSVILT VKPIFEVSPS PLEPEEPFTF

421 APEIGATAFA EVENETGEAT RPWGFPTPGL GPATAFTSED LWQVTAVPG QPHLPGGWF

481 HYRPGPTRYS LTFEEAQQAC PGTGAVIASP EQLQAΆYEΆG YEQCDAGWLR DQTVRYPIVS

541 PRTPCVGDKD SSPGVRTYGV RPSTETYDVY CFVDRLΞGEV FFATRLEQFT FQEALEFCΞS

601 HNATATTGQL YAAWSRGLDK CYAGWLADGS LRYPIVTPRP ACGGDKPGVR TVYLYPNQTG 661 LPDPLSRHHA FCFRGISAVP SPGEEEGGTP TSPSGVEΞWI VTQWPGVAA VPVEEETTAV

721 PSGETTAILΞ FTTΞPENQTE WEPAYTPVGT SPLPGILPTW PPTGAETEES TEGPSATEVP

781 SASEEPSPSE VPFPSEΞPSP SEEPFPSVRP FPSVELFPSE EPFPSKEPSP SEEPSASEEP

841 YTPSPPEPSW TELPSSGEES GAPDVSGDFT GSGDVSGHLD FSGQLSGDRA SGLPSGDLDS

901 SGLTSTVGSG LTVESGLPSG DEERIEWPST PTVGELPSGA EILEGSASGV GDLSGLPSGE 961 VLETSASGVG DLSGLPSGEV LETTAPGVED ISGLPSGEVL ETTAPGVEDI SGLPSGEVLE

1021 TTAPGVEDIS GLPSGEVLET TAPGVEDISG LPSGEVLΞTT APGVEDISGL PSGEVLETAA

1081 PGVEDISGLP SGEVLETAAP GVEDISGLPS GEVLETAAPG VEDISGLPSG EVLETAAPGV

1141 EDisGLPSGE VLETAAPGVE DISGLPSGEV LETAAPGVED ISGLPSGEVL ETAAPGVΞDI

1201 SGLPSGEVLE TAAPGVEDIS GLPSGEVLET AAPGVEDISG LPSGΞVLETA APGVEDISGL 1261 PSGEVLETAA PGVEDISGLP SGEVLETTAP GVEEISGLPS GEVLETTAPG VDEISGLPSG

1321 EVLETTAPGV EEISGLPSGE VLETSTSAVG DLSGLPSGGE VLEISVSGVE DISGLPSGEV

1381 VETSASGIED VSELPSGEGL ETSASGVEDL SRLPSGEEVL EISASGFGDL SGVPSGGEGL

1441 ETSASEVGTD LSGLPSGREG LETSASGAED LSGLPSGKED LVGSASGDLD LGKLPSGTLG

1501 SGQAPETSGL PSGFSGEYSG VDLGSGPPSG LPDFSGLPSG FPTVSLVDST LVEWTASTA 1561 SELEGRGTIG ISGAGEISGL PSSELDISGR ASGLPSGTEL SGQASGSPDV SGEIPGLFGV 1621 SGQPSGFPDT SGETSGVTEL SGLSSGQPGV SGEASGVLYG TSQPFGITDL SGETSGVPDL 1681 SGQPSGLPGF SGATSGVPDL VSGTTSGSGE SSGITFVDTS LVEVAPTTFK EEEGLGSVEL 1741 SGLPSGEADL SGKSGMVDVS GQFSGTVDSS GFTSQTPEFS GLPSGIAEVS GESSRAEIGS 1801 SLPSGAYYGS GTPSSFPTVS LVDRTLVESV TQAPTAQEAG EGPSGILELS GAHSGAPDMS 1861 GEHSGFLDLS GLQSGLIEPS GEPPGTPYFS GDFASTTNVS GESSVAMGTS GEASGLPΞVT 1921 LITSEFVEGV TEPTISQELG QRPPVTHTPQ LFESSGKVST AGDISGATPV LPGSGVEVSS 1981 VPESSSETSA YPΞAGFGASA APEASREDSG SPDLSETTSA FHEANLERSS GLGVSGSTLT 2041 FQEGEASAAP EVSGESTTTS DVGTΞAPGLP SATPTASGDR TEISGDLSGH TSQLGWIST 2101 SIPESEWTQQ TQRPAETHLE IESSSLLYSG EETHTVETAT SPTDASIPAS PEWKRESEST 2161 AAAPARSCAE EPCGAGTCKE TEGHVICLCP PGYTGEHCNI DQEVCEEGWN KYQGHCYRHF 2221 PDRETWVDAE RRCREQQSHL SSIVTPΞEQE FVNNNAQDYQ WIGLNDRTIE GDFRWSDGHP 2281 MQFΞNWRPNQ PDNFFAAGED CWMIWHEKG EWNDVPCNYH LPFTCKKGTV ACGEPPWEH 2341 ARTFGQKKDR YΞINSLVRYQ CTEGFVQRHM PTIRCQPSGH WEEPRITCTD ATTYKRRLQK 2401 RSSRHPRRSR PSTAH