TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungs fehlern eines optischen Systems, das ein Objektiv und eine adaptive Optik im Strahlengang durch das Objektiv aufweist. Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Laser-Scanning- Mikroskop mit einer ersten Lichtquelle für Anregungslicht, einer zweiten Lichtquelle für Stimula tionslicht, einem Objektiv und einer Korrekturvorrichtung zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern, die eine adaptive Optik im Strahlengang durch das Objektiv umfasst.

Die aberrationsinduzierten Abbildungsfehler können einerseits auf das optische System selbst zurückzuführen sein, wenn dieses beispielsweise nicht ausreichend achromatisch ist. Anderer- seits kann auch ein vor einem Fokusbereich des optischen Systems liegender Bereich einer Probe die zugrunde liegende Aberration verursachen.

Die zu korrigierenden aberrationsinduzierten Abbildungsfehler des optischen Systems wirken sich sowohl beim Projizieren einer Lichtintensitätsverteilung mit dem Objektiv in die jeweilige Probe als auch beim Abbilden der Probe mit dem Objektiv aus.

STAND DER TECHNIK

Aus Wei Yan, et al.: Coherent optical adaptive technique improves the spatial resolution of STED microscopy in thick samples, Photonics Research, Vol. 5, No. 3, Juni 2017, ist eine Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern bekannt, die auf Inhomogenitäten der optischen Eigen schaften einer Probe, insbesondere einer dickeren Probe, zurückzuführen sind. Angewandt wird dabei ein COAT (Coherent Optical Adaptive Technique) genanntes Verfahren, bei dem die Phasenverzerrung durch die jeweilige Probe gemessen und kompensiert wird. Sowohl für das Messen als auch für das Kompensieren der Phasenverzerrung wird ein SLM (Spatial Light Modulator) verwendet, mit dem in der STED-Mikroskopie zudem die Phasenfronten von Stimulationslicht so moduliert werden, dass das in die Probe fokussierte Stimulationslicht eine Donut-förmige Intensitätsverteilung aufweist. Die Phasenverzerrung durch die Probe wird gemessen, indem einem Strahl von Stimulationslicht mit dem SLM ein Phasenmuster aufgeprägt wird, bei dem die Phasenverschiebung in verschiedenen Bereichen mit unterschiedlichen Fre quenzen moduliert wird, wobei die Intensität eines Spots, zu dem der Strahl des Stimulationslichts anschließend fokussiert wird, zeitaufgelöst registriert und durch Fouriertransformation analysiert wird. Praktisch wird so nach den Phasenversätzen in den einzelnen Bereichen des mit dem SLM aufgeprägten Phasenmusters gesucht, die die aberrationsinduzierten Abbildungsfehler kompen sieren. Konkret wird die Intensität des Spots durch Abtasten eines Gold-Nanopartikels mit dem Spot und durch Registrieren des von diesem gestreuten Stimulationslichts erfasst. Entsprechend muss das jeweilige STED-Mikroskop in einem Streulichtmodus betrieben und der Gold- Nanopartikel an dem Ort der jeweiligen Probe angeordnet werden, für den die aberrations induzierten Abbildungsfehler kompensiert werden sollen. Praktisch wurden die Gold-Nanopartikel nur an der Oberseite und der Unterseite einer Probe angeordnet, um die Funktionsweise des Verfahrens zu demonstrieren. Aus der WO 2014/029978 A1 ist ein Verfahren zum Korrigieren von Aberrationen in der STED- Mikroskopie mit Hilfe einer adaptiven Optik bekannt, bei dem eine Metrik verwendet wird, die Bildschärfe und Bildhelligkeit kombiniert. Durch Ansteuern eines Lichtmodulators, bei dem es sich um einen SLM oder einen verformbaren Spiegel handelt, wird diese Metrik maximiert oder minimiert. Die Bildschärfe kann erst nach dem Abbilden der Probe in ein Bild bestimmt werden. Die Bildhelligkeit hängt von der Konzentration und der Dichte von Fluoreszenzmarkern ab, mit denen eine interessierende Struktur in der Probe markiert ist. Das jeweilige Maximum oder Minimum der die Bildhelligkeit und die Bildschärfe kombinierenden Metrik hat daher nur lokale Aussagekraft und ist nicht mit anderen Maxima oder Minima in anderen Bereichen der Probe vergleichbar. Aus Yifan Wang et al.: A 3D Aligning Method for Stimulated Emission Depletion Microscopy Using Fluorescence Lifetime Distribution, Microscopy Research and Technique 77:935-940, August 2014 ist ein Verfahren zum aufeinander Ausrichten eines Donut-förmigen Stimulationslichtfokus mit einem spotförmigen Anregungslichtfokus bekannt, bei dem ein Versatz zwischen einem STED-Bild und einem Lebensdauerbild einer fluoreszenten Nanoperle bestimmt und beseitigt wird. Konkret wird dazu der Versatz zwischen dem Schwerpunkt einer normalisierten räumlichen Intensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts von der Nanoperle und dem Schwerpunkt einer normalisierten räumlichen Lebensdauerintensitätsverteilung des Fluoreszenzlichts von der Nano perle bestimmt und ausgeglichen.

Aus der WO 2018/042056 A1 ist es zum Einstellen einer korrekten Justierung eines STED- Mikroskops, in der ein Intensitätsmaximum von Anregungslicht und ein Intensitätsminimum von STED-Licht im Fokus eines Objektivs zusammenfallen, bekannt, eine mit einem Fluoreszenz- farbstoff markierte Struktur in einer Probe mit dem Intensitätsmaximum des Anregungslichts abzutasten, um Bilder der Probe mit Abbildern der Struktur mit unterschiedlichen Intensitäten des Fluoreszenzverhinderungslichts zu erzeugen. Dann wird zwischen Lagen der Abbilder der Struktur in den erzeugten Bildern ein Versatz berechnet und ausgeglichen.

AUFGABE DER ERFINDUNG Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern eines optischen Systems und ein Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Objektiv und einer Korrekturvorrichtung zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungs fehlern aufzuzeigen, die eine Korrektur der Abbildungsfehler für unterschiedliche Bereiche einer Probe während der laufenden Verwendung des Abbildungssystems bzw. des Laser-Scanning- Mikroskops zum Messen bzw. Abbilden der jeweiligen Probe ermöglichen.

LOSUNG

Die Aufgabe der Erfindung wird durch Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 , 3 und 7 und durch ein Laser-Scanning-Mikroskop mit den Merkmalen des Patentanspruchs 21 gelöst. Dabei ist das Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 7 das Äquivalent im Frequenzraum zu dem Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1. Die abhängigen Patentansprüche 2, 4 bis 6 und 8 bis 20 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungs gemäßen Verfahrens, und Patentanspruch 22 ist auf eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops gerichtet. BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung nutzt eine Metrik, welche ein Maß für die Güte des Fokus bei der Beleuchtung einer Probe mit Licht darstellt. Mit Hilfe dieser Metrik können Aberrationen, wie sie z.B. in der Mikroskopie auftreten können, korrigiert werden. Dies ist möglich, indem die Verteilung des Lichts zur Beleuchtung der Probe mit einer adaptiven Optik so angepasst wird, dass die Metrik optimiert wird. Dazu wird die Probe zunächst mit gegebener Einstellung der adaptiven Optik mit dem Licht beleuchtet, wodurch ein Messsignal von der Probe beeinflusst wird, indem das Licht zum Beispiel zur Emission von Fluoreszenzstrahlung führt. Anschließend wird das Messsignal zeitaufgelöst detektiert und für die nachfolgende Berechnung in mindestens einen frühen und einen spätem Zeitraum unterteilt. Aus dem Verhältnis der Messwerte des Messsignals zu den beiden Zeiträumen, zum Beispiel dem Verhältnis von frühen und späten Photonen des Fluoreszenzlichts wird eine Maßzahl berechnet, welche ein Maß für die Güte des Fokus darstellt. Diese Maßzahl wird durch wiederholte Anpassung der adaptiven Optik, z. B. eines adaptiven Spiegels optimiert, wodurch die Aberrationen korrigiert werden. Eine äquivalente Maßzahl kann im Frequenzraum bestimmt werden.

Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungs fehlern eines optischen Systems, das ein Objektiv und eine im Strahlengang durch das Objektiv angeordnete adaptive Optik aufweist, werden Licht und eine Probe so ausgewählt, dass das Licht beim Einwirken auf die Probe ein Messsignal aus der Probe entweder reduziert oder von unten an einen Sättigungswert annähert, wobei eine relative Änderung des Messsignals von einer Intensität des Lichts abhängt. Das aus einem Fokusbereich des optischen Systems in der Probe stammende Messsignal wird über einen ersten Zeitraum erfasst, um einen ersten Messwert zu bestimmen, und über einen zweiten Zeitraum, um einen zweiten Messwert zu bestimmen. Über einen dritten Zeitraum wird das ausgewählte Licht mit dem optischen System in den Fokusbereich in der Probe fokussiert. Dabei liegt der erste Zeitraum zumindest teilweise früher als der zweite Zeitraum und/oder der zweite Zeitraum zumindest teilweise später als der erste Zeitraum, und der dritte Zeitraum überlappt zumindest teilweise zeitlich mit dem ersten Zeitraum und/oder dem zweiten Zeitraum und/oder einem dazwischen liegenden Zwischenzeitraum. Aus dem ersten Messwert und dem zweiten Messwert wird eine Maßzahl, die eine streng monoton steigende oder fallende Funktion der relativen Änderung des Messsignals ist, bestimmt und beim Ansteuern der adaptiven Optik als Metrik verwendet wird, die durch Ändern der Ansteuerung zu optimieren ist. Bei der Durchführung dieses erfindungsgemäßen Verfahrens wirken sich die zu korrigierenden aberrationsinduzierten Abbildungsfehler beim Fokussieren des ausgewählten Lichts mit dem optischen System in den Fokusbereich in der Probe aus. Wenn die bei diesem Fokussieren auftretenden Abbildungsfehler korrigiert sind, sind sie auch dann korrigiert, wenn der Fokusbereich mit dem Abbildungssystem abgebildet wird.

Die zu korrigierenden aberrationsinduzierten Abbildungsfehler haben dann, wenn das ausge wählte Licht in dem dritten Zeitraum mit dem optischen System in den Fokusbereich in der Probe fokussiert wird, die Auswirkung, dass die Intensität des ausgewählten Lichts gegenüber ihrem Maximalwert ohne die zu korrigierenden aberrationsinduzierten Abbildungsfehler, d. h. die soge- nannte Strehl-Zahl, reduziert ist. Entsprechend ist auch die durch das ausgewählte Licht bewirkte relative Änderung des Messsignals von der Probe reduziert.

Die obigen relativen Definitionen des ersten, zweiten und dritten Zeitraums haben zur Folge, dass der erste Messwert weniger stark von dem in dem dritten Zeitraum in den Fokusbereich fokussierten ausgewählten Licht beeinflusst ist, als der zweite Messwert. Durch die obige Auswahl des Lichts und der Probe und die obigen relativen Definitionen des ersten, zweiten und dritten Zeitraums zueinander hängen der erste und der zweite Messwert in gleicher Weise von lokalen Eigenschaften der Probe in dem jeweiligen Fokusbereich ab. Daher führt zum Beispiel die Bestimmung der Maßzahl durch Bildung eines Quotienten aus dem als Integral des Messsignals über den zweiten Zeitraum bestimmten zweiten Messwert und dem als Integral des Messsignals über den ersten Zeitraum bestimmten ersten Messwert zu einer Normierung auf einen Anfangswert des Messsignals, d. h. zu einer Unabhängigkeit von der absoluten Höhe, d. h. dem Pegel des Messsignals. Von der Intensität des ausgewählten Lichts in dem Fokusbereich bleibt diese Maßzahl aber abhängig.

Somit ist die Maßzahl über schwankende Pegel des Messsignals hinweg vergleichbar. Dies bedeutet, dass die Maßzahl über aneinander angrenzende Bereiche einer Probe hinweg optimiert werden kann, auch wenn der Pegel des Messsignals über diese aneinander angrenzenden Bereiche der Probe schwankt. Dadurch kann die Maßzahl insbesondere beim Abtasten der Probe mit dem Fokusbereich fortlaufend optimiert werden. Die Optimierung der Maßzahl ist nicht nur bei einer über die Änderungen der Ansteuerung der adaptiven Optik hinweg gleichbleibenden Lage des Fokusbereichs in der Probe möglich. Dies bedeutet jedoch nicht, dass die erfindungs gemäß zu optimierende Metrik, d. h. die Maßzahl für alle Lagen des Fokusbereichs in einer Probe denselben Wert aufweist. Dies ist vielmehr sicher nicht der Fall, weil die Probe selbst Ursache von Aberrationen ist, die zumindest in axialer Richtung längs der optischen Achse des Objektivs, d. h. über die Tiefe der Probe variieren werden. Zwischen einander lateral benachbarten Lagen des Fokusbereichs in der Probe wird die optimierte Maßzahl jedoch nur wenig schwanken, so dass eine Optimierung für eine unmittelbar benachbarte Lage des Fokusbereichs in der Probe mit der Ansteuerung der adaptiven Optik beginnen kann, die bei der früheren Lage des Fokus bereichs zu der Optimierung der erfindungsgemäßen Metrik geführt hat.

Dass die Abhängigkeit von der Intensität des ausgewählten Lichts in dem Fokusbereich durch die Bestimmung der Maßzahl nicht verloren geht, ist dadurch sichergestellt, dass sowohl dann, wenn das ausgewählte Licht das Messsignal reduziert, als auch dann, wenn das ausgewählte Licht das Messsignal von unten an den Sättigungswert annähert, der erste und der zweite Messwert beide weder linear noch mit einer anderen gleichen Potenz ungleich null unmittelbar von der Intensität des ausgewählten Lichts abhängen.

Daraus folgt, dass die Maßzahl bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entweder mit der Intensität des ausgewählten Lichts in dem Fokusbereich ansteigt oder abfällt. Entsprechend ist die Maßzahl als durch Ansteuern der adaptiven Optik zu optimierende Metrik zu maximieren oder zu minimieren, um die Intensität des Lichts in dem Fokusbereich zu maximieren. Diese maximale Intensität wird genau dann erreicht, wenn die aberrationsinduzierten Abbildungsfehler beseitigt sind. Deshalb ist die Maßzahl bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als durch Ändern der Ansteuerung der adaptiven Optik zu optimierende Metrik geeignet, um das Ziel der Korrektur der aberrationsinduzierten Abbildungsfehler zu erreichen.

Die schon als Beispiel angegebene Bildung eines Quotienten aus dem als Integral des Messsignals über den zweiten Zeitraum bestimmten zweiten Messwert und dem als Integral des Messsignals über den ersten Zeitraum bestimmten ersten Messwert, die zu einer Normierung auf den Anfangswert des Messsignals führt, ist zum Beispiel dann zur Bestimmung der Maßzahl geeignet, wenn das ausgewählte Licht das Messsignal aus der Probe reduziert. Aber auch der Kehrwert dieses Quotienten ist bei dieser Auswirkung des ausgewählten Lichts auf das Mess signal als Maßzahl geeignet, die dann aber nicht minimieren, sondern zu maximieren ist. Wenn das ausgewählte Licht das Messsignal aus der Probe von unten an einen Sättigungswert annähert, ist eine Normierung einer absoluten Änderung des Messsignals auf den Sättigungswert vorteilhaft, um die Maßzahl zu bestimmen. Diese Normierung kann näherungsweise dadurch erfolgen, dass die Bestimmung der Maßzahl durch Bildung eines Quotienten aus dem ersten Messwert und dem zweiten Messwert erfolgt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren muss die aus dem ersten Messwert und dem zweiten Messwert bestimmte Maßzahl, die als durch Ändern der Ansteuerung der adaptiven Optik zu optimierende Metrik verwendet wird, aber kein Quotient, insbesondere kein direkter Quotient dieser beiden Messwerte sein. So ist es grundsätzlich unschädlich, wenn der Nenner oder Zähler des Quotienten noch einen weiteren Faktor, der mit dem Messwert multipliziert wird, oder einen Offset, der zu dem Messwert addiert wird, aufweist. Weiterhin kann der Nenner eine Differenz und/oder der Zähler des Quotienten eine Summe der Messwerte aufweisen oder umgekehrt. Ganz allgemein ist jede Maßzahl geeignet, die eine streng monoton steigende oder fallende Funktion der relativen Änderung des Messsignals ist. Dabei versteht es sich, dass diese Funktion nur im relevanten Bereich der auftretenden Messwerte diese Eigenschaften haben muss.

Jede solche Maßzahl erreicht bei derselben Ansteuerung der adaptiven Optik ein Extremum wie der direkte Quotient aus dem als Integral des Messsignals über den zweiten Zeitraum bestimmten zweiten Messwert und dem als Integral des Messsignals über den ersten Zeitraum bestimmten ersten Messwert. Grundsätzlich vorteilhaft ist es, wenn die Maßzahl eine stetige und damit injektive Funktion der relativen Änderung des Messsignals ist. Dies ist aber keinesfalls erforderlich.

Beim Ändern der Ansteuerung der adaptiven Optik zur Optimierung der erfindungsgemäßen Metrik kann konkret wie folgt vorgegangen werden. Es wird eine alte Maßzahl aus dem ersten Messwert und dem zweiten Messwert bestimmt. Die Ansteuerung der adaptiven Optik wird in einer Änderungsrichtung geändert. Das Messsignal wird erneut über einen gleichen ersten Zeitraum und einen gleichen zweiten Zeitraum erfasst, wobei das Licht über einen gleichen dritten Zeitraum in den Fokusbereich in der Probe fokussiert wird, um einen neuen ersten Messwert und einen neuen zweiten Messwert zu bestimmen. Aus dem neuen ersten Messwert und dem neuen zweiten Messwert wird eine neue Maßzahl bestimmt, und ein Unterschied zwischen der neuen Maßzahl und der alten Maßzahl wird bestimmt. Abhängig von der Richtung des Unterschieds wird die Ansteuerung der adaptiven Optik erneut in der bisherigen oder einer anderen, d. h. insbe sondere in einer zu der bisherigen Änderungsrichtung entgegengesetzten Änderungsrichtung geändert. Wenn die erfindungsgemäße Metrik aufgrund der zugrunde liegenden Abhängigkeit der Änderung des Messsignals von der Intensität des ausgewählten Lichts zu maximieren ist, ist dann, wenn die neue Maßzahl größer ist als die alte Maßzahl, die Ansteuerung der adaptiven Optik erneut in der bisherigen Änderungsrichtung zu ändern, und dann, wenn die neue Maßzahl kleiner ist als die alte Maßzahl, ist bei erneuter Änderung der Ansteuerung der adaptiven Optik die Änderungsrichtung zu wechseln. Bei einer zu minimierenden erfindungsgemäßen Metrik verhält es sich umgekehrt. Die Schritte des erneuten Erfassens des Messsignals über einen gleichen ersten Zeitraum und einen gleichen zweiten Zeitraum, wobei das Licht über einen gleichen dritten Zeitraum in den Fokusbereich in der Probe fokussiert wird, um einen neuen ersten Messwert und einen neuen zweiten Messwert zu bestimmen, des Bestimmens einer neuen Maßzahl aus dem neuen ersten Messwert und dem neuen zweiten Messwert, des Bestimmens eines Unterschieds zwischen der neuen Maßzahl und der alten Maßzahl und des erneuten Änderns der Ansteuerung der adaptiven Optik in der bisherigen oder einer anderen Änderungsrichtung abhängig von einer Richtung des Unterschieds können mindestens noch ein weiteres Mal durchgeführt werden, wobei jeweils die bei einer vorherigen Durchführung der Schritte gebildete neue Maßzahl bei der aktuellen Durchführung der Schritte als die alte Maßzahl verwendet wird. Die genannten Schritte können so oft wiederholt werden, bis eine Ansteuerung der adaptiven Optik in der jeweiligen Änderungs richtung erreicht ist, bei der die Maßzahl ein Extremum also entweder ein Minimum oder ein Maximum erreicht. Als Kriterium für das Erreichen des Extremums kann zum Beispiel heran gezogen werden, dass der Unterschied der neuen Maßzahl zu der alten Maßzahl einen auf die letzte Änderung der Ansteuerung der adaptiven Optik bezogenen Grenzwert unterschreitet oder dass der Unterschied der neuen Maßzahl zu der alten Maßzahl über die letzten Wiederholungen der Schritte wiederholt seine Richtung wechselt.

Weiterhin kann die Größe der Änderung der Ansteuerung der adaptiven Optik bei jeder Wieder holung der Schritte von der Größe des Unterschieds der neuen Maßzahl zu der alten Maßzahl bei mindestens einem der vorhergehenden Schritte abhängig sein. So kann ein Überschießen des gesuchten Extremums der jeweiligen Metrik durch eine zu starke Änderung der Ansteuerung der adaptiven Optik vermieden werden. Das Messsignal, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit dem ausgewählten Licht beein flusst und zum Erhalten des ersten und des zweiten Messwerts integriert wird, kann insbesondere aus der Probe emittiertes Messlicht sein. Dabei kann dieses Messlicht mit dem optischen System auf einen das Messlicht erfassenden und ggf. direkt integrierenden Detektor abgebildet werden. Bei der Abbildung des Messlichts auf den Detektor wirken sich die zu korrigierenden aberrations induzierten Abbildungsfehler des optischen Systems aus. Je nach Art der Erfassung des Mess lichts kann diese zusätzliche Auswirkung aber unerheblich sein. Dies gilt beispielsweise in allen Fällen, in denen der Detektor das Messlicht aus dem Fokusbereich ohne räumlicher Auflösung registriert.

Die Änderungsrichtung, in der die Ansteuerung der adaptiven Optik bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geändert wird, kann aus verschiedenen Änderungsrichtungen ausgewählt werden. Hierzu zählen insbesondere die Änderungsrichtungen, in denen eine sphä rische Aberration, ein Defokus, ein Astigmatismus oder eine Koma des optischen Systems kompensierbar ist. Welche Änderung der Ansteuerung der adaptiven Optik einen besonders großen Beitrag zur Annäherung an das jeweilige Extremum der erfindungsgemäßen Metrik liefert, hängt von dem jeweiligen optischen System und insbesondere der jeweiligen Probe ab. Vielfach ist es ausreichend, nur eine der genannten Aberrationen zu kompensieren, um die Abbildungsfehler des optischen Systems sehr klein zu halten. Dies kann insbesondere die sphärische Aberration sein.

Das Licht, dessen Intensität in dem Fokusbereich sich auf die zeitliche Veränderung des Mess signals auswirkt, kann aus solchem Licht ausgewählt werden, das zu einer exponentiellen Abnah me des Messsignals gegen null mit der Zeit führt oder das zu einer exponentiellen Annäherung des Messsignals von unten an den Sättigungswert mit der Zeit führt. Wenn beispielsweise das Messsignal Fluoreszenzlicht ist, das von Fluoreszenzfarbstoffen in der Probe emittiert wird, kann das ausgewählte Licht Anregungslicht sein, das die Fluoreszenzfarbstoffe in dem Fokusbereich in einen fluoreszenten Zustand anregt, bis sich die Intensität des resultierenden Fluoreszenzlichts von den Fluoreszenzfarbstoffen an den Sättigungswert annähert.

Wenn die Fluoreszenzfarbstoffe durch zu dem Licht zusätzliches Anregungslicht in dem Fokus bereich in einen fluoreszenten Zustand angeregt werden, aus dem sie das Fluoreszenzlicht als Messlicht emittieren, kann das ausgewählte Licht Stimulationslicht sein, das die Fluoreszenzfarb stoffe zu stimulierter Emission stimuliert, bevor die Fluoreszenzfarbstoffe das Fluoreszenzlicht emittieren. Dann hängt das nach der Einwirkung des Stimulationslichts verbleibende Fluores zenzlicht nichtlinear von der Intensität des Stimulationslichts ab. Konkret kann das zusätzliche Anregungslicht zusammen mit dem Stimulationslicht von dem optischen System in den Fokus bereich in der Probe fokussiert werden. Wenn dabei eine Intensitätsverteilung des ausgewählten Lichts ein zentrales Intensitätsminimum aufweist, das in dem Fokusbereich mit einem zentralen Intensitätsmaximum des Anregungslichts zusammenfällt, liegen Intensitätsverteilungen des Anregungslichts und des Stimulationslichts vor, wie sie auch bei der STED-Mikroskopie zur Anwendung kommen. So führt das erfindungsgemäße Verfahren zur Korrektur der aberra tionsinduzierten Abbildungsfehler des Abbildungssystems, die sich negativ auf die räumlich eng begrenzte effektive Punktverschmierungsfunktion bei der Anregung der jeweiligen Probe zur Fluoreszenz auswirken.

Wenn dann konkret der dritte Zeitraum bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens so vor dem ersten Zeitraum beginnt und die Intensität des Lichts in dem zentralen Intensitäts minimum benachbarten Intensitätsmaxima der Intensitätsverteilung des Stimulationslichts so hoch ist, dass das Messsignal zu mehr als 50 %, vorzugsweise zu mehr als 66 % oder noch mehr bevorzugt zu mehr als 90 % aus einem Umfeld des Intensitätsminimums stammt, dessen Abmessungen in zumindest einer Raumrichtung kleiner als eine Beugungsgrenze bei beiden Längen des Lichts und des Fluoreszenzlichts sind, korrigiert das erfindungsgemäße Verfahren die aberrationsinduzierten Abbildungsfehler für eben dieses Umfeld des Intensitätsminimums. Obwohl dieses Umfeld das Intensitätsminimum, das dem bei der STED-Mikroskopie jeweils gemessenen Punkt der Probe entspricht, zwar umschließt aber selbst nicht einschließt, bedeutet dies auch eine Korrektur der aberrationsinduzierten Abbildungsfehler für den jeweils gemessenen Punkt der Probe. Diese Korrektur ist für den jeweils gemessenen Punkt der Probe sogar hoch spezifisch, weil die Abmessungen des Umfelds bereits kleiner als die Beugungsgrenze bei Wellenlängen des Lichts und des Fluoreszenzlichts sind.

Da die Anforderungen an das Anregungslicht und das Stimulationslicht bei der Durchführung der hier zuletzt beschriebenen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens den Anforde rungen bei der STED-Mikroskopie vollständig entsprechen können, kann das erfindungsgemäße Verfahren während der laufenden Durchführung einer STED-mikroskopischen Messung oder auch einer STED-mikroskopischen Bildaufnahme durchgeführt werden. Konkret können die für die jeweilige Messung bzw. Bildaufnahme registrierten Photonen des Fluoreszenzlichts für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden, wenn sie mit zeitlicher Auflösung registriert werden, so dass sie dem ersten und dem zweiten Zeitraum zugeordnet werden können. Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch schon vor der Verwendung des optischen Systems zum eigentlichen Abbilden der Probe durchgeführt werden.

Bei der der STED-Mikroskopie gleichenden Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfah- rens ist die als Quotient, in dessen Nenner der erste Messwert und in dessen Zähler der zweite Messwert steht, bestimmte Maßzahl als zu minimierende Metrik zu verwenden. Dies bedeutet, dass dann, wenn die jeweilige als Quotient bestimmte neue Maßzahl kleiner als die jeweilige als Quotient bestimmte alte Maßzahl ist, die Ansteuerung der adaptiven Optik erneut in der bisherigen Änderungsrichtung zu ändern ist, weil die kleiner werdende Metrik kleiner werdende aberrationsinduzierte Abbildungsfehler anzeigt.

Hiermit wird ein Unterschied zu solchen Verfahren deutlich, die zur Justierung eines STED- Mikroskops die Helligkeit eines aufgenommenen Bilds, d. h. die Intensität des nach dem Einwirken des Stimulationslichts verbleibenden Fluoreszenzlichts als eine zu maximierende Metrik verwenden. Das erfindungsgemäße Verfahren zielt in seiner der STED-Mikroskopie gleichenden Ausführungsform stattdessen darauf ab, dass das Stimulationslicht im dem gesamten Fokusbereich die Emission von Fluoreszenzlicht soweit als möglich verhindert. Dies erfordert die maximale Intensität des Stimulationslichts in dem Fokusbereich, wie sie nur ohne aberrationsinduzierte Abbildungsfehler erreicht wird. Die verbleibende Emission von Fluores zenzlicht aus dem Intensitätsminimum der Intensitätsverteilung des Stimulationslicht, die mit kleiner werdenden aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern sogar zunehmen kann, spielt dabei keine die Funktion des erfindungsgemäßen Verfahrens störende Rolle.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können der jeweilige erste Zeitraum, der jeweilige zweite Zeitraum und auch der jeweilige dritte Zeitraum unabhängig voneinander jeweils ein geschlos sener Zeitraum oder aus voneinander zeitlich beabstandeten Teilzeiträumen zusammengesetzt sein. Dass der dritte Zeitraum aus Teilzeiträumen zusammengesetzt ist, kann zum Beispiel bedeuten, dass das Licht jeweils in mehreren sehr schnell aufeinander folgenden Pulsen, die beim Registrieren des Messsignals nicht aufgelöst werden, in den Fokusbereich gerichtet wird. Dass der erste Zeitraum und/oder der zweite Zeitraum aus Teilzeiträumen zusammengesetzt ist, kann bedeuten, dass das Messsignal aus der Probe jeweils in mehreren zeitlich aufeinander folgenden Teilzeiträumen registriert wird, zwischen denen sich Totzeiten der Registrierung des Messsignals befinden. In einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bedeutet, dass der erste, der zweite und der dritte Zeitraum aus Teilzeiträumen zusammengesetzt sind, dass der Fokusbereich zwischen jeweils einem Teilzeitraum des ersten, des zweiten und des dritten Zeitraums in der Probe etwas verschoben wird, bevor jeweils ein zweiter und anschließend eventuell weitere Teilzeiträume des ersten Zeitraums, des zweiten Zeitraums und des dritten Zeitraums folgen. Auf diese Weise wird beim Erfassen und ggf. Integrieren des Messsignals über einen räumlichen Bereich der Probe gemittelt. Dies hat sich insbesondere bei der der STED- Mikroskopie-nahen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens als vorteilhaft erwie sen, um Effekte einer mit hoher Raumfrequenz schwankender Konzentrationen der Fluoreszenz- farbstoffe in der Probe auf die als Metrik verwendete Maßzahl heraus zu mittein.

Anders gesagt kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Erfassen und ggf. Integrieren des Messsignals über gleiche erste und gleiche zweite Zeiträume, wobei das Licht über einen gleichen dritten Zeitraum in dem Fokusbereich in der Probe fokussiert wird, für mehrere Bildpunkte durchgeführt werden, um den jeweiligen ersten Messwert und den jeweiligen zweiten Messwert zu erhalten.

Bei einem erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskop mit einer ersten Lichtquelle für Anregungslicht, einer zweiten Lichtquelle für Stimulationslicht, einem Objektiv und einer Korrek turvorrichtung zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern, die eine adaptive Optik im Strahlengang durch das Objektiv umfasst, ist die Korrekturvorrichtung zur Durchführung der folgenden Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens ausgebildet: Erfassen des Mess signals über den ersten Zeitraum und den zweiten Zeitraum, wobei das Stimulationslicht als das Licht, das das Messsignal beim Einwirken auf die Probe reduziert, über den dritten Zeitraum in den Fokusbereich in der Probe fokussiert wird, um den ersten Messwert und den zweiten Messwert zu bestimmen; Bestimmen der Maßzahl aus dem ersten Messwert und dem zweiten Messwert; und Verwenden der Maßzahl beim Ansteuern der adaptiven Optik als durch das Ändern der Ansteuerung zu optimierenden Metrik.

Die adaptive Optik des erfindungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskops kann zum Beispiel einen adaptiven Spiegel und/oder ein ansteuerbares Mikrospiegelarray und/oder einen SLM (Spatial- Light-Modulator) aufweisen. Insbesondere der SLM kann bei der STED-Mikroskopie-nahen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zugleich zur Wellenfrontformung bei dem Stimulationslicht derart genutzt werden, dass das Stimulationslicht die Intensitätsverteilung mit dem zentralen Intensitätsminimum in dem Fokusbereich ausbildet.

Bei einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern eines optischen Systems, das ein Objektiv und eine adaptive Optik im Strahlengang durch das Objektiv aufweist, werden erstes Licht, zweites Licht und eine Probe so ausgewählt, dass das erste Licht beim Einwirken auf die Probe ein erstes Messsignal von Bestandteilen der Probe mit einer ersten Übergangswahrscheinlichkeit anregt, die mit einer ersten Potenz von einer Intensität des ersten Lichts abhängt, und dass das zweite Licht beim Einwirken auf die Probe das erste oder ein zweites Messsignal von denselben Bestandteilen der Probe mit einer zweiten Übergangswahrscheinlichkeit anregt, die mit einer zweiten Potenz von einer Intensität des zweiten Lichts abhängt, wobei die erste und die zweite Potenz um mindestens eins verschieden sind. Dann wird das erste Licht mit dem optischen System in einen Fokusbereich des optischen Systems in der Probe fokussiert, wobei das von dem ersten Licht angeregte erste Messsignal aus dem Fokusbereich über einen ersten Zeitraum erfasst wird, um einen ersten Messwert zu bestimmen. Weiterhin wird das zweite Licht mit dem optischen Signal in den Fokusbereich in der Probe fokussiert, wobei das von dem zweiten Licht angeregte erste oder zweite Messsignal aus dem Fokusbereich in der Probe über einen zweiten Zeitraum erfasst wird, um eine zweiten Messwert zu bestimmen. Dann wird aus dem ersten Messwert und dem zweiten Messwert eine Maßzahl, die eine streng monoton steigende oder fallende Funktion einer relativen Änderung des ersten Messsignals oder eines relativen Unterschieds zwischen dem ersten und dem zweiten Messsignal ist, bestimmt und beim Ansteuern der adaptiven Optik als Metrik verwendet, die durch Ändern der Ansteuerung zu optimieren ist.

Bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren werden die unterschiedlichen Abhängigkeiten der ersten und zweiten Übergangswahrscheinlichkeiten von der Intensität des ersten und zweiten Lichts bei der Anregung des jeweiligen Messsignals ausgenutzt, um eine Maßzahl zu bestimmen, die beim Ansteuern der adaptiven Optik als zu optimierende Metrik verwendet wird. Am einfachsten ist es auch bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren die Maßzahl, die eine streng monoton steigende oder fallende Funktion der relativen Änderung des ersten Messsignals oder des relativen Unterschieds zwischen dem ersten und dem zweiten Messsignal ist, durch Bildung eines Quotienten zwischen dem ersten und dem zweiten Messwert bestimmt. Weil die erste und die zweite Übergangswahrscheinlichkeit mit einer ersten und zweiten Potenz von der Intensität des Lichts abhängen, die um mindestens eins verschieden sind, während die Intensitäten des ersten und des zweiten Lichts von den aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern beide in gleicher Weise abhängen, ist dieser Quotient von den Abbildungsfehlern abhängig. Alle anderen Einflüsse auf die beiden Messwerte gehen hingegen in einen konstanten Faktor des Quotienten ein, der sich beim Bestimmen des ersten und des zweiten Messwerts für jeweils denselben Fokusbereich mit den aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern nicht ändert. Dies gilt grundsätzlich sogar dann, wenn das erste Licht andere Bestandteile der Probe in demselben oder selbst einem anderen Fokusbereich zur Emission des ersten Messsignals anregt als das zweite Licht. Indem bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren das jeweilige Messsignal mit dem ersten bzw. zweiten Licht jedoch in demselben Fokusbereich von denselben Bestandteilen der Probe angeregt wird, wird die Maßzahl von dem betrachteten Ort der Probe im Wesentlichen unabhängig. Das mit dem zweiten Licht angeregte Messsignal kann dasselbe Messsignal wie das mit dem ersten Licht angeregte Messsignal sein, was die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verein fachen kann, es kann sich aber auch um ein zweites Messsignal, beispielsweise um Messlicht einer anderen Wellenlänge handeln.

Konkret kann das erste Licht das erste Messsignal von den Bestandteilen der Probe durch ein Einphotonenprozess anregen, während das zweite Licht das erste oder das zweite Messsignal von denselben Bestandteilen der Probe durch ein Mehrphotonenprozess anregt.

Weitere bevorzugte Ausführungsformen dieses erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen denjenigen des voranstehend zuerst beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens.

Bei noch einem weiteren erfindungsgemäßen Verfahren zur Korrektur von aberrationsinduzierten Abbildungsfehlern eines optischen Systems, das ein Objektiv und eine adaptive Optik im Strahlengang durch das Objektiv aufweist, werden Licht und eine Probe ebenso wie bei dem oben zuerst beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren ausgewählt, d. h. so, dass das Licht beim Einwirken auf die Probe ein Messsignal aus der Probe entweder reduziert oder von unten an einen Sättigungswert annähert, wobei eine relative Änderung des Messsignals von einer Intensität des Lichts abhängt. Abweichend von beiden zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren wird bei diesem Verfahren das Licht mit einer zeitlichen Lichtmodulation seiner Intensität versehen und mit dem optischen System in einen Fokusbereich in der Probe fokussiert. Dabei wird das Messsignal aus dem Fokusbereich des optischen Systems in der Probe zeitlich aufgelöst erfasst. Dann wird eine Phasenverschiebung zwischen der Lichtmodulation und einer Signalmodulation des Messsignals als Maßzahl, die eine streng monoton steigende oder fallende Funktion der relativen Änderung des Messsignals ist, bestimmt und beim Ansteuern der adaptiven Optik als Metrik verwendet, die durch Ändern der Ansteuerung zu optimieren, d. h. zu minimieren oder maximieren ist.

Dieses erfindungsgemäße Verfahren ist das Äquivalent zu dem zuerst beschriebenen erfindungs- gemäßen Verfahren im Frequenzraum. Die Phasenverschiebung zwischen der Lichtmodulation und der Signalmodulation ist in ähnlicher Weise von den aberrationsinduzierten Abbildungs fehlern abhängig wie der Quotient aus dem zweiten Messwert und dem ersten Messwert bei dem voranstehend zuerst erläuterten erfindungsgemäßen Verfahren.

Die meisten oben erläuterten bevorzugten Ausführungsformen des zuerst beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens sind daher auch bevorzugte Ausführungsformen dieses erfindungsgemäßen Verfahrens.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen, der Be schreibung und den Zeichnungen. Die in der Beschreibung genannten Vorteile von Merkmalen und von Kombinationen mehrerer Merkmale sind lediglich beispielhaft und können alternativ oder kumulativ zur Wirkung kommen, ohne dass die Vorteile zwingend von erfindungsgemäßen Ausführungsformen erzielt werden müssen. Ohne dass hierdurch der Gegenstand der beige fügten Patentansprüche verändert wird, gilt hinsichtlich des Offenbarungsgehalts der ursprüng lichen Anmeldungsunterlagen und des Patents Folgendes: weitere Merkmale sind den Zeichnun gen - insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung - zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merk malen unterschiedlicher Patentansprüche ist ebenfalls abweichend von den gewählten Rück beziehungen der Patentansprüche möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungen dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombi niert werden. Ebenso können in den Patentansprüchen aufgeführte Merkmale für weitere Aus führungsformen der Erfindung entfallen.

Die in den Patentansprüchen und der Beschreibung genannten Merkmale sind bezüglich ihrer Anzahl so zu verstehen, dass genau diese Anzahl oder eine größere Anzahl als die genannte Anzahl vorhanden ist, ohne dass es einer expliziten Verwendung des Adverbs "mindestens" bedarf. Wenn also beispielsweise von einer adaptiven Optik die Rede ist, ist dies so zu verstehen, dass genau eine adaptive Optik, zwei adaptive Optiken oder mehr adaptive Optiken vorhanden sind. Die in den Patentansprüchen angeführten Merkmale können durch andere Merkmale ergänzt werden oder die einzigen Merkmale sein, die das jeweilige Verfahren bzw. das jeweilige Laser-Scanning-Mikroskop aufweist.

Die in den Patentansprüchen enthaltenen Bezugszeichen stellen keine Beschränkung des Um fangs der durch die Patentansprüche geschützten Gegenstände dar. Sie dienen lediglich dem Zweck, die Patentansprüche leichter verständlich zu machen.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN Im Folgenden wird die Erfindung anhand in den Figuren dargestellter bevorzugter Ausführungs beispiele weiter erläutert und beschrieben.

Fig. 1 zeigt ein erfindungsgemäßes Laser-Scanning-Mikroskop.

Fig. 2 zeigt Lichtintensitätsverteilungen von Anregungslicht und Stimulationslicht im

Fokusbereich eines Objektivs des Laser-Scanning-Mikroskops gemäß Fig. 1. Fig. 3 ist ein Histogramm von Photonen von Fluoreszenzlicht, das in dem Laser- Scanning-Mikroskop als Messsignal registriert wird, über der Zeit.

Fig. 4 zeigt eine Auftragung der erfindungsgemäßen Metrik über verschiedene gezielt hervorgerufene sphärische Aberrationen (schwarze Vierecke) und über eine freilaufende erfindungsgemäße Optimierung der Metrik (weiße Kreise). Fig. 5 ist eine Auftragung einer erfindungsgemäßen Metrik über einer sphärischen

Aberration des optischen Systems des Laser-Scanning-Mikroskops gemäß Fig. 1 beim Abbilden von mit Farbstoff gefüllten Kügelchen.

Fig. 6 zeigt im Vergleich zu Fig. 5 über derselben sphärische Aberration die Halbwerts breite von Abbildern der mit Farbstoff gefüllten Kügelchen. Fig. 7 zeigt im Vergleich zu Fig. 5 über derselben sphärischen Aberration die Intensität des Fluoreszenzlichts von den mit Farbstoff gefüllten Kügelchen.

Fig. 8 zeigt den Verlauf der erfindungsgemäßen Metrik über einem Defokus des optischen Systems des Laser-Scanning-Mikroskops gemäß Fig. 1. Fig. 9 zeigt den Verlauf der erfindungsgemäßen Metrik über einer sphärischen

Aberration des optischen Systems des Laser-Scanning-Mikroskops gemäß Fig. 1.

Fig. 10 zeigt den Verlauf der erfindungsgemäßen Metrik über einem Astigmatismus des optischen Systems des Laser-Scanning-Mikroskops gemäß Fig. 1.

Fig. 11 zeigt den Verlauf der erfindungsgemäßen Metrik über einer Koma des optischen

Systems des Laser-Scanning-Mikroskops gemäß Fig. 1.

Fig. 12 zeigt ein helles Abbild einer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Struktur und den zugehörigen Verlauf der erfindungsgemäßen Metrik über einer sphäri schen Aberration.

Fig. 13 zeigt ein weniger helles Abbild derselben Struktur wie in Fig. 12 und den zugehörigen Verlauf der erfindungsgemäßen Metrik über derselben sphärischen Aberration.

Fig. 14 zeigt ein dunkles Bild derselben Struktur wie in Fig. 12 und 13 und den zugehörigen Verlauf der erfindungsgemäßen Metrik über derselben sphärischen Aberration. Fig. 15 zeigt eine Intensitätsverteilung von Anregungslicht und Stimulationslicht im

Fokusbereich eines Objektivs des Laser-Scanning-Mikroskops gemäß Fig. 1 bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung.

Fig. 16 zeigt verschiedene zeitliche Abfolgen eines ersten Zeitraums, in dem das Mess signal zu einem ersten Messwert integriert wird, eines zweiten Zeitraums, in dem das Messsignal zu einem zweiten Messwert integriert wird und einem dritten Zeitraum, in dem ausgewähltes Licht in den Fokusbereich des jeweiligen optischen Systems fokussiert wird.

Fig. 17 ist ein Ablaufdiagramm der wesentlichen Schritte eines erfindungsgemäßen

Verfahrens. Fig. 18 ist ein Ablaufdiagramm der wesentlichen Schritte eines weiteren erfindungs gemäßen Verfahrens.

Fig. 19 ist ein Ablaufdiagramm der wesentlichen Schritte noch eines weiteren erfin dungsgemäßen Verfahrens.

FIGURENBESCHREIBUNG Das in Fig. 1 dargestellte erfindungsgemäße Laser-Scanning-Mikroskop 1 basiert auf einem STED-Mikroskop und weist entsprechend neben einer ersten Lichtquelle 2 für Anregungslicht 3 eine zweite Lichtquelle 4 für eine Anregung durch das Anregungslicht 3 wieder beseitigendes Licht 5 in Form von Stimulationslicht 6 auf. Jede der beiden Lichtquellen 2 und 4 umfasst einen Laser 7 bzw. 8, eine polarisationserhaltende Lichtleiterfaser 9 bzw. 10 und eine Kollimationsoptik 11 bzw. 12 für das aus der Lichtleiterfaser 9 bzw. 10 austretende Anregungslicht 3 bzw.

Stimulationslicht 6. In dem Strahlengang des Stimulationslichts 6 ist darüber hinaus ein SLM 13 zur Wellenfrontformung angeordnet, damit das Stimulationslicht 6 im Fokusbereich eines Objektivs 14 eine Lichtintensitätsverteilung mit einem zentralen Intensitätsminimum ausbildet. Das Stimulationslicht 6 wird hinter dem SLM 13 nach einer weiteren Optik 15 mithilfe eines dichroitischen Strahlteilers 16 mit dem Anregungslicht 3 zusammengeführt. Über einen deformierbaren Spiegel 17 als adaptive Optik 18 und noch eine weitere Optik 19 werden das Anregungslicht 3 und das Stimulationslicht 6 in das Objektiv 14 eingekoppelt, das das Anregungslicht 3 und das Stimulationslicht 6 gemeinsam in einen Fokusbereich in einer Probe 20 fokussiert. Die Optiken 15 und 19 sind so ausgebildet, dass der deformierbare Spiegel 17 und der SLM 13 in Ebenen stehen, die zu einer Eintrittspupille des Objektivs 14 konjugiert sind. Die Lage des Fokusbereichs, in dem das Anregungslicht 3 und das Stimulationslicht 6 fokussiert werden, ist mithilfe eines Scanners 21 in der Probe 20 verschiebbar. In Fig. 1 ist der Scanner 21 als verfahrbarer Probentisch angedeutet. Der Scanner 21 kann jedoch auch anders ausgebildet sein, und speziell dazu, das Anregungslicht 3 und das Stimulationslicht 6 gegenüber dem Objektiv 14 zu verlagern, insbesondere um ein Zentrum der Eintrittspupille des Objektivs 14 zu verkippen. Aus dem Fokusbereich in der Probe 20 aufgrund der Anregung von dort befindlichen Fluoreszenzfarbstoffen mit dem Anregungslicht 3 emittiertes Fluoreszenzlicht 22 wird mit einem zweiten dichroitischen Strahlteiler 23 aus dem Strahlengang des Anregungslichts 3 ausgekoppelt, mit einer Optik 24 in eine Multimode-Lichtleiterfaser 25 fokussiert und durch diese zu einem zeitlich auflösenden Detektor 26 geführt. Bei dem erfindungsgemäßen Laser-Scanning- Mikroskop 1 wird der deformierbare Spiegel 17 als im Strahlengang durch das Objektiv 14 angeordnete adaptive Optik 18 von einer Steuerung 27 angesteuert, der ein das Fluoreszenzlicht anzeigendes Messsignal 28 von dem Detektor 26 zugeführt wird. Statt des deformierbaren Spiegels 17 könnte die adaptive Optik 18 auch durch einen SLM, ein Mikrospiegelarray oder in anderer dem Fachmann bekannter Weise ausgebildet sein.

Fig. 2 zeigt Lichtintensitätsverteilungen 29 und 30 des Anregungslichts 3 und des Stimulations lichts 6 längs eines Schnitts in x-Richtung durch das Zentrum des Fokusbereichs. Die Inten sitätsverteilung 29 des Anregungslichts ist diejenige eines beugungsbegrenzten Spots. Die räumlich gesehen Donut-förmige Intensitätsverteilung 30 des Stimulationslichts weist in dem Zentrum 31 ein Intensitätsminimum in Form einer Nullstelle 32 auf, welche in dem Schnitt gemäß Fig. 2 von Intensitätsmaxima 33 begrenzt ist. In den Intensitätsmaxima 33 überschreitet die Intensität des Stimulationslichts eine Sättigungsintensität ls, die dazu führt, dass die Anregung von Fluoreszenzfarbstoffen durch das Anregungslicht 3 vollständig zurückgeführt wird. Entsprechend kann das von dem Detektor 26 gemäß Fig. 1 registrierte Fluoreszenzlicht 22 dem Umfeld 34 der Nullstelle 32 zugeordnet werden, dessen Abmessungen weit unterhalb der Beu gungsgrenze liegen. Dies gilt aber nur für das Fluoreszenzlicht 22, welches erst dann registriert wird, wenn das Stimulationslicht 6 die Anregung durch das Anregungslicht 3 außerhalb des Umfelds 34 der Nullstelle 32 beseitigt hat. Fig. 3 zeigt die Zeitpunkte des Eintreffens der einzelnen Photonen des Fluoreszenzlichts 22 an dem Detektor 26 gemäß Fig. 1 nach einem Puls 35 des Anregungslichts und einem nach folgenden Puls 36 des Stimulationslichts. Zunächst steigt die pro Zeiteinheit registrierte Anzahl der Photonen durch die Anregung durch das Anregungslicht 3 während des Pulses 35 steil an. Dann fällt sie durch die Einwirkung des Stimulationslichts während des Pulses 36 steil ab. Die in einem Zeitraum 37 nach dem Puls 36 registrierten Photonen des Fluoreszenzlichts 22 sind dann diejenigen aus dem Umfeld 34 der Nullstelle 32. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Anzahl der in dem Zeitraum 37 registrierten Photonen des Fluoreszenzlichts 22 zu einer Anzahl von Photonen des Fluoreszenzlichts 22 in Beziehung gesetzt, die während eines früheren Zeitraums 38 registriert werden. Dieser frühere Zeitraum 38 wird hier auch als erster Zeitraum bezeichnet, während der Zeitraum 37 als zweiter Zeitraum bezeichnet wird. Gemäß Fig. 3 fallen die Pulse 35 und 36 in den ersten Zeitraum 38. Das in Beziehung Setzen der in dem zweiten Zeitraum 37 registrierten Photonen zu den in dem ersten Zeitraum 38 registrierten Photonen des Fluoreszenzlichts 22 erfolgt erfindungsgemäß durch Bestimmen einer Maßzahl insbesondere durch Bildung eines Quotienten der in dem zweiten Zeitraum 37 registrierten Photonen und der in dem ersten Zeitraum 38 registrierten Photonen. Dabei beruht die Erfindung auf der Erkenntnis, dass diese Maßzahl ein Extremum annimmt, wenn die Steuerung 27 die adaptive Optik 18 so ansteuert, dass aberrationsinduzierte Abbildungsfehler des das Objektiv 14 umfassenden optischen Systems des Laser-Scanning-Mikroskops 1 von der adaptiven Optik 18 genau kompen siert werden. Aberrationsinduzierte Abbildungsfehler des optischen Systems des Laser-Scan- ning-Mikroskops 1 gemäß Fig. 1 wirken sich auf die Intensitäten des Anregungslichts 3 und des Stimulationslichts 6 in dem Fokusbereich in der Probe 20 so aus, dass die Intensitäten mit zunehmenden Abbildungsfehlern kleiner werden. Aufgrund von zunehmenden Abbildungsfehlern geht also mit der Intensität des Anregungslichts auch die Anregung von Fluoreszenzfarbstoffen in der Probe 20 und damit das Fluoreszenzlicht 22 zurück. Dieser Rückgang ist jedoch nicht von anderen Rückgängen der Intensität des Fluoreszenzlichts 22 zu unterscheiden, wie beispielsweise ein durch räumliche Variationen der Konzentration der Fluoreszenzfarbstoffe oder ein durch Bleichen der Fluoreszenzfarbstoffe verursachter Rückgang. Wenn man jedoch die relative Auswirkung des Stimulationslichts 6 auf die zuvor von dem Anregungslicht 3 angeregten Fluoreszenzfarbstoffe betrachtet, die durch die aus den in den beiden Zeiträumen 37 und 38 registrierten Photonen bestimmte Maßzahl angezeigt wird, ist diese nur von der Intensität des Stimulationslichts 6 abhängig. Umso weniger Photonen in dem zweiten Zeitraum 37 gegenüber den Photonen in dem ersten Zeitraum 38 registriert werden, umso mehr Fluoreszenzfarbstoffe regt das Stimulationslicht 6 vor dem zweiten Zeitraum 37 ab, was gleichbedeutend damit ist, dass die Intensität des Stimulationslichts umso höher ist und die aberrationsinduzierten Abbildungs fehler umso geringer sind. Unter Bezugnahme auf Fig. 2 ist die Auswirkung von aberrationsin duzierten Abbildungsfehlern auch so erklärbar, dass die Sättigungsintensität ls bei durch aberrationsinduzierte Abbildungsfehler insgesamt reduzierter Intensitätsverteilung 30 des Stimu lationslichts 6 erst in größerem Abstand zu der Nullstelle 32 überschritten wird und entsprechend mehr Fluoreszenzlicht aus dem Umfeld 34 der Nullstelle 32 übrigbleibt. Die in Fig. 4 aufgetragene Metrik ist der Quotient aus den in dem ersten Zeitraum 38 registrierten Photonen des Fluoreszenzlichts 22 geteilt durch die in den zweiten Zeitraum 37 registrierten Photonen des Fluoreszenzlichts 22. Die Metrik steigt also dann an, wenn in dem zweiten Zeitraum 37 relativ weniger Photonen registriert werden als in dem ersten Zeitraum 38, weil das Stimula- tionslicht 3 aufgrund einer erhöhten Intensität eine stärkere reduzierende Auswirkung auf das Fluoreszenzlicht 22 hatte. Dargestellt sind die Auswirkungen von sechs künstlich bei dem Laser- Scanning-Mikroskop 1 gemäß Fig. 4 mit der adaptiven Optik 18 eingeführten sphärischen Aber rationen (schwarze Quadrate). Die zunehmenden sphärischen Aberrationen führen unabhängig von ihrem Vorzeichen zu zunehmenden Abnahmen der Metrik gegenüber deren Maximum. Dieses Maximum bei einer künstlich eingeführten Aberration von null ließ sich überdies durch eine freilaufende erfindungsgemäße Optimierung der Metrik mittels Variation der Ansteuerung der adaptiven Optik 18 durch die Steuerung 27 gemäß Fig. 1 gegenüber der Ausgangssituation signifikant steigern (weiße Kreise). Für Fig. 4 wurde die Metrik bei einer 2D-STED-Aufnahme einer Schicht mit 40 nm großen Farbstoff gefüllten Kügelchen mit dem Laser-Scanning-Mikroskop 1 gemäß Fig. 1 erstellt, wobei die Photonen des Fluoreszenzlichts 22 gemäß Fig. 3 zeitaufgelöst registriert wurden.

Fig. 5 ist eine Auftragung derselben erfindungsgemäßen Metrik wie in Fig. 4, wobei STED-Bilder einzelner 40 nm großen Farbstoff gefüllten Kügelchen für verschiedene mit der adaptiven Optik 18 gezielt eingebrachte sphärische Aberrationen aufgenommen wurden. Fig. 6 zeigt die entsprechenden Halbwertsbreiten der Abbilder der einzelnen Kügelchen und Fig. 7 die Fluores zenzlichtintensität von den einzelnen Kügelchen, jeweils aufgetragen über dieselben einge- brachten Aberrationen. Der Vergleich der Fig. 5 bis 7 zeigt, dass das Maximum der erfindungs gemäßen Metrik in Fig. 5 innerhalb eines deutlich breiteren Minimums der Halbwertsbreite in Fig. 6 und innerhalb eines ebenfalls noch breiteren Maximums der Intensität des Fluoreszenz- lichts in Fig. 7 erreicht wird. Dies ist der Hintergrund, warum es bei dem erfindungsgemäßen Optimieren der Metrik zur Beseitigung der aberrationsinduzierten Abbildungsfehler des optischen Systems des Laser-Scanning-Mikroskops 1 gemäß Fig. 1 möglich ist, die Ansteuerung der adap tiven Optik 18 mit dem Ziel der Optimierung der Metrik versuchsweise zu ändern, ohne damit bereits die Abbildungsqualität des Laser-Scanning-Mikroskops 1 zu verschlechtern. Von den in den Fig. 5 bis 7 über der sphärische Aberration aufgetragenen Kriterien spricht die erfindungsgemäße Metrik am schnellsten auf die aberrationsinduzierten Abbildungsfehler an, so dass die Metrik ihr Extremum bereits erkennbar verlassen hat, bevor bei den anderen Kriterien ein Verlassen des Extremums und damit eine Verschlechterung der Bildqualität zu erkennen ist. Die Fig. 8 bis 11 zeigen den Einfluss unterschiedlicher Aberrationen auf die erfindungsgemäße Metrik gemäß Fig. 4 und 5. Dabei zeigt sich sowohl bei einem Defokus gemäß Fig. 8, als auch der sphärischen Aberration gemäß Fig. 9, als auch einem als Astigmatismus gemäß Fig. 10, als auch einer Koma gemäß Fig. 11 ein globales Maximum der Metrik dann, wenn die jeweilige Aberration null beträgt. Das Optimieren der Metrik ist damit zur Beseitigung von Abbildungs fehlern geeignet, die auf jeder dieser vier verschiedenen Aberrationen beruhen.

In den Fig. 12 bis 14 ist jeweils ein Bild derselben Struktur mit unterschiedlichen Helligkeiten gezeigt und die zugehörige Auftragung der Metrik entsprechend Fig. 4, d. h. einmal mit vorgegebenen Aberrationen (schwarze Quadrate) und einmal bei freilaufender Optimierung (weiße Kreise) aufgetragen. Die unterschiedlichen Helligkeiten der Abbilder der Struktur basieren auf einem unterschiedlich weit fortgeschrittenen Bleichen der Fluoreszenzfarbstoffe, mit denen die Struktur markiert ist. Unabhängig von der Helligkeit der Abbilder zeigt die Metrik ihr Maximum immer bei der gleichen künstlich eingeführten sphärischen Aberration nahe null, und das erfindungsgemäße Optimieren der Metrik ist erfolgreich. Die erfindungsgemäße Beseitigung aberrationsinduzierter Abbildungsfehler erfolgt daher zuverlässig unabhängig von der Bild helligkeit.

Fig. 15 illustriert eine alternative Intensitätsverteilung 30 des Stimulationslichts 6 gegenüber der Intensitätsverteilung 29 des Anregungslichts 3. Konkret bildet das Stimulationslicht 6 ebenfalls einen beugungsbegrenzten Spot aus. Auch dann führt das Optimieren eines Quotienten von frühen und späten Photonen des Fluoreszenzlichts durch Ändern der Ansteuerung der adaptiven Optik 18 gemäß Fig. 1 zu einer Beseitigung aberrationsinduzierter Abbildungsfehler. Dies gilt wie bei der Intensitätsverteilung 30 des Stimulationslichts 6 im Übrigen auch dann, wenn das Stimulationslicht 6 die Sättigungsintensität ls nicht erreicht.

Fig. 16 illustriert verschiedene Abfolgen des ersten Zeitraums 38, in dem das Messsignal 28 von der Probe 20 aufintegriert wird, des späteren zweiten Zeitraums 37, in dem das Messsignal 28 erneut aufintegriert wird, und eines dritten Zeitraums 39, in dem das sich auf das Messsignal 28 auswirkende Licht 5 in den Fokusbereich der Probe 20 fokussiert wird. Der dritte Zeitraum 39 entspricht dem Puls 36 gemäß Fig. 3, in dem dort das Stimulationslicht 6 auf die Probe gerichtet wird. Gemäß Fig. 3 folgte der Zeitraum 37 direkt auf den Zeitraum 38, und der Zeitraum 39 bzw. der Puls 36 überlappt mit dem späteren Teil des Zeitraums 38. Gemäß Fig. 16 a) ist die Abfolge der Zeiträume 37 und 38 dieselbe. Der dritte Zeitraum 39 überdeckt den ersten Zeitraum 38 aber vollständig. Gemäß Fig. 16 b) ist die Abfolge der Zeiträume 37 und 38 wieder dieselbe. Hier überlappt der dritte Zeitraum 39 aber sowohl mit einem Teil des ersten Zeitraums 38 als auch mit einem Teil des zweiten Zeitraums 37. Gemäß Fig. 16 c) ist die Abfolge der Zeiträume 37 und 38 erneut dieselbe. Hier überlappt der dritte Zeitraum 39 jedoch nur mit dem zweiten Zeitraum 37. Gemäß Fig. 16 d) ist der dritte Zeitraum 39 ohne Überlappung zwischen den Zeiträumen 37 und 38 angeordnet. In jedem Fall wirkt sich das in dem dritten Zeitraum 39 in die Probe 20 fokussierte Licht 5 stärker auf das über den späteren Zeitraum 37 integrierte Messsignal als auf das über den Zeitraum 38 integrierte Messsignal aus, weil das Licht 5 das Messsignal 28, beispielsweise in Form des Fluoreszenzlichts 22 gemäß Fig. 1 , immer weiter reduziert. So wäre der durch das Integrieren des Messsignals 28 in dem ersten Zeitraum 38 erhaltene Messwert nur dann nicht weniger von dem Licht 5 beeinflusst als der durch das Integrieren des Messsignals 28 in dem zweiten Zeitraum 37 gewonnene zweite Messwert, wenn der dritte Zeitraum 39 vollständig vor dem ersten Zeitraum 38 läge.

Das in Fig. 17 gezeigte Ablaufdiagramm 40 eines erfindungsgemäßen Verfahrens beginnt mit einem Auswählen 41 des Lichts 5 und der Probe 20, so dass das Licht 5 beim Einwirken auf die Probe 20 das Messsignal 28 aus der Probe 20 entweder reduziert oder von unten an ein Sättigungswert annähert, wobei eine Änderung des Messsignals 28 von einer Intensität des Lichts 5 abhängt. Dann wird bei einem Erfassen 42 das Messsignal aus einem Fokusbereich des optischen Systems, dessen aberrationsinduzierte Abbildungsfehler zu korrigieren sind, in der Probe 20 über den ersten Zeitraum 38 erfasst und beispielsweise integriert, um den ersten Messwert zu bestimmen, und über den späteren zweiten Zeitraum 37, um den zweiten Messwert zu bestimmen, wobei das Licht 5 über den dritten Zeitraum 39 mit dem optischen System in den Fokusbereich in der Probe 20 fokussiert wird. Aus dem ersten und dem zweiten Messwert wird bei einem Bestimmen 43 eine neue Maßzahl beispielsweise in Form eines neuen Quotienten bestimmt, und dann wird bei einem Bestimmen 44 ein Unterschied der neuen Maßzahl zu einer früheren Maßzahl bestimmt. Je nach Richtung des Unterschieds der Maßzahlen wird bei einem Ändern 45 der Ansteuerung der adaptiven Optik 18 eine Richtung einer früheren Änderung der Ansteuerung der adaptiven Optik 18 beibehalten oder gewechselt. Die Schritte 42 bis 45 werden in einer Schleife 46 wiederholt. Während dieser Wiederholungen kann der Fokusbereich des optischen Systems in der Probe 20 verschoben werden, um fortlaufend für verschiedene Lagen des Fokusbereichs in der Probe 20 aberrationsinduzierte Abbildungsfehler des optischen Systems mit der adaptiven Optik 18 optimal zu kompensieren. Auch während des Erfassens 42 des Messsignals 28 zum Bestimmen des ersten und des zweiten Messwerts kann der Fokusbereich in der Probe 20 verschoben werden, um eine räumliche Mittelung durchzuführen. Dazu sind die Zeiträume 37 bis 39 in entsprechende Teilzeiträume aufzuteilen, von denen jeweils einer dem jeweiligen Ort des Fokusbereichs in der Probe 20 zugeordnet ist.

Fig. 18 zeigt ein Ablaufdiagramm 40 eines gegenüber dem anhand von Fig. 17 erläuterten Verfahren wie folgt modifizierten Verfahrens. Bei einem Auswählen 47 werden erstes und zweites Licht und eine Probe so ausgewählt, dass das erste Licht beim Einwirken auf die Probe 20 ein erstes Messsignal von Bestandteilen der Probe mit einer ersten Übergangswahrscheinlichkeit anregt, die mit einer ersten Potenz von einer Intensität des ersten Lichts abhängt, und dass das zweite Licht beim Einwirken auf die Probe ein zweites Messsignal von denselben Bestandteilen, also insbesondere denselben Fluoreszenzfarbstoffen, der Probe mit einer zweiten Übergangs wahrscheinlichkeit anregt, die mit einer zweiten Potenz von einer Intensität des zweiten Lichts abhängt, wobei die erste und die zweite Potenz um mindestens eins verschieden sind. Bei einem Fokussieren 48 wird dann zunächst das erste Licht mit dem optischen System in einen Fokusbereich des optischen Systems in der Probe fokussiert, wobei das von dem ersten Licht angeregte erste Messsignal aus dem Fokusbereich über einen ersten Zeitraum 38 erfasst wird, um einen ersten Messwert zu bestimmen. Dann wird bei einem weiteren Fokussieren 49 das zweite Licht mit dem optischen System in denselben Fokusbereich in der Probe 20 fokussiert, wobei das von dem zweiten Licht angeregte zweite Messsignal aus dem Fokusbereich in der Probe über eine zweiten Zeitraum 37 erfasst wird, um einen zweiten Messwert zu bestimmen. Anschließend wird bei dem Bestimmen 43 in derselben Weise wie bei dem anhand von Fig. 7 erläuterten erfindungsgemäßen Verfahren eine neue Maßzahl beispielsweise in Form eines neuen Quotienten bestimmt, und dann wird bei dem Bestimmen 44 ein Unterschied der neuen Maßzahl zu einer früheren Maßzahl bestimmt sowie bei einem Ändern 45 die Ansteuerung der adaptiven Optik 18 in derselben wie oder einen anderen Richtung als zuvor geändert. Die in der Schleife 46 wiederholten Schritte umfassen hier die Schritte 48, 49 und 43 bis 45.

Bei dem in Fig. 19 anhand des Ablaufdiagramms 40 dargestellten weiteren erfindungsgemäßen Verfahren entspricht das Auswählen 41 dem Auswählen 41 gemäß Fig. 17. Das anschließende Fokussieren 50 des ausgewählten Lichts erfolgt jedoch mit einer zeitlichen Lichtmodulation seiner Intensität und das gleichzeitige Erfassen des Messsignals 28 erfolgt zeitlich aufgelöst. Als neue Maßzahl wird dann bei einem Bestimmen 51 eine Phasenverschiebung zwischen der Lichtmo dulation und einer Signalmodulation des Messsignals 28 bestimmt. Bei dem Bestimmen 44 wird dann der Unterschied dieser neuen Maßzahl zu einer alten Maßzahl bestimmt, und das Ändern 45 der Ansteuerung der adaptiven Optik 18 erfolgt abhängig von diesem Unterschied. Die Schleife 46 umfasst hierbei die Schritte 50, 51 , 44 und 45.

BEZUGSZEICHENLISTE

Laser-Scanning-Mikroskop

erste Lichtquelle

Anregungslicht

zweite Lichtquelle

Licht

Stimulationslicht

Laser

Laser

Lichtleiterfaser

Lichtleiterfaser

Kollimationsoptik

Kollimationsoptik

SLM

Objektiv

Optik

dichroitischer Strahlteiler

deformierbarer Spiegel

adaptive Optik

Optik

Probe

Scanner

Fluoreszenzlicht

dichroitischer Strahlteiler

Optik

Multimode-Lichtleiterfaser

Detektor

Steuerung

Messsignal

Lichtintensitätsverteilung

Lichtintensitätsverteilung

Zentrum

Nullstelle Intensitätsmaximum Umfeld

Puls

Puls

zweiter Zeitraum erster Zeitraum dritter Zeitraum Ablaufdiagramm Auswählen

Erfassen

Bestimmen

Bestimmen

Ändern

Schleife

Auswählen

Fokussieren Fokussieren Fokussieren Bestimmen

Sättigungsintensität