PORT MARC (FR)
| WO2004054615A1 | 2004-07-01 |
| US20040102428A1 | 2004-05-27 |
REVENDICATIONS
1 . Composé comprenant d'une part une partie de ciblage de récepteurs CXCR4, et d'autre part une partie de détection capable d'être identifiée par une méthode d'imagerie médicale, dans lequel la partie de détection est choisie parmi a) au moins un chélate linéaire ou macrocyclique d'ion de métal paramagnétique ou de radionucléide ou de métal shifteur, b) des nanoparticules superparamagnétiques de diamètre inférieur à 100 nm, de préférence entre 5 et 50 nm, c) des nanoparticules en émulsion comprenant un chélate d'ion de métal paramagnétique ou de radionucléide.
2. Composé selon la revendication 1 dans lequel la partie de ciblage est choisie parmi un peptide, un peptidomimétique, un bicyclam.
3. Composé selon la revendication 1 ou 2 dans lequel la partie de détection est un chélate linéaire ou macrocyclique d'ion de métal paramagnétique ou de métal shifteur.
4. Composé selon la revendication 3 dans lequel le chélate est choisi parmi les composés DTPA, DTPA BMA, DTPA BOPTA, DO3A, TETA, TRITA, HETA, DOTA, TETA, NOTA, PCTA et leurs dérivés, de préférence le PCTA. 5. Composé selon la revendication 2 dans lequel la partie de détection est une nanoparticule superparamagnétique de diamètre inférieur à 100 nm, de préférence entre 5 et 50 nm. 6. Composé selon la revendication 2 dans lequel la partie de détection est une nanoparticule lipidique. 7. Composition diagnostique comprenant un composé selon l'une des revendications précédentes et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 8. Utilisation d'un composé selon les revendications 1 à 6 pour le diagnostique d'une pathologie associée à une surexpression ou une sous-expression de récepteurs CXCR4. 9. Utilisation d'une composition selon la revendication 7 pour le diagnostique d'une pathologie associée à une sur-expression ou une sous-expression de récepteurs CXCR4, de préférence le diagnostique de tumeurs, notamment des métastases tumorales. |
Titre : COMPOSES DE DIAGNOSTIQUE POUR LE CIBLAGE DE RECEPTEUR A CHIMIOKINES
L'invention concerne des composés de diagnostique destinés à cibler des récepteurs aux chimiokines notamment les récepteurs CXCR4, et l'utilisation de ces composés dans le domaine de l'imagerie médicale.
Les chimiokines sont des molécules de la famille des cytokines, qui présentent des propriétés d'activation, en particulier de cellules de la famille des leucocytes faisant intervenir notamment des propriétés chemoattractives, des propriétés de mobilisation du calcium par augmentation du calcium intracellulaire et des propriétés de relargage d'enzymes (exocytose). Ces chimiokines sont connues pour leur rôle éventuel en tant que médiateurs de l'inflammation. Plusieurs chimiokines ont été décrites par référence à leur structure et à leur affinité pour un ou plusieurs récepteurs et par référence à leurs propriétés biologiques, dans une publication de Baggiolini M. et al (Advances in Immunology (1994), vol. 55, pages 97-179). Une publication de Wells T.N.C. étal (Journal of Leukocyte Biology, vol. 59, January 1996, 53-60) décrit la structure tri¬ dimensionnelle de plusieurs chimiokines et leurs récepteurs spécifiques ou non. De façon générale, ces chimiokines sont caractérisées par la présence dans leur structure primaire, de résidus cystéine conservés (1 à 4 résidus notamment) sur la base desquels plusieurs sous-familles ont été distinguées selon la position des deux premières cystéines. Ces familles comprennent celles des protéines CXC ou des protéines CC. La présence de ces résidus cystéine induit la formation de ponts disulfure.
Le rôle déterminant des chimiokines et de leurs récepteurs a été démontré dans la prolifération cancéreuse due aux métastases, notamment des carcinomes pulmonaires, (Muller et al, Nature 410 : 50-6 (2001 ), WO 99/47518). Des cellules malignes issues de tumeurs primaires vont coloniser d'autres tissus en passant par la circulation sanguine ou lymphatique, des chimiokines intervenant dans ce processus. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression et la métastase tumorale (la mobilité, la migration, la prolifération cellulaire, l'adhésion de celles cancéreuses circulantes aux cellules endothéliales) ne sont pas totalement élucidés. Le rôle des
récepteurs CXCR4 est toutefois démontré, et des ligands capables de cibler des récepteurs CXCR4 et ainsi d'inhiber la progression tumorale ont été décrits, notamment dans le document US 2004 0132642 .
L'invention concerne le ciblage de récepteurs CXCR4, non pour le traitement, mais pour le diagnostique d'une pathologie cancéreuse, et en particulier l'évaluation des risques et du stade de la progression des métastases.
L'homme du métier connaît pour NRM notamment (Imagerie par Résonance Magnétique) un grand nombre de produits de contraste, dits non spécifiques, à base de chélates de métal paramagnétique tel que le Gadolinium, linéaires ou macrocycliques, notamment DTPA, DTPA BMA, DTPA BOPTA, DO3A, TETA, TRITA, HETA, DOTA-NHS, TETA-NHS, PCTA, DOTA, M4DOTA, M4DO3A, M4DOTMA, MPDO3A, HBED, EHPG, BFCs. Mais ces composés ne permettent toutefois pas de reconnaître spécifiquement une zone pathologique, et en particulier les métastases tumorales. Par opposition à un produit non spécifique de l'art antérieur (sans ciblage de marqueur biologique), les composés selon l'invention visent à identifier spécifiquement des cibles biologiques (cellules, tissus) présentant une surexpression des récepteurs CXCR4 par rapport à une zone non pathologique. En particulier, les composés selon l'invention sont destinés à cibler des cellules tumorales exprimant les récepteurs CXCR4, et de manière préférée des cellules métastatiques.
Ainsi selon un premier aspect, l'invention concerne des composés comprenant d'une part une partie biovecteur de ciblage des CXCR4, et d'autre part une partie de détection (entité signal) capable d'être identifié par une méthode d'imagerie médicale. La partie de détection est typiquement un agent de contraste détectable par imagerie IRM, rayons X, scintigraphie aux rayons gamma, scanner CT, ultrasons, PET, imagerie optique, imagerie CEST et notamment Lipocest (nanoparticules lipidiques exposées à une imagerie CEST).
Dans le cas de NRM, un contraste est obtenu grâce à l'administration d'agents de contraste contenant des métaux paramagnétiques ou superparamagnétiques qui ont un effet sur la relaxivité des protons de l'eau. Dans le cas de la scintigraphie, le
contraste est obtenu par la localisation spécifique d'un composé radiopharmaceutique émettant des rayons gamma ou beta.
Dans le cas du PET, le contraste est obtenu par la localisation spécifique d'un composé radiopharmaceutique émettant des positons. Dans le cas de l'imagerie optique on pourra utiliser typiquement des fluorochromes organiques (FITC, Cys5.5 par exemple) et des quantum dots.
Dans le cas de l'imagerie CEST on utilise typiquement un métal de déplacement approprié (métal shifteur).
L'invention utilisera pour le ciblage des récepteurs CXCR4 des biovecteurs appropriés choisis notamment parmi des anticorps ou des petites molécules telles que des peptides, des sucres ou des molécules organiques.
Selon un mode de réalisation, la partie signal comprend au moins un chélate, un grand nombre de chélates pouvant être utilisés.
On pourra utiliser notamment un chélate linéaire parmi : EDTA, DTPA diéthylènetriaminopentaacétique acide, N-[2-[bis(carboxyméthyl)amino]-3-(4- ethoxyphenyl)propyl]-N-[2-[bis(carboxyméthyl)amino]éthyle] -L-glycine (EOB-DTPA),
N,N-bis[2-[bis(carboxyméthyl)amino]éthyle]-L-glutamique acide (DTPA-GLU), N, N- bis[2-[bis(carboxyméthyl)amino]éthyle]-L-lysine (DTPA-LYS), des dérivés mono- ou bis-amide du DTPA, tels que N,N-bis[2- [carboxyméthyl[(méthylcarbamoyl)méthyle]amino]éthyle] glycine (DTPA-BMA), 4- carboxy-5,8,11 -tris(carboxyméthyl)-1 -phenyl-2-oxa-5,8,11 -triazatridecan-13-oic acide
(BOPTA),
On pourra utiliser notamment un chélate macrocyclique parmi 1 ,4,7,10- tetraazacyclododecan-1 ,4,7,10-tetraacetic acide (DOTA), 1 ,4,7,10- tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triacetic acide (DO3A), 10-(2-hydroxypropyl)-1 , 4,7,10- tetraazacyclododecan-1 ,4,7-triacetic acide (HPDO3A) 2-methyl-1 ,4,7,10- tetraazacyclododecan-1 ,4,7,10-tetraacetic acide (MCTA), ( alpha , alpha ', alpha ", alpha "')-tetramethyl-1 ,4,7,10-tetraazacyclododecan- 1 ,4, 7,10-tetraacetic acide
(DOTMA), 3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1 (15),1 1 ,13-triene-3,6,9-triacetic acide (PCTA), NOTA.
On pourra aussi utiliser des dérivés dans lesquels un ou plusieurs groupes carboxyliques sont sous forme d'un sel, ester, amide correspondant ; ou un composé
correspondant dans lequel un ou plusieurs groupes carboxyliques sont remplacés par un groupe phosphonique et/ou phosphinique tel que 4-carboxy-5,1 1 - bis(carboxyméthyl)-1 -phényl-12-[(phénylméthoxy)méthyl]-8-(phosphonométhyl)- 2-oxa- 5,8,1 1 -triazatridecan-13-oic acide, N,N'-[(phosphonométhylimino)di-2,1 - ethanediyl]bis[N-(carboxyméthyl)glycine], N,N'-[(phosphonométhylimino)di-2,1 - ethanediyl]bis[N-(phosphonométhyl)glycine], N,N'-[(phosphinométhylimino)di-2,1 - ethanediyl]bis[N-(carboxyméthyl)glycine], 1 ,4,7,10-tetraazacyclododecane-1 ,4,7,10- tetrakis[méthylen(méthylphosphonique)]acide, or 1 ,4,7,10-tetraazacyclododecane- 1 ,4,7,10-tetrakis[méthylen(méthylphosphinique)]acide. On peut aussi utiliser un chélate parmi : DOTA gadofluorines, DO3A, HPDO3A, TETA, TRITA, HETA, DOTA-NHS, M4DOTA, M4DO3A, PCTA et leurs dérivés 2-benzyl- DOTA,alpha- (2-phenethyl) 1 ,4,7,10 tetraazacyclododecane-1 -acetic-4,7,10-tris (méthylacétique) acide, 2benzyl-cyclohexyldiethylenetriaminepentaacetic acide, 2- benzyl-6methyl-DTPA, 6,6"-bis [N, N, N", N"tétra (carboxyméthyl)aminométhyl)-4'- (3- amino-4-methoxyphenyl)- 2,2' : 6', 2"-terpyridine, N,N'-bis-(pyridoxal-5-phosphate) éthylènediamine- N, N'-diacétique acide (DPDP) et éthylènedinitrilotétrakis (méthylphosphonic) acide (EDTP).
De manière plus large, le ou les chélates formant l'entité signal pourront répondre à la formule du document WO01 /60416. Le couplage de chélates avec des biovecteurs est connue l'art antérieur, et fait généralement intervenir un lien chimique (linker) tel que décrit dans le document WO01/60416. La structure et la nature chimique du linker sont définies pour permettre le couplage chimique entre le biovecteur et le ou les chélates utilisés. Dans le cas de NRM, la relaxivité de ces chélates en imagerie T1 est typiquement de l'ordre de 4 à 20 mMol-1 Gd-1 s-1 . On rappelle que la relaxivité longitudinale η d'un produit de contraste paramagnétique donne la mesure de son efficacité magnétique et permet d'apprécier son influence sur le signal enregistré. En imagerie médicale IRM, les produits de contraste modifient le temps de relaxation des protons, et l'augmentation de la relaxivité obtenue permet d'obtenir un signal plus élevé. Les chélates sont choisis de manière à former des complexes stables avec des ions de métal paramagnétique de nombre atomique 21 -29, 42-44, or 58-70, notamment Gd ), Dy (III), Fe (III), Mn (III) and Mn (II), Tm III pour l'imagerie CEST.
Dans le cas de la scintigraphie, le métal est un radionucléide, notamment 99 Tc, 117 Sn, 111 In, 97 Ru, 67 Ga, 68 Ga, 89 Zr, 177 Lu, 47 Sc, 105 Rh; 188 Re, 60 Cu, 62 Cu, 64 Cu, 67 Cu, 90 Y, 159 Gd, 149 Pr, 166 Ho. Selon une réalisation, le métal est un radionucléide pour l'imagerie PET.
Selon un autre mode de réalisation, la partie signal est de type nanoparticule superparamagnétique SPIO ou USPIO. De préférence, la particule est une particule d'oxyde ou d'hydroxyde de fer, notamment de magnétite (Fe 3 O 4 ), maghémite (γ- Fe 2 O 3 ), ou d'autres atomes de transition. La taille est inférieure à 100-150 nm, de préférence de diamètre hydrodynamique entre 5 et 60 nm.
Selon un autre mode de réalisation, la partie signal est de type émulsion nanoparticulaire, contenant ou non des perfluorocarbones, telle que des particules décrites dans le document WO 03/062198, US 5 958 371 , US 5 080 885, US 6 403 056. Les nanoparticules en émulsion sont typiquement couplées à un grand nombre de chélates, par exemple 10 000 à 100 000 DTPA par particule. Différentes émulsions de perfluorocarbone sont rappelées dans le document US 6 676 963 (perfluorodecalin, perfluorooctane, perfluorodichlorooctane, perfluoro-n-octyl bromide, perfluoroheptane, perfluorodecane, perfluorocyclohexane, perfluoromorpholine, perfluorotripropylamine, perfluortributylamine, perfluorodimethylcyclohexane, perfluorotrimethylcyclohexane, perfluorodicyclohexyl ether, perfluoro-n-butyltetrahydrofuran). On pourra utiliser des lipides/surfactants destinés à former un recouvrement extérieur des nanoparticules de couplage du ou des ligands de ciblage de CXCR4, comprenant notamment des phospholipides, des acides gras, du cholestérol, ou d'autres dérivés, le cas échéant conjugués à des PEG. Différentes techniques peuvent être utilisées pour coupler de manière covalente la partie de ciblage de CXCR4, et éventuellement d'autres molécules organiques dont les chélates cités précédemment, aux composés de la couche de recouvrement, par exemple avec la formation d'amides ou de liens sulfure.
De manière plus large, les biovecteurs de ciblage de CXCR4 peuvent être greffés ou encapsulés dans un système de transport approprié pour une reconnaissance biologique efficace sur le plan diagnostique. De tels systèmes peuvent être des
liposomes, micelles, vésicules, microgels, particules lipidiques à multicouches, polymères de saccharides et/ou d'oxyde d'éthylène.
L'invention concerne l'utilisation d'une composition selon la présente invention pour le diagnostique d'une pathologie associée à une surexpression ou une sous- expression de récepteurs à des chimiokines.
L'invention concerne aussi l'utilisation des composés décrits précédemment pour le diagnostique de maladies associées à une sur-expression ou une sous-expression de CXCR4 par rapport à un tissu sain, de préférence le diagnostique de tumeurs notamment la détection de métastases tumorales.
L'invention concerne aussi l'utilisation des composés décrits précédemment pour la préparation d'une composition diagnostique destinée au diagnostique de maladies associées à une sur-expression ou une sous-expression de CXCR4 par rapport à un tissu sain, de préférence le diagnostique de tumeurs, notamment des métastases tumorales.
Des exemples d'administration de compositions pour l'imagerie médicale sont décrits dans l'art antérieur, par exemple dans le document WO 0226776. L'agent de diagnostic est administré en quantité suffisante pour une imagerie satisfaisante. En IRM, on utilisera par exemple une dose d'ion métallique de 0,02 à 1 ,5 mmole/kg de poids corporel.
Des véhicules pharmaceutiquement physiologiquement acceptables permettant de former des compositions diagnostiques (produits de contraste) comprenant les composés décrits précédemment sont connus de l'art antérieur. On utilisera par exemple des sels (sodium, calcium, méglumine), des agents de contrôle du pH (acide acétique, citrique, fumarique, des antioxydants.
Selon une réalisation préférée, le biovecteur est un bicyclam tels que le composé AMD3100 directement biocouplable ou un de ses dérivés décrits dans : Bioconjugate Chem, 2004, 15,413-423 ; The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2003, vol 278, n°47, 47136-47144 ; J.Med.Chem, 1999,42,229-241 ; Chemical Reviews,2003,vol 103,n°9.
On choisira notamment des composés capables de cibler des récepteurs CXCR4 choisis parmi les composés suivants :
AMD3106 AMD3108
AMD2763 AMD2849
Selon une autre réalisation le biovecteur est un peptide de ciblage de CXCR4 tel que le peptide synthétique TN14003 décrit dans Cancer Research, 64,4302-4308,15 juin 2004.
On pourra aussi utiliser le composé non peptidique KRH-1636 décrit dans PNAS, avril 2003, vol 100, n°7,4185-4190, ou des anticorps capables de cibler des récepteurs CXCR4, des composés décrits dans US 6 667 320, US 2004/0157818 (Yanaka et al), US 2004/0134642 (USA government), US 2004/0102428, US2004/0037825 (Bond et al), US 2004/0019058, US 2003/0220482 (vMIP-ll), US 2003/0091569 (Gerritsen et al), US 2002/0039993 (SDF1 ), US2002/0077339 (Bridger et al), 2004/0009171 (Genentech).
De manière plus globale, les inventeurs ont étudié l'utilisation pour NRM de processus inflammatoires ou cancéreux, de composés dont le biovecteur est capable de cibler spécifiquement des récepteurs d'autres chimiokines que les récepteurs CXCR4. Le biovecteur peut notamment être une chimiokine ou un agoniste ou un antagoniste ou un dérivé de chimiokines des familles CC, CXC, CX3C, C. Selon une réalisation par exemple le biovecteur est un antagoniste de la chimiokine SDF-1 (stroma cell derived factor 1 ) tel que ceux décrits dans The EMBO journal, vol 16,n°23,6996-7007,1997 ou le CTCE-9908, ou de manière générale des structures peptidomimétiques ou tronquées de SDF-1. Les chimiokines IL-8, MCP-1 , MIP-1 notamment sont utiles dans le cadre de l'invention. De plus, l'expression de plusieurs récepteurs de chimiokines, dont les récepteurs CXCR3, CCR7, CCR10, est démontrée dans les cellules de mélanomes, ainsi que l'expression de récepteurs CXCR1 et CXCR2 pour le carcinome du colon.
Le couplage entre le biovecteur est réalisé de manière appropriée, typiquement à l'aide d'un lien chimique. Les composés bis-macrocycliques (AMD 3100 et analogues) peuvent être conjugués à des marqueurs fluorescents, paramagnétiques ou radioactifs. Pour cela il est possible d'utiliser une des fonctions aminé secondaire des cycles azotés, les autres fonctions aminé étant protégées par un groupement adapté préalablement introduit lors de la synthèse des hétérocycles. Ces groupements sont choisis parmi les groupes protecteurs appropriés des fonctions aminés comme les amides, les carbamates. Le composé macrocyclique peut alors être lié au marqueur via la fonction aminé secondaire libre à l'aide d'une réaction de couplage peptidique, typiquement par condensation sur un isothiocyanate, par réaction sur un ester de l'acide squarique, par alkylation. Il est également possible d'introduire entre l'azote hétérocyclique et le marqueur un segment de liaison qui permet d'éloigner les deux parties actives de la molécule. Ces segments de liaison sont obtenus par réaction de motifs hétérobifonctionnels de taille et de nature chimique variable comme des chaînes polyméthyléniques, des oligoéthylèneglycols, un aminoacide, un peptide, un noyau aromatique. Ces liens hétérobifonctionnels possèdent une fonction réactive avec la fonction aminé secondaire à l'une de leur extrémité comme une fonction acide carboxylique éventuellement activée sous forme d'ester, un halogénure d'alkyle, un
ester de l'acide squarique ; et une autre fonction réactive disponible à l'autre extrémité pour recevoir le marqueur. Parmi les fonctions possibles on peut citer la fonction aminé, la fonction acide carboxylique, un thiol, un groupement maléimide, un ester de l'acide squarique. On peut trouver des exemples de segments de liaison hétérobifonctionnels (heterobifonctionnal cross-linkers) dans Bioconjugate Techniques- Greg.T.Hermanson-Academic Press- 1996-p228-286. Lorsque la conjugaison des deux entités actives est réalisée, on procède à la déprotection des fonctions bloquées selon les protocoles appropriés de la chimie (voir Protective Groups in Organic Synthesis- second edition-T.W.Green, P.G.M.Wuts-JOHN WILEY SONS-1991 et Protecting Groups-3rd edition-P.J.Kocienski-THIEME-2004).
Le demandeur a étudié notamment les produits suivants.
L'ester terbutylique de l'acide 11 -{4-[4,8-Bis-tert-butoxycarbonyl-1 1 -(4-carboxy-butyl)- 1 ,4,8,1 1tétraaza-cyclotétradec-1 -ylméthyl]-benzyl}-1 ,4,8,1 Itétraaza-cyclotétradécane- 1 ,4,8-tricarboxylique de formule ( Boc-AMD-(CH 2 ) 4 COOH):
Formule I a été préparé selon les données de la littérature (Bioconjugate Chemistry, vol.15, n°2, 2004)
Les exemples suivants sont donnés à titre indicatif, non limitatif.
Exemple 1 :
Etape 1 : couplage
A une solution de 36mg de l'aminé mono Fmoc-1 ,5-Diaminopentane(sous forme de chlorhydrate Novabiochem®), 100mg de l'acide Boc-AMD-(CH 2 ) 4 COOH ( 0,09 mmole) et 32 mg de triéthylamine dans 5 ml de dichlorométhane sont ajoutés 44mg d'agent de couplage BOP (Benzotriazole-i -yl-oxy-tris-(diméthylamino)- phosphoniumhexafluorophosphate). La solution est agitée à température ambiante durant 4h puis lavée successivement avec une solution de NaHCO 3 5%, KHSO 4 5% et finalement à l'eau. La phase organique est séchée sur Na 2 SO 4 et évaporée à sec. Le produit est purifié sur gel de silice (Elution CH 2 CI 2 /Me0H). m /z : ES+ 1600
Etape 2 : déprotection du Fmoc
Formule II
Le composé obtenu à l'étape 1 est dissous dans une solution de pipéridine dans le DMF (20%). La solution est agitée à température ambiante 3H puis évaporée sous vide poussé. L'huile obtenue est lavée à l'éther de pétrole puis chromatographiée sur gel de silice (CH 2 CVIvIeOH). m /z : ES+ 1 189
Exemple 2 :
Etape 1 : Ester benzylique de l'acide 5-(1 ,3-Dioxo-1 ,3-dihvdro-isoindol-2-yl)-2- (1 ,4,7,1 Otétraaza-cvclododéc-1 -yl)-pentanoiαue
abondamment à l'acétonitrile. Obtention de 138 g de produit sous forme d'une poudre. CCM : CH 2 CI 2 / MeOH / NH 4 OH à 25% (80/40/3) Révélation UV et CuSO 4 Rf : 0,3
Etape 2 : Ester benzylique de l'acide 5-(1 ,3-Dioxo-1 ,3-dihvdro-isoindol-2-yl)-2- (4,7,10-tris-éthoxycarbonylméthyl-1 ,4,7,1 Otétraaza-cyclododéc-1 -yl)- pentanoique
A une solution de 59,1 g d'ethylbromoacétate (Aldrich®, 358 mmol) dans le CH 3 CN (1 ,1 I), sont additionnées 60 g du composé obtenu à l'étape 1 (102 mmol) et 50,1 g de Na 2 CO 3 (464 mmol). Le milieu réactionnel est chauffé à 80^ sous couverture d'argon pendant une nuit. Après élimination du précipité, le filtrat est concentré et lavé abondamment au CH 3 CN. Le produit est cristallisé dans CH 3 CN par ajout goutte à goutte d'Et 2 O. Obtention de 89,8 g de produit sous forme d'un solide blanc. CCM : CH 2 CI 2 / MeOH (9/1 ). Révélation UV et KMnO 4. Rf : 0,4
Etape 3 : Acide 5-Amino-2-(4,7,10-tris-carboxyméthyl-1 ,4,7,1 Otétraaza- cvclododéc-1 -yl) -pentanoique
Dans le réacteur de 5 litres, on chauffe au reflux une solution de 54 g de composé obtenu à l'étape 2 (64 mmol) dans l'acide chlorhydrique 37 % (1 ,8 I), pendant une nuit. Après refroidissement et filtration, le filtrat est concentré et purifié sur silice silanisée
(élution à l'eau). Après évaporation sous pression réduite, le produit est lavé à l'éther. Obtention de 45 g de produit sous forme d'un solide blanc. Le produit est désalifié par passage sur résine OK. On isole 30 g de produit sous forme de cristaux blancs. HPLC : Hypercarb® 5μ, 200X4,6, 250â
Solvant A : acide sulfurique 0,037 N ; Solvant B : CH 3 CN ; Détection UV à 201 nm ;
Tr : 18 min.
Etape 4 : Complexe de qadolinium de l'Acide 5-Amino-2-(4,7,10-tris- carboxyméthyl-1 ,4,7,1 Otétraaza-cvclododéc-1 -yl) -pentanoique
Formule III
7,2 g du composé obtenu à l'étape 3 (16 mmol) sont dissous dans 70 mL d'eau et le pH est ajusté à 5,5 par ajout d'acide chlorhydrique 6 N. On ajoute 2,9 g de Gd 2 O 3 (8 mmol), et chauffe à 80°C le milieu réactionnel. Le pH de la solution augmente régulièrement, et doit être maintenu entre 5,2 et 5,7 par ajout goutte à goutte d'acide chlorhydrique 6 N. Après deux heures, le pH se stabilise à 5,7. Le léger trouble est filtré sur filtre Whatman® et le filtrat est concentré. Obtention de 1 1 ,1 g de produit sous forme de paillettes blanches. HPLC : Hypercarb® 5μ, 200X4,6, 250â.Solvant A : acide sulfurique 0,037 N. Solvant B : CH 3 CN. Détection UV à 201 nm. Tr : 10 min.
Etape 5 : Complexe de qadolinium de l'Acide 5-(2-Ethoxy-3,4-dioxo- cvclobut-1 -énylamino)-2-(4,7,10-tris-carboxyméthyl-1 ,4,7,1 Otétraaza-cvclododéc-1 -yl)- pentanoique
8 g de composé obtenu à l'étape 4 sont séchés par distillation azéotropique au toluène, puis mis en suspension dans 90 ml de DMSO anhydre sous couverture d'argon. 2,8 ml de Et 3 N séchée sur tamis (1 ,7 éq) et 5 g de diéthylsquarate (Aldrich®, 2,5 éq.) sont ensuite ajoutés. Le milieu est agité à température ambiante sous couverture d'argon pendant 1 heure. Le mélange est précipité dans 600 ml d'éther. Le solide obtenu est filtré, puis lavé au dichlorométhane. Après filtration et séchage, 7,5 g d'un solide blanc
(rendement de 81 ,5 %) sont récupérés. HPLC : Symmetry C18, 5 , 250X4,6, 100â. A : eau TFA, pH = 2,7. B : CH 3 CN. Détection à 201 et 254 nm. Tr : 19,8 min.
Exemple 3 :
Etape 1 : couplage
Etape 2 : déprotection des terButyles
Le composé obtenu à l'étape 1 est dissous dans un mélange de 10 cm 3 de TFA/TIS/H 2 O dans les proportions 90/5/5. Le milieu est agité 5h à température ambiante puis le solvant est évaporé sous pression réduite. Le résidu est repris dans l'éther éthylique et le précipité est filtré puis séché. Le produit est ensuite purifié par HPLC préparative sur une colonne Symmetry® avec un éluant constitué d'eau/TFA PH 3/ CH 3 CN . m /z : ES + 1381
Exemple 4 :
Etape 1 : couplage
heures et le pH est maintenu à environ 6 par ajout de quelques gouttes de NaOH 2N. Purification : Le milieu réactionnel est précipité dans 250 ml_ d'acétone. Le produit est filtré et le solide blanc obtenu est séché sur P 2 O 5 . SM : ES+, IWZ= 1702 avec z=1
Etape 2 : déprotection
Selon le mode opératoire de l'étape 2 de l'exemple 3 au départ du composé obtenu à l'étape 1. SM : ES+, M/Z= 1202 avec z=1
Exemple 5 :
Etape 1 : Ester méthylique de l'acide (13-Bromo-6,9-bis- éthoxycarbonylméthyl-3,6,9,15-tétraaza-bicyclo[9.3.1]pent adéca-1 (14),11 (15),12-trièn- 3-yl)-acétique
22 g de 13-bromo-3,6,9,15-tétraazabicyclo[9.3.1.]pentadéca-1 (15),11 ,13-triène obtenus selonJ. Heterocyclic Chem. 27, 1990, pages 167-169, sont introduits dans 440 ml de CH 3 CN en présence de 48 g de K 2 CO 3 calciné et le mélange est maintenu à 80° C pendant 1 h avant l'addition d'une solution de 50 g de Bromoacétate d'éthyle dans 100 ml de CH 3 CN ; le milieu réactionnel est alors agité 20 h à 80° C puis refroidi à température ambiante, filtré et le solvant est évaporé. Le résidu est repris par 500 ml d'une solution aqueuse de HCI 1 N en présence d'un volume d'éther diéthylique. Après
séparation de la phase organique, la phase aqueuse est neutralisée par NaHCO 3 puis extraite par CH 2 CI 2 . Après lavage à l'eau puis séchage sur sulfate de magnésium, la phase organique est concentrée et le résidu est purifié sur colonne de silice (Merck ® 500 g, d = 10 cm) en éluant par CH 3 COOC 2 H 5 . m = 20.9 g ; m /z : ES+ 544,6
Etape 2: Ester éthylique de l'acide [13-(3-tert-Butoxycarbonylamino-propènyl)-
6,9-bis-éthoxycarbonylméthyl-3,6,9,15-tétraaza-bicvclo r9.3.11pentadéca-
1 (14),11 (15).12-trièn-3-yll -acétique
Après extraction de la solution aqueuse par CH 2 CI 2 , la phase organique séchée sur sulfate de magnésium est évaporée. On obtient une huile marron qui est chromatographiée sur gel de silice, m = 2,8 g. m /z : ES+ 621
Etape 3: Ester éthylique de l'acide ri 3-(3-tert-Butoxycarbonylamino-propyl)-6,9- bis-éthoxycarbonylméthyl-3,6,9,15-tétraaza-bicvclor9.3.11 pentadéca-
1 (14),11 (15).12-trièn-3-vll-acétique
A 2 g du composé obtenu à l'étape b) dissous dans 80 ml de CH 3 OH, on ajoute 200mg de catalyseur charbon palladié à 10% puis le milieu réactionnel est agité durant 2 h 30 à 20° C sous 4.10 5 Pa d'hydrogène. Après filtration sur Clarcel ® , le solvant est évaporé et on obtient 1 ,8 g d'huile après chromatographie sur gel de silice, m /z : ES+ 623
Etape 4: Acide ri3-(3-tert-Butoxycarbonylamino-propyl)-6,9-bis-carboxyméth yl- 3,6,9,15-tétraaza-bicvclor9.3.11pentadéca-1 (14),1 1 (15),12-trien-3-yl1-acétiαue
1 g du composé obtenu à l'étape c) dissous dans 20 ml d'une solution aqueuse de
NaOH 5N et 20 ml de CH 3 OH sont chauffés à 70° C pendans 18 h. Après concentration du milieu réactionnel, le résidu est repris dans l'eau et la solution, amenée à pH 5,5-6 par quelques gouttes d'acide acétique, est concentrée avant d'être purifiée par chromatographie sur une colonne (d = 15 cm) contenant 50 g de silice silanisée (Merck ® 0,063 - 0,200 μm) en éluant à l'eau. Après concentration à sec on obtient 480mg de cristaux blancs, m /z : ES- 536,5
Etape 5: Complexe de αadolinium de l'acide π 3-(3-tert-Butoxycarbonylamino- propyl)-6,9-bis-carboxyméthyl-3,6,9,15-tétraaza-bicvclor9. 3.11pentadéca-1
(14).1 1 (15).12-trièn-3-yll-acétiαue
300mg du composé obtenu à l'étape d) sont dissous dans 10 ml d'eau puis on ajoute en une fois 100mg de Gd 2 O 3 et l'ensemble est chauffé à 60° C durant 3 h 45 min en maintenant le pH entre 5,5 et 6 par addition d'une solution aqueuse de NaOH 1 N. Après filtration, le milieu réactionnel est évaporé et le résidu est cristallisé dans l'éthanol. Après traitement par une résine Chelex ® 100 (Bio-Rad) on obtient 320mg de cristaux blancs, m /z : ES- 691
Etape 6 : Complexe de qadolinium de l'acide ri3-(3-Amino-propyl)-6,9-bis- carboxyméthyl-3.6.9.15-tétraaza-bicvclor9.3.1lpentadéca-1 (14).1 1 (15).12-trièn-
Formule V
On maintient 3 h sous agitation une solution de 300mg du complexe obtenu à l'étape e) dans 18ml de CF 3 COOH à 25° C avant d'éliminer le liquide sous pression réduite. Le résidu est repris dans l'éther diéthylique et la suspension filtrée. Après élimination du solvant, le résidu est introduit par portions dans une suspension d'au moins 1 ml de
résine anionique faible (OH ) dans 5 ml d'eau ; en fin d'addition le pH, stable, doit être de 8 à 8,5. La résine est alors séparée par filtration, le solvant éliminé et le résidu précipité par addition d'éther éthylique.m= 200mg. m /z : ES+ 593
Exemple 6 :
Etape 1 : couplage
Selon le mode opératoire de l'étape 1 de l'exemple 4 au départ de 10Omg du complexe de gadolinium préparé à l'étape 6 de l'exemple 5 et 102 mg de l'ester terbutilyque de l'acide 1 1 -(4-Carboxy-butyl)-1 ,4,8,11tétraaza-cyclotétradécane-1 ,4,8-tricarboxylique préparé selon les données de la littérature (J. of Médicinal chemistry, 1999, vol 42, n°2 p229-241 ). m /z : ES+ 1176
Etape 2 : déprotection
Selon le mode opératoire de l'étape 2 de l'exemple 4 au départ du composé obtenu à l'étape 1. m /z : ES+ 875
Exemple 7 :
Etape 1 : couplage
Selon le mode opératoire de l'étape 1 de l'exemple 4 au départ de 10Omg du complexe de gadolinium préparé à l'étape 6 de l'exemple 5 et 104 mg de l'ester terbutilyque de l'acide 11 -(4-Carboxy-butyryl)-1 ,4,8,11tétraaza-cyclotétradécane-1 ,4,8- tricarboxylique préparé selon les données de la littérature (J. of Médicinal chemistry, 1999, vol 42, n°2 p229-241 ). m /z : ES+ 1190
Etape 2 : déprotection
Selon le mode opératoire de l'étape 2 de l'exemple 4 au départ du composé obtenu à l'étape 1. m /z : ES+ 889
Exemple 8 :
Couplage du composé obtenu à l'étape 2 de l'exemple 1 avec les complexes bimétalliques décrits dans le brevet WO2004/112839. - exemple n°3 pages 93-94 et 91 à 93 de formule Vl :
-exemple 6 p 98 à 101 , et 96 à 98 de formule VII
Formule VII
Avec AAG 1 AA28=
Etape 1 : Couplage
300mg d'un composé bimétallique précédemment décrit (formule Vl ou VII), sont dissous dans 2 ml d'eau. Le pH est amené à 9,5 par addition de Na 2 CO 3 . 1 ,2 équivalent du composé décrit étape 2 de l'exemple 1 (formule II) sont ajoutés. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante pendant 3 jours puis est précipité dans l'éthanol.
Etape 2 : déprotection
Le composé obtenu selon l'étape 1 est dissous dans 10ml du mélange acide trifluoroacétique/eau/triisopropylsilane (90/5/5). Après 4h à température ambiante sous agitation, le TFA est éliminé par évaporation sous vide. Le milieu réactionnel est précipité dans l'éther. Le produit obtenu par filtration est ensuite purifié par HPLC préparative. HPLC : Colonne Superpher Select B ® ;eau-TFA pH 3 / CH 3 CN
Formule VIII
Formule IX
Exemple 9: Synthèse de cyclopeptides de formules X,
Formule X
Le peptide a été préparé selon la méthode décrite dans J.Of Médicinal chemistry, 2005, vol.48, N°9, p3280-3289. La synthèse sur phase solide a été réalisée sur résine Chlorotrityle en utilisant des aminoacides protégés par le groupement Fmoc.
La tyrosine utilisée dans la publication originale a été remplacée par un analogue substitué de formule :
Ce composé a été préparé selon la méthode décrite dans Tetrahedron Letters vol.36, N° 35, p6193-6196, 1995.
Exemple 10: Couplage du cyclopeptide de formule X sur des nanoparticules d'oxyde de Fe .
Les nanoparticules ont été préparées selon les méthodes décrites dans le brevet WO2004/058 275 (US 2004/253181 ) exemples 8 et 9 pour la préparation des solutions colloïdales de particules magnétiques et exemples 10 à 12 pour la complexation des particules magnétiques par un revêtement gembisphonate de l'exemple 1 de WO2004/058 275.
Le couplage se fait de manière analogue à celui décrit pour les exemples 13 à 15 du WO2004/058 275 . A 50 cm 3 de solution de nanoparticule d'oxyde de Fer sont ajoutés progressivement en maintenant le PH vers 7 une solution de 100mg de peptide de formule X et 110mg d'EDCI (1 -(3-diméthylaminopropyl)-3-éthylcarbodiimide chlorhydrate). Le pH de la solution est ramené à 6,5 par NaOH (0,1 N). La solution est Agitée puis. Filtrée sur une membrane de porosité 0,22μm (STERICUP Millipore®).La solution est ensuite Ultrafiltrée sur membrane de 30KD. [Fe] = 0,250 IWL Taille PCS = 28nm Taux de greffage [ composé A / Fe ] = 1 ,65 % mole/mole Taux de greffage [Peptide/ composé A ] = 31 %
Exemple 11 :
Couplage de l'aminé R-NH2, N-N'-[bis(2,3,4,5,6-pentahydroxyhexyl)] 2,4,6-tribromo 5- (glycylamino)isophtlamide formule :
A 50 cm 3 de solution obtenue exemple 10 à température ambiante est ajouté une solution constituée de 2,5 g de l'aminé R-NH2 dans 10 cm3 d'eau. Le PH est ajusté à 7
par ajout de NaOH 0,1 M. 1 g d'EDCI est ajouté et la solution est agitée 3h à température ambiante. Le PH est ajusté à 7 et le mélange est agité 1 nuit à température ambiante. Après filtration sur une membrane de porosité 0,22μm, la solution est ultrafiltrée sur une membrane de seuil de coupure 30KD. [Fe] = 0,228 M/L Taille PCS = 28,3nm
Taux de greffage [ composé A / Fe ] = 1 ,62% mole/mole
Taux de greffage [Peptide/ composé A ] = 32 %
Taux de greffage [R-NH2/ composé A ] = 62 %
Exemple 12:
Couplage de l'aminoPEG 750 ( O-(2-aminoéthyl)-O'-méthylpolyéthylèneglycol 750 FLUKA®)
A 50 cm 3 de solution obtenue exemple 10 à température ambiante est ajouté une solution constituée de 2 g de l'aminoPEG 750 dans 10 cm3 d'eau. Le PH est ajusté à 7 par ajout de NaOH 0,1 M. 1 g d'EDCI est ajouté et la solution est agitée 3h à température ambiante. Le PH est ajusté à 7 et le mélange est agité 1 nuit à température ambiante. Après filtration sur une membrane de porosité 0,22μm, la solution est ultrafiltrée sur une membrane de seuil de coupure 30KD.
[Fe] = 0,212 M/L Taille PCS = 27,8nm
Taux de greffage [ composé A / Fe ] = 1 ,70% mole/mole Taux de greffage [Peptide/ composé A ] = 30 % Taux de greffage [R-NH2/ composé A ] = 62 %
Le demandeur a mis au point les protocoles biologiques suivants pour mesurer l'efficacité des produits.
Affinité / spécificité in vitro pour CXCR-4 : TEST biologique N°1 : test de fixation basé sur une reconnaissance, par l'entité signal vectorisée, d'une cellule exprimant la protéine cible (HL-60). La spécificité de reconnaissance est évaluée grâce à des expériences de compétition montrant un rôle inhibiteur direct d'un excès de vecteur libre sur la fixation du prototype testé. La spécificité est également être validée par
comparaison avec des dosages obtenus avec la molécule de référence non vectorisée. La cible cellulaire choisie est la cellule pro-myéloïde humaine HL-60 décrite dans la littérature comme fortement positive pour CXCR-4 [R. Mόhle et al. : « The chimiokine receptor CXCR-4 is expressed on CD34+ hematopoietic progenitor and leukemic cells and médiates transendothelial migration induced by stromal cell-derived factor-1 » Blood 12 : 4523-4530 (1998)]. Modèle de fixation sur cellules HL-60 : Cellules : HL-60
Délais : Temps d'incubation en présence du produit test : cinétique de 0,5h à 4 h à 37 < €.
Contrôles : Vérification du taux d'expression en CXCR-4 des HL-60 par cytométrie en flux.
Incubation des cellules en présence de la molécule de référence non vectorisée. Spécificité : Inhibition de la fixation des prototypes par un excès de vecteur libre ou comparaison avec les résultats obtenus avec la molécule de référence non vectorisée. Résultats : Quantités de Fe ou de Gd présentes dans les culots cellulaires après dosage par ICP-AES ou ICP-MS respectivement (quantités rapportées en million de cellules ou en mg de protéines).
L'analyse des résultats prend en compte la quantité de Fe ou de Gd trouvée avec les particules vectorisées rapportée à celle détectée :
1/ en présence du contrastophore non vectorisé
2/ en présence du prototype vectorisé et d'un excès de ligand (x100). Ces résultats permettent de déterminer l'apport du vecteur sur le mécanisme de reconnaissance et la spécificité de reconnaissance est étudiée par les expériences de compétition avec excès de vecteur libre.
Affinité / spécificité in vitro pour CXCR-4 : TEST biologique N°2 : test de fixation basé sur une reconnaissance, par l'entité signal vectorisée, d'une cellule exprimant la protéine cible avec, comme contrôle, la même cellule mais négative pour le récepteur.
La spécificité de reconnaissance est évaluée grâce à des expériences comparant les
résultats obtenus sur cellules positives à ceux obtenus sur cellules négatives. La cible cellulaire choisie est la cellule CHO (Chinese Hamster Ovary) négative pour l'expression de CXCR-4.
Modèle de fixation / internalisation sur cellules CHO :
Cellules : CHO positives et négatives pour le récepteur humain CXCR-4
Délais : Temps d'incubation en présence du produit test : cinétique de 0,5h à 2 h à
37 < €.
Contrôles : Incubation des cellules en présence de la molécule de référence non vectorisée. Spécificité : Comparaison des différents groupes (cellules CHO positives et négatives/produit vectorisé et produit de référence)