CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presènte invenção se insere no campo da Biologia, mais precisamente no campo da imunologia e descreve uma vacina (OMV-Hae254) para Haemophilus aegyptius 254 (Hae254) compreendendo vesículas de membrana externa (OMV) de linhagem de Haemophilus aegyptius 254 (Hae254) e nanoparticulas de sílica mesoporosa como adjuvante.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A linhagem da bactéria Haemophilus aegyptius 254 (Hae254) é muito patogênica, causadora da Febre púrpura brasileira, uma doença pediátrica descrita pela primeira vez em 1984 no estado de São Paulo, Brasil. É caracterizada por febre alta, dor abdominal, vómitos, evolução de um quadro hemorrágico nos pulmões e adrenais, colapso vascular, petéquias e necrose dos tecidos periféricos. A doença apresenta taxa de mortalidade média de 40 % (nos primeiros casos, a taxa de mortalidade chegou a 70 %) e seu quadro clínico se desenvolve após 7 a 16 dias de um episódio de conjuntivite purulenta (1,2 e 3).

[003] Os principais surtos de BPF ocorreram de 1984 a 1990 no Brasil e a ocorrência mais recente de BPF foi relatada em 2007 na região do Amazonas. Casos da doença também foram relatados na Austrália (5) e um caso nos Estados Unidos .

[004] Especula-se que casos de BPF foram e ainda sejam omitidos, já que o quadro clínico é muito similar à meningoccemia causada por Neisseria meningitidis, exceto pela ausência de meningite e o fato de ocorrer apenas em crianças de 2 meses a 10 anos de idade. Recém-nascidos, adolescentes, adultos e idosos parecem ser imunes, o que sugere que a proteção contra BPF seja mediada, em parte pelo menos, por anticorpos adquiridos por passagem transplacental ou a partir de determinada idade. Algumas diferenças foram observadas entre a infecção por Hae-BPF no modelo animal e em crianças: ratos tiveram um bacteremia autolimitante e meningite, já em humanos, a bacteremia é frequentemente fatal e não há meningite. É possível que a natureza fulminante da infecção em humanos, qual não ofereça tempo suficiente para bactéria chegar às meninges, já que o maior determinante do desenvolvimento de meningite por Haemophilus é a magnitute e duração da bacteremia. Porém, apesar de não mimetizar completamente a evolução da BPF em humanos, esse modelo in vivo é um modelo viável para o estudo da infecção por Hae.

[005] Desta forma, utilizou-se as OMVs como um estimulador da resposta imunogênica do hospedeiro junto com adjuvantes, produzindo assim a vacina para a bactéria Haemophilus aegyptius 254 (Hae254), nunca descrita anteriormente .

[006] O fato de esta bactéria ter sido erradicata por um longo período, pesquisas deixaram de serem feitas sobre este patógeno, mas vários estudos mostram uma semelhença no quadro clínico de meningite provocado por Neisseria meningitidis com relação ao quadro de febre púrpura. E mais, vários estudos mostraram que Neisseria meningitidis expressam não somente genes de outras linhagens, como também genes de polissacarídeos de bactérias de espécies diferentes, como Haemophilus influenzae.

[007] Sendo assim, o interesse em estudar a bactéria Haemophilus aegyptius 254 (Hae254), onde acredita-se que possivelmente possa ter ocorrido uma troca de material genético entre essas bactérias no curso da evolução, podendo confundir o diagnóstico de febre púrpura com o quadro de meningite, que possivelmente ainda pode estar afetando um grande número de pessoas sem ter sucesso no tratamento clinico.

Haemophilus aegyptius 254 (Hae254)

[008] Bactérias do género Haemophilus são cocobacilos gram-negativos, sem motilidade, não possuem cápsulas, não formam esporos e são aeróbicos ou anaeróbicos facultativos. 0 único hospedeiro natural de H. influenzae, incluindo Hae, é a espécie humana e tais organismos necessitam dos fatores de crescimento V (NAD - dinucleotideo de nicotinamida) e do fator X (hemina) presentes no sangue . Linhagens de H. influenzae são classificadas em sorotipos e em biótipos. A sorotipagem de H. influenzae em sorotipos de a - f baseia-se na presença do tipo capsular. As linhagens que não apresentam cápsula são não tipáveis (NTHi nontypable H. influenzae), como é o caso. de Hae. A classificação em biótipos I - VIII baseia-se na presença de enzimas como ornitina descarboxilase, urease, na fermentação do açúcar D-xilbse e na produção de indol. É interessante ressaltar que alguns autores como consideram biótipo e biogrupo como sinónimos e usam a nomenclatura Haemophilus influenzae biótipo aegyptius, sendo aegyptius um biótipo a parte dos demais. Bactérias pertencentes ao biótipo III e Hae não são capazes de fermentar a xilose e de produzir indol, ainda, tais bactérias são capazes de hemaglutinação e são os principais causadores de conjuntivite entre as demais linhagens de H. influenzae. Entretanto, existem diferenças entre linhagens do biótipo III e Hae, como a susceptibilidade de Hae à troleandomicina, morfologia bacilar distinta, menor taxa de crescimento em ágar chocolate e o perfil de proteínas da membrana externa.

Lipooligossacarideo (LOS) e lipídios

[009] O LOS é um fator de virulência comumente relacionados às doenças invasivas, também conhecido como endotoxina. É o maior constituinte da membrana externa de bactérias gram-negativas e são responsáveis pelo quadro de sepses bacteriana.

[010] O LOS é formado por uma porção lipídica, o lipídio A, covalentemente ligada a um oligossacarídeo. 0 lipídio A, um glicolípideo composto por múltiplos ácidos graxos, é o componente biologicamente ativo do LOS e responsável por sua atividade endotóxica.

[011] 0 LOS é conhecido por estimular o sistema imune, induzindo a produção de citocinas como IL-10 (Interleucina 10) e TNF-α (Tumor necrosis factor - fator de necrose tumoral) . Vale ressaltar que a resposta imune causada pela BPF é algo que ainda não foi analisado.

ESTADO DA TÉCNICA

[012] Alguns documentos do estado da técnica descrevem possibilidades para o tratamento da febre púrpura. Por exemplo:

[0131 O documento WO 2006/06074 A2 descreve sequências HRL e HR2 na adesina HadA de H. influenzae biogrupo aegyptius, o agente causador da febre púrpura brasileira (BPF) . Cabe ressaltar que as sequências dentro HadA não tem qualquer semelhança de sequência significativa com as sequências virais, mas foram em vez identificados com base na semelhança estrutural com NadA. A semelhança surpreendente de sequências virais de RH sugere que os inibidores de fusão podem ser utilizados para inibir a infecção por H. influenzae. Além disso, tal documento é voltado para a prevenção meningocócica. A tecnologia vacinai baseada na proteína NadA sugere que possa proteger contra o Hae causador de febre púrpura e utiliza somente a proteína NadA. Em contrapartida, a presente invenção possui todas as proteínas e lipídeos de superfície do H. influenzae biótipo aegyptius causador de febre púrpura. Além disso é adjuvada com sílica mesoporosa que aumenta a resposta vacinai contra tal patógeno.

[014] 0 documento WO 2005/111066 A2 descreve um peptídeo, anticorpo e composição, bem como seus usos para meningite e outras doenças. O documento relata que embora as infecções Hib agora podem ser controladas através de vacinação, outras estirpes de H. influenzae patogênicas permanecem um risco. A não tipável de H. influenzae biogrupo aegyptius provoca conjuntivite epidêmica e febre purpúrica brasileira (BPF) , com BPF ter uma mortalidade de até 70%. Além disso, tal documento aborda de maneira superficial o H. influenzae biótipo aegyptius e coloca uma série de patógenos baseando-se em sequências genômicas dos mesmos (incluindo cepas de H. influenzae NTHi) . Além disso, tal invento não descreve a eficácia vacinai com testes imunológicos que permitam ajuste de dose e/ou verificação de aumento de adjuvância. Já a presente invenção, não somente propõe testes de eficácia vacinai (ELISA, efeito bactericida do soro de animais vacinados, e alguns testes de fagocitose) , como também apresenta todos os estudos genômicos de 7 cepas de Hae causadores de febre púrpura brasileira acerca dos possíveis epítopos vacinas e superfície destas bactérias .

[015] Portanto, nenhum dos documentos do estado da técnica descreve uma vacina compreendendo vesículas de membrana externa (OMV) de linhagem de Haemophilus aegyptius 254 (Hae254) e sílica mesoporosa.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[016] A presente invenção tem por objetivo propor uma vacina compreendendo OMV-Hae254 e sílica mesoporosa.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[017] A FIG. 1 apresenta um gráfico mostrando o efeito bactericida do soro dos camundongos imunizados nas diluições: 1:10; 1:20; 1:40 e 1:80.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[018] A presente invenção refere-se a uma vacina (OMV-Hae254) compreendendo vesículas de membrana externa (OMV) de linhagem de Haemophilus aegyptius 254 (Hae254) e nanopartículas de sílica mesoporosa como adjuvante.

[019] A vacina compreende compreender 5 a 10 pg de OMV de vesículas e 100 a 300μς de nanopartículas de sílica mesoporosa .

[020] - A OMV da referida vacina OMV-Hae254 é produzida por biofermentação conforme processo descrito no pedido de patente BR 10 2015 013040 6, em que:

[021] Após transcorrido um período de 6 horas, coleta-se com auxílio de uma seringa de 10 mL acoplada a uma agulha de l,20x40mm, 10 mL de bactéria crescida do pré- inóculo, previamente preparado.

[022] Em seguida, adiciona-se os 10 mL do pré- ínóculo em 1000 mL de meio BHI/NADH/Hemina distribuído em frasco próprio previamente autoclavado, do biorreator.

[023] As bactérias cresceram a 150 rpm a uma temperatura de 37°C por 12, 16 e 20 horas. Em cada um desses tempos foi coletado 1 ml em microtubo de 2 mL para posterior medida da absorbância em cubetas de quartzo. Além disso, para cada um dos tempos anteriormente descritos foram coletados 300 mL do biofermentado em seis tubos tipo Falcon de 50 mL, cada um possuindo 50 mL do biofermentado. Os tubos tipo Falcon foram previamente pesados com tampa em balança analitica e os pesos anotados.

Medida da Absorbância do Biofermentado

[024] A absorbância do biofermentado foi medida a 600 nm no aparelho adequado. Em seguida, a densidade ótica foi obtida com a utilização do Software Magellan e calculada para cada um dos tempos relatados anteriormente (12, 16 e 20 horas, com o intuito de saber se existe uma correlação entre a massa bacteriana e a produção de OMV-Hae254.

Recuperação da OMV-Hae254 produzidas por Ultrafiltraçâo

[025] Após a medida da absorbância, os tubos contendo o biofermentado foram centrifugados por 15 minutos a 4000rpm (3307g) .

[026] O sobrenadante foi separado em tubos tipo Falcon de 50 mL para posterior filtração em filtro de nitrocelulose com porosidade de 0,025μΜ, e diâmetro de 142mm com o auxilio de um compressor a 400 a 600mmHg.

[027] O sedimento contido dentro do tubo tipo Falcon foi pesado junto com o mesmo em balança analítica para que fosse feita a relação entre quantidade de massa bacteriana e quantidade de OMV obtida em cada um dos tempos acima descritos .

[028] Após a filtragem, a OMV-Hae254 retida no filtro foi solubilizada em Tampão Fosfato-Salino lx (NaCl 0,1369M, KC1 0,00268M, Na ₂ HPO ₄ 0,008M, KH ₂ PO ₄ 0,015M) ou em NaCl 0,9% (0,9g de NaCl em 100 mL de H2O destilada e autoclavada) .

[029] O filtro foi retirado do aparelho filtrante com auxilio de uma pinça de inox de 13 cm, bico redondo 14cm e colocada em placas 12x12 cm. Em seguida, adicionou-se a placa com o filtro, 20 mL ou de uma solução de Tampão Fosfato- Salino lx ou uma solução de NaCl 0,9%. A placa com o filtro e a solução de solubilização foram colocadas por 30 minutos a 37 °C em estufa bacteriológica.

[030] Posteriormente, com o auxilio de uma seringa (10 mL) foi retirado todo o volume da placa, e acoplada a seringa, um filtro de seringa de 0,22 uM, o sobrenadante filtrado contendo a OMV-Hae254 , foi acondicionado em microtubos de 2 mL,, onde foram acondicionadas em biofreezer a -80°C.

Ensaios Biológicos

Imunização animal

[031] Foram usados 15 animais, divididos em 3 grupos :

Grupo I: 5 animais foram vacinados com OMV 254, em uma concentração de 10 ug/mL por animal;

Grupo II: 5 animais foram vacinados com OMV 254 + sbalS (sílica mesoporosa) , sendo a OMV 254 em uma concentração de 10 ug/mL por animal e a sílica sbal5 em uma concentração de 250 ug/mL em cada animal;

Grupo. III: 5 animais foram vacinados com OMV 254 + sbal6 (sílica mesoporosa) , sendo a OMV 254 em uma concentração de 10 ug/mL por animal e a sílica sbal6 em uma concentração de 250 ug/mL em cada animal.

[032] Após a 1 ^a dose da vacina, os grupos de animais foram mantidos por 1 semana em estantes ventiladas, e foram dados a 2 ^a dose da vacina com a mesma concentração da 1 ^a , assim como foi mantida a mesma concentração de sílica mesoporosa. Os animais foram deixados por mais 7 dias.

[033] Após 7 dias da 2 ^a dose os animais foram anestesiados com 90-150 mg/kg de quetamina e 7,5-16 mg/kg de xilazina, e o sangue retirado por punção cardíaca.

[034] O sangue de cada animal foi colocado em eppendorf e centrifugado à 4000 RPM para a retirada do soro. 0 soro foi separado por pipetagem em outro frasco eppendorf, mantido em geladeira à 4 graus para serem realizados outros procedimentos .

Ensaio de Elisa para detecção de anticorpos imunizantes

[035] Foram utilizadas placas de 96 poços estéril para fazer o coating de bactérias (cama de bactérias fixadas no fundo da placa) para interagirem com os anticorpos dos camundongos imunizados.

[036] As bactérias Hae 254 e Hae 258 foram crescidas em meio ágar chocolate e colocadas em jarras para aumento da concentração de CO ₂ por 24 horas. Após o crescimento, as bactérias foram colocadas em tubos falcon com 30 mL de PBS, numa escala Mc Farland de 0,5 e deixados no banho-maria à 56 graus por 1 hora. Em seguida, colocou-se 100 uL da diluição de bactéria em cada poço e deixar secar em estufa à 37 graus.

Efeito bactericida do soro dos camundongos imunizados [037] Os soros dos camundongos imunizados Hae 254, 254 + sba 15 e 254 + sba 16, foram diluídos 1:20, 1:40 e 1:80, conforme o gráfico observado na FIG. 1.

[038] As bactérias de interesse Hae 254, foram diluídas na escala Mc farland 0,5 e depois diluída 1000 vezes;

[039] Assim, colocou-se 50 uL da solução de bactérias com os soros nas diferentes diluições e acrescentou-se 25 uL de complemento, deixando na estufa em 37 graus por 30 minutos;

[040] Foi colocado 1 mL de meio de cultura BHI em cada poço de uma placa de 24 poços, em seguida foi colocado aproximadamente 200 uL do soro misturado com a bactéria e o complemento no poço com o meio de cultura, deixado por 24 horas em estufa de 37 graus, contando, no dia seguinte, o número de colónias de cada poço. As amostras foram feitas em triplicata.

[041] O efeito bactericida da vacina 254 pode ser observada nos resultados abaixo:

254 (triplicata)

1:20: 12 16 18 (P 0.0015) muito significativo

1:40: 20 28 21 (PO.5983) não significativo

1:80: 29 19 29 (0,5783) não significativo

Copl:21 26 21

254 + sbalS (triplicata)

1:20: 13 19 14 (PO.0016) muito significativo

1:40: 12 17...19 (PO .0031) muito significativo

1:80: 25 20 24 (PO.5538) não significativo

Copl:24 30 21

254 + sba!6 (triplicata) 1:20: 31 18 28 (P0, 6088} não significativo 1:40: 20 0 24 (P0.0483) significativo 1:80: 23 27 26 (P0.5785) não significativo Copl:23 26 26