La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés N-substitués de polyazacycloalcanes, des complexes métalliques paramagnétiques de ces dérivés et des produits pharmaceutiques incorporant ces complexes, notamment utilisables en tant qu'agents de contraste en imagerie médicale.

L'utilisation de complexes métalliques paramagnétiques en imagerie médicale a connu un développement considérable ces dernières années. La présence d'une substance paramagnétique dans un tissu diminue en effet la constante de relaxation longitudinale Tl des molécules d'eau, intensifie les signaux observés et contraste davantage les images obtenues.

Parmi les espèces métalliques utilisables, l'ion gadolinium est particu¬ lièrement préféré car il présente le paramagnétisme le plus élevé et induit donc les interactions les plus fortes avec les atomes d'hydrogène des molécules d'eau. En outre, l'ion gadolinium présente avantageusement un état d'oxydation (+III) stable dans les milieux biologiques.

Cependant, l'ion gadolinium, sous forme libre ou faiblement complexée, n'est pas utilisable in vivo en raison du fait qu'il est mal toléré dans l'organisme et trop lentement éliminé.

C'est la raison pour laquelle on s'est orienté vers la recherche de ligands très solubles en milieu aqueux et capables de complexer l'ion Gd^ ⁺ avec une cinétique rapide, et de conduire à des complexes plus stables.

Certains dérivés de polyazacycloalcanes répondent à cet objectif. II en est ainsi notamment de l'acide gadotérique qui est le complexe du gadolinium de l'acide l,4,7,10-tétra-(carboxyméthyl)-l,4,7,10- tétraazacyclododécane (ou DOTA) et qui entre dans la composition d'un agent de contraste en imagerie par résonance magnétique nucléaire (voir document EP-0 263 861). Ce document EP-0263 861 décrit des compositions de diagnostic pouvant être administrées à l'homme, et qui comprennent une quantité efficace du sel de lysine du complexe gadolinium (III)-DOTA.

Il a été découvert, et ceci constitue le fondement de la présente invention, une nouvelle famille de dérivés de polyazacycloalcanes dont les

complexes du gadolmium possèdent des propriétés paramagnétiques supérieures à celles des complexes connus gadoliniu -DOTA, et qui permettent de rehausser encore le contraste en imagerie par résonance magnétique nucléaire.

Il a en particulier été démontré que les valeurs de relaxivité des composés caractéristiques de l'invention sont supérieures à celles du gadolinium- DOTA et dans certains cas comparables à celles du gadolinium seul.

Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention a pour objet les dérivés poly-N-substitués répondant à la formule générale :

dans laquelle :

. Z représente un radical bivalent choisi dans le groupe constitué par

- < CH ₂ ) _p -

- ( CH ₂ )— N- ( CH ₂ )—

4

. Rj, R2, R3, R4, R5, Rό représentent indépendamment :

- l'atome d'hydrogène ;

- un radical - CÏ‹^-C - dans lequel :

X représente un radical choisi parmi OH, OR7 dans lequel R7 représente un radical alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ; NRgR dans lequel Rg et R9 représentent indépendamment l'atome d'hydrogène, un radical alkyle substitué ou non et ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un sel métallique ;

étant précisé que deux au moins de Rj, R2, R3, ou le cas échéant de R _} R2, R3, R4 ; ou le cas échéant de Rj, R2, R3, R5, Rό ne représentent p.as un atome d'hydrogène ; ou bien : - l'un des radicaux Rj, R2, R3, R4, R5, R représente un groupement -CH2-A-B ou -CO-A-B- dans lesquels A représente un groupe hydrocarboné ayant de 1 à 16 atomes de carbone, linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, non substitué ou substitué par 1 à 5 groupes hydroxy ou alcoxy ayant de 1 à 4 atomes de carbone, ou A représente un groupe anthracényle, ou un groupe biphénylényle ou xylényle éventuellement polysubstitués, et B représente un deuxième macrocycle de formule (I) dans laquelle l'un de Rj, R2, R3, R4, R5, ό représente une liaison et les autres représentent indépendamment l'atome d'hydrogène ou un radical - (CH2)2-CO-X dans lequel X est tel que défini précédemment ; - les autres desdits radicaux Rj, R2, R3, et le cas échéant R4, R5, Rg représentant simultanément un radical -(CH2)2~CO-X dans lequel X est tel que défini précédemment ;

. m, n, p, q, r, s, t, u, identiques ou différents, représentent un nombre entier égal à 2 ou 3 ; et à l'exclusion du l,4,8,ll-tétra-(3-méthylpropionate)-l,4,8,l l - tétraazacyclotétradécane.

Le l,4,8,ll-tétra-(3-méthylpropionate)-l,4,8,l 1 - tétraazacyclotétradécane (composé de formule (I) dans laquelle Z représente un radical

- ( CH ₂ ) — N- ( CH ₂ ) _{3 m}

I ^R * m est égal à 2, n est égal à 3, Ri , R2, R3 et R4 représentent un radical -(CH2)2-

COOCH3) a été mentionné dans un article publié dans Inorganica Chimica Acta, 210 (1993)

7-9. Cependant, ce composé est simplement décrit en tant que produit intermédiaire dans la synthèse de complexes du nickel.

Dans le cadre de l'invention, des composés de formule (I) comportant trois substitutions sur trois atomes d'azote sont préférés car ils permettent par la suite d'obtenir des composés neutres lors de la complexation avec le gadolinium.

Dans le cadre de la présente description et des revendications, on entend par radical alkyle, un groupe hydrocarboné saturé, linéaire ou ramifié. Un radical alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone représenté par exemple par R7, Rg ou R9 est notamment un radical méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n- butyle, isobutyle, pentyle ou hexyle.

Comme radical alkyle substitué, représenté par Rg et R9, on entend tout radical alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone et portant 1 à 5 substituant(s) choisi(s) parmi les radicaux hydroxy ou alcoxy ayant de 1 à 4 atomes de carbone. Un groupe hydrocarboné insaturé représenté par A signifie un groupe hydrocarboné comportant 1 à 5 liaisons doubles et/ou triples.

Des groupes hydrocarbonés saturés représentés par A sont de préférence des groupes hydrocarbonés ayant de 1 à 16 atomes de carbone, et encore de préférence des groupes hydrocarbonés ayant 1 à 6 atomes de carbone, qui peuvent être non substitués ou substitués par 1 à 5 groupes hydroxy ou alcoxy ayant de 1 à 4 atomes de carbone.

Comme groupe hydrocarboné saturé, substitué, on peut citer les groupes 2- hydroxyéthyle, 2-hydroxy-l(hydroxyméthyl)-éthyle, l-(hydroxyméthyl)-éthyle, 2-hydroxypropyle, 3-hydroxypropyle, 2,3-dihydroxypropyle, 2-hydroxybutyle, 3-hydroxybutyle, 4-hydroxybutyle, 2,3,4-trihydroxybutyle et 2-méthoxyéthyle. Les dérivés de polyazacycloalcanes de formule (I) selon l'invention peuvent être obtenus par des procédés semblables à ceux déjà décrits dans la littérature pour des composés macrocycliques analogues et l'homme de métier pourra se reporter à la littérature existante pour déterminer les voies de synthèse appropriées.

Les dérivés de polyazacycloalcanes de formule (I) dans laquelle R , R2, R3, et le cas échéant R4, R5 et R représentent simultanément un groupe -(CH2)2COX peuvent être obtenus relativement aisément par réaction du polyazacycloalcane non substitué correspondant avec un large excès d'un dérivé acrylique approprié, dans un solvant tel que l'éthanol absolu, selon le schéma réactionnel suivant :

dans lequel

Z, X, m et n ont la signification indiquée précédemment, et R représente un groupe ~(CH2)2COX dans lequel X est tel que défini précédemment. Les conditions réactionnelles, et en particulier l'excès de dérivé acrylique, la température et la durée de la réaction, et les moyens d'éliminer le dérivé acrylique en excès, pourront être facilement déterminés par l'homme de métier.

Par exemple, la synthèse des acides polypropioniques de polyaza- cycloalcanes sera réalisée en opposant le polyazacycloalcane à un large excès d'acide acrylique (18 fois environ) dans l'éthanol absolu. Après agitation du mélange réactionnel à la température ambiante durant 1 h, la solution est maintenue au reflux de l'éthanol durant 12 h. Le solide blanc formé après refroidissement est filtré, lavé plusieurs fois à l'éthanol pour éliminer l'acide acrylique restant et recristallisé dans l'eau.

Une voie de synthèse permettant de préparer des composés de formule (I) pour lesquels au moins un atome d'azote n'est pas substitué, c'est à dire qu'au moins l'un de R^, R2, R3 et le cas échéant R4, R5, R représente un atome d'hydrogène, consiste à utiliser, en lieu et place du polyazacycloalcane non substitué, un polyazacycloalcane substitué par un ou plusieurs groupe(s) benzyle(s) selon le schéma réactionnel suivant donné à titre illustratif dans le cas d'une mono-substitution :

CH^CHCOX I solvant

dans lequel Z, R, X, m et n ont la signification indiquée précédemment, puis à hydrogener le composé ainsi obtenu par exemple par hydrogénation catalytique à l'aide de Palladium sur charbon. II est à noter que l'hydrogénation permet d'éliminer le radical de protection benzyle pour obtenir un NH.

Le dérivé N-benzyl-polyazacycloalcane pourra être obtenu facilement par réaction du polyazacycloalcane avec une solution de bromure de benzyle dans du chloroforme. Cette méthode est particulièrement intéressante car elle permet ensuite de substituer l'hydrogène du NH restant par un radical différent et permet par exemple d'obtenir les composés bis-cycliques de formule (I) dans laquelle l'un de R , R2, R3 et le cas échéant R4, R5, R représente un groupement -CH2-A-B ou -CO-A-B-. Les dérivés de bis-azamacrocycles tels par exemple les dérivés du l,l'-o-xylénylènebis(l,4,8,ll-tétraazacyclotétradécane) peuvent être synthétisés aisément selon un mode opératoire similaire à ceux décrits précédemment. Par exemple, la synthèse des esters polypropioniques des bimacrocycles sera réalisée en opposant à température ambiante pendant 2 à 3 jours le bis-polyazacycloalcane dissous dans un solvant polaire tel l'éthanol absolu en présence d'un large excès de méthyl ou d'éthylacrylate en solution dans le même solvant. Après évaporation des solvants, le dérivé hexasubstitué est isolé sous forme d'une huile incolore.

L'hydrolyse des fonctions esters sera réalisée en dissolvant à température ambiante le bis-macrocyle dans une solution d'acide chlorhydrique à environ 6 mol/1 et en maintenant l'agitation pendant environ 4 à 5 jours à la même température. Après plusieurs lavages par du méthanol ou de l'éthanol absolu, le bis-macrocyle N- hexasubstitué par des groupements propionate est isolé à l'état solide sous forme protonée.

Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet des complexes de dérivés N-substitués de polyazacycloalcanes, caractérisés en ce qu'ils sont constitués d'un atome de gadolinium et d'un dérivé de formule :

( CH ₂ 2 ) _B

N

I

R, dans laquelle :

. Z représente un radical bivalent choisi dans le groupe constitué par

( CH. )— .

~ ( CH ₂ ) _Γ "N- ( CH _a )7 R.

( CH, ^• N ( CH, i " N _l ~ ( * CH, 2 )

I * ^Ï„ I ' u

R, R 6

. Ri , R2, R3, R4, R5, R représentent indépendamment :

- l'atome d'hydrogène ;

- un radical -(CH^-CO-X dans lequel : X représente un radical choisi parmi OH, OR7 dans lequel R7 représente un radical alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ; NRgRç dans lequel Rg et R9 représentent indépendamment l'atome d'hydrogène, un radical alkyle substitué ou non et ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un sel métallique ;

étant précisé que deux au moins de Ri, R2, R3, ou le cas échéant de Ri, R2, R3, R4 ; ou le cas échéant de R , R2, R3, R5, R6 ^ne représentent pas un atome d'hydrogène ; ou bien : - l'un des radicaux Ri, R2, R3, R4, R5, Rβ représente un groupement -CH2-A-B ou -CO-A-B- dans lesquels A représente un groupe hydrocarboné ayant de 1 à 16 atomes de carbone, linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, non substitué ou substitué par 1 à 5 groupes hydroxy ou alcoxy ayant de 1 à 4 atomes de carbone, ou A représente un groupe anthracényle, ou un groupe biphénylényle ou xylényle éventuellement polysubstitués, et B représente un deuxième macrocycle de formule (I) dans laquelle l'un de R , R2, R3, R4, R5, R représente une liaison et les autres représentent indépendamment l'atome d'hydrogène ou un radical - (CH2)2~CO-X dans lequel X est tel que défini précédemment ; - les autres desdits radicaux Ri, R2, R3, et le cas échéant R4, R5, R5 représentant indépendamment l'atome d'hydrogène ou un radical -(CH2)2~CO-X dans lequel X est tel que défini précédemment ;

. m, n, p, q, r, s, t, u, identiques ou différents, représentent un nombre entier égal à 2 ou 3 .

Dans le cadre de la présente description un atome de gadolinium représente généralement le cation Gd^ ⁺ .

Parmi ces complexes, une sous-famille actuellement préférée est celle des complexes constitués d'un atome de gadolinium et d'un dérivé de formule (I) telle que définie précédemment, dans laquelle : . Z représente un radical bivalent choisi dans le groupe constitué par

— ( CH, ) —

— ( CH ₂ )— N- ( CH ₂ ) ₇

( CH, N- ( CH ₂ N- ( CH, V

1 1 . R,

. R , R2, R3, R4, R5, R représentent indépendamment : - l'atome d'hydrogène ;

- un radical -(CH2)2-CO-X dans lequel :

X représente un radical choisi parmi OH, OR7 dans lequel R7 représente un radical alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ; NRgRg dans lequel Rg et R9 représentent indépendamment l'atome d'hydrogène, un radical alkyle substitué ou non et ayant de 1 à 6 atomes de -carbone ou un sel métallique ; étant précisé que deux au moins de Ri, R2, R3, ou le cas échéant de R^ R2, R3, R4 ; ou le cas échéant de Ri, R2, R3, R5, Rβ ne représentent pas un atome d'hydrogène ;

. m, n, p, q, r, s, t, u, identiques ou différents, représentent un nombre entier égal à 2 ou 3.

Dans cette sous-famille on citera en particulier les complexes constitués d'un atome de gadolinium et d'un dérivé de formule (I), dans laquelle Ri, R2 , R3 représentent indépendamment l'atome d'hydrogène ou un radical - (CH2) ₂ -COOH Z représente le radical bivalent : -(CH ₂ ) _q -N(R ₄ )-(CH2) _r î R4 représente le radical -(CH2)2"COOH ; m, n, q et r, identiques ou différents, représentent un nombre entier égal à 2 ou 3.

Dans cette sous-famille, les complexes constituant le meilleur mode de réalisation de l'invention sont ceux qui sont neutres et qui sont donc constitués d'un atome de gadolinium et d'un composé de formule (I) tri-substitué. Le composé particulièrement préféré est le composé : 1 ,4,8-tris-(2-carboxyéthy 1)- 1 ,4,8, 11 -tétraazacyclotétradécane

Le complexe de ce dernier composé est particulièrement intéressant, dans la mesure où il s'agit d'un produit neutre qu'il n'est donc pas nécessaire de transformer par neutralisation pour son application pharmaceutique, contrairement au produit gadolinium-DOTA.

Les composés tétra-substitués sont toutefois généralement intéressants et parmi ces composés tétra-substitués, on citera particulièrement le composé suivant: l,4,8,ll-tétra-(2-carboxyéthyl)-l,4,8,ll-tétraazacycloté tradécane.

La préparation des complexes de gadolinium selon l'invention peut être effectuée de façon classique, en dissolvant ou en mettant en suspension un sel ou de préférence un oxyde de gadolinium (Gd2Û3) dans l'eau ou dans une solution

aqueuse tamponnée ou non et/ou un alcool tel que le méthanol ou l'éthanol, et en le faisant réagir avec une solution ou suspension de la quantité équivalente d'un acide complexant de formule générale (I) précitée ou de l'une de ses formes déprotonées. Si cela est nécessaire, on chauffe le mélange ainsi obtenu entre 50 et 100'C jusqu'à ce que la réaction soit terminée.

Si le complexe formé est insoluble dans le solvant, il cristallise et on peut facilement le séparer par filtration.

Si le complexe formé est soluble, on peut l'isoler en évaporant la solution à siccité. Lorsque cela s'avère nécessaire, il est possible de neutraliser les complexes ainsi obtenus à l'aide de bases inorganiques (hydroxyde, carbonate ou bicarbonate) par exemple de sodium, de potassium ou de lithium et/ou de bases organiques comme par exemple des aminés primaires, secondaires et tertiaires, en particulier l'éthanolamine, la glucamine, la N-méthylglucamine ainsi que des acides aminobasiques (lysine, arginine ou ornithine).

D'une façon générale, l'homme de métier pourra se reporter à la littérature existante pour la détermination des conditions rέactionnelles appropriées à ces préparations.

Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique, notamment utile comme produit d'imagerie par résonance magnétique nucléaire utilisable in vivo et/ou in vitro, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un complexe de dérivé(s) de polyazacycloalcane(s) tel(s) que défini(s) précédemment, en combinaison avec un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable. Les complexes obtenus selon l'invention peuvent être utilisés sans aucune difficulté dans le cadre des méthodes classiques de diagnostic ou thérapeutiques comme par exemple les méthodes utilisant les rayons X, les ultra¬ sons, la RMN, la médecine nucléaire.

Dans le cadre de cette utilisation diagnostic ou thérapeutique, les composés de l'invention peuvent être administrés par voie parentérale ou orale et se présenteront de préférence sous forme d'une solution ou suspension dans un solvant aqueux physiologiquement acceptable, contenant de 1 μmol/1 à 1 mol/1 de complexe(s). La dose administrable à un être humain peut être généralement de 0,001 à 5 mmol/kg du poids du corps. Une telle composition pharmaceutique peut

être obtenue d'une manière connue en soi, en mettant en suspension ou en dissolvant dans un milieu aqueux les complexes précités, éventuellement avec addition d'un véhicule ou excipient pharmaceutiquement acceptable, et en stérilisant ensuite si nécessaire la suspension ou solution ainsi obtenue. Comme véhicule pharmaceutiquement acceptable approprié, on peut citer par exemple des tampons physiologiques.

Des adjuvants couramment utilisés en pharmacie comme par exemple la méthylcellulose, le lactose ; des agents tensioactifs ainsi que des substances aromatisantes peuvent également être utilisés dans le cadre de la présente invention.

L'invention sera illustrée plus en détail par les exemples non limitatifs suivants :

Exemple 1 l,4,7,10-tétra-(2-carboxyéthyl)-l,4,7,10-tétraazacyclodod écane

A 5,0 g (0,029 mol) de 1,4,7,10-tétraazacyclododécane dans 100 ml d'éthanol absolu est ajoutée, sous forte agitation et par un lent goutte à goutte, une solution de 0,522 mole d'acide acrylique (37,6 g) dans 50 ml d'éthanol absolu.

L'agitation est maintenue pendant 1 heure à température ambiante, puis le milieu réactionnel est porté à reflux durant 12 heures. Après retour à température ambiante, le solide blanc formé au cours de la réaction est filtré puis lavé abondamment avec de l'éthanol absolu. On isole 7,3 g du dérivé attendu après séchage sous vide (5-6 heures à 1 mmHg, 20 ^Φ C) et recristallisation dans l'eau distillée (Rdt = 54,7 %).

RMN!H (δppm, D2O) : 3,35 (t, 8H, CH2CH ₂ CO ₂ H ) ; 3,74 (m, 16H, NCH ₂ );

3,80(t,8Η, CΗ ₂ CH ₂ CO ₂ Η). RMN 13c(δppm,D ₂ O) : 32,0 ;52,4 ; 178,2.

Exemple 2 l,4,7,10-tétra-(2-carboxyéthyl)-l,4,7,10-tétraazacyclotri décane

Selon un protocole expérimental analogue à celui décrit à l'exemple 1, la condensation est réalisée à partir de 1,0 g (0,0053 mol) de tétraazacyciotridécane dans 70 ml d'éthanol absolu et 6,1 g (0,084 mol) d'acide acrylique dans 25 ml d'éthanol absolu. La solution est portée à reflux pendant lOh. Après recristallisation dans l'eau distillée, on isole 1,27 g (0,0027 mol) du produit souhaité (Rdt = 50 ).

RMN !H (δppm, D ₂ O) : 1,8 (4H, q) ; 2,5 (4H, t) ; 2,5 (8H, t) ; 2,6 (4H, t) ; 3,1 (14H, m) RMN ¹³ C (δppm, I>ÃŽO) : 20,5 ; 22,6 ; 32,0 ; 51,4 ; 52,1 ; 52,7 ; 58,1 ; 177,3.

Exemple 3 lAδ.ll-tétra-fë-carboxyéthyD-lAδ.ll-tétraazacvclotétr adécane

Selon un protocole expérimental identique à celui décrit plus haut, on fait réagir 5 g (0,025 mol) de tétraazacyclotétradécane dans 150 ml d'éthanol absolu et 32,4 g (0,449 mol) d'acide acrylique dans 60 ml d'éthanol absolu. Le temps de reflux est de 10 h. Après recristallisation dans l'eau distillée, on isole 9,0 g d'un solide blanc (Rdt = 74 %).

RMN lH (δppm, D ₂ O) : 2,0 (qt, 4H, CH ₂ _CH2_CH ₂ ) ; 2,5 (t, 8H, CH2_CH ₂ -

COOH) ; 2,9 (t, 8H, CH ₂ -CH -COOH) ; 3,1 (m, 16H, N-CH ₂ -CH ₂ -CH2-N et

N-CH ₂ -CΗ ₂ -N)

RMN 13c (δppm, D ₂ O) : 24,0 ; 33,2 ; 50,3 ; 51,0 ; 51,9 ; 180,1.

Spectrométrie de masse. (FΛ.B. négative) : 487 ([M-H]+; 13,6%), 271 ([M-

3CH ₂ CH ₂ COOH-H]+; 35%), 199 ([M-4CH ₂ CH ₂ COOH-H] ⁺ ; 70%).

Exemple 4 1.4.8.12-tétra-(2-carboxyéthvπ-1.4.8.12-tétraazacyclopen tadécane

Selon un protocole analogue à celui décrit à l'exemple 1, la condensation est réalisée à partir de 1,0 g (0,0046 mol) de tétraazacyclopentadécane dans 70 ml d'éthanol absolu et 6,1 g (0,084 mol) d'acide acrylique dans 25 ml d'éthanol absolu. La solution est portée à reflux durant 10 h.

Après recristallisation dans l'eau distillée, on isole 1,2 g du produit souhaité (Rdt =

52 %).

RMN H (δppm, D ₂ O) : 2,46 (q, 6 H) ; 3,20 (t, 8 H) ; 3,72-3,89 (m, 20 H) ; 4,12 (s, 4 H).

RMN 13c (δppm, D2O) : 20,1 ; 22,4 ; 31,3 ; 50,1 ; 51,2 ; 52,1 ; 53,4 ; 58,1 ; 59,1 ;

176,0.

Exemple 5 1.5.9.13-tétra-f2-carboxvéthvlVl.5.9.13-tétraazacvclohexa décane

Selon un protocole analogue à celui décrit à l'exemple 1, la condensation est réalisée à partir de 1,0 g (0,0043 mol) de tétraazacyclohexadécane dans 60 ml d'éthanol absolu et 5,7 g (0,078 mol) d'acide acrylique dans 25 ml d'éthanol absolu. La solution est portée à reflux durant 10 h. Après recristallisation dans l'eau distillée, on isole 1,15 g du produit souhaité (Rdt = 52%).

RMN lH (δppm, D ₂ O) : 2,40 (q, 8 H, CH ₂ CH2CH ₂ ) ; 3,25 (t, 8 H, CH ₂ CH ₂ Cθ2H) ; 3,74-3,85 (m, 24 H, CH ₂ CH CO ₂ H et NCH ₂ ) RMN ¹³ C (δppm, D2O) : 19,7 ; 32,4 ; 50,6 ; 54,0 ; 176,3.

Exemple 6

1.4.8-tris-(2-carboxyéthvO-l .4.8.11 -tétraazacvclotétradécane

Etgpe a l-benzyl-1,4,8,11-tétraazacyclotétradécane (ci-après dérivé 1)

Dans un erlenmeyer de 3 1 sont placés 40 g (0,20 mole) de 1,4,8,11- tétraazacyclotétradécane (cyclame), un large excès de carbonate de potassium anhydre (35 g) et 1,6 1 de chloroforme. Une solution de bromure de benzyle (5 g ;

2,95.10~2 mole) dans 100 ml de chloroforme est additionnée goutte à goutte pendant 1 h. Le mélange réactionnel est ensuite laissé à température ambiante sous

agitation vigoureuse pendant 18 h. Après filtration, le solvant est évaporé et le résidu repris par quatre fois 200 ml d'έther diéthylique anhydre. Les phases éthérées combinées sont évaporées et la procédure est répétée deux fois avec

2 x 30 ml d'éther diéthylique anhydre. Le produit pur est obtenu quantitativement sous forme d'une huile incolore (9,4 g ; 2,95.10"2 mole).

RMN lH (δppm, CDC1 ₃ ) : 1,65-1,84 (qt, 4 H, β-CH ₂ ) ; 2,46-2,84 (mult, 16 H, α-CH ₂ ) ; 3,55 (s, 2 H, CH ₂ Ph) ; 7,27 (mult, 5 H, Ph)

RMN 3c (δppm, CDCI3) : 26,9 ; 29,3 (β-CH ₂ ) ; 48,0 ; 48,6 ; 49,6 ; 49,7 ; 49,9 ;

51,3 ; 53,8 ; 55,3 (α-CH ₂ ) ; 58,4 (CH ₂ Ph) ; 127,4 ; 128,6 ; 129,8 ; 139,3 (Ph).

Etape b

1.4.8-tris-f3-méthvlpropionateVl 1 -benzvl- .4.8.11 -tétraazacvclotétradécane

Le dérivé 1 (3,5 g ; 1,20.10 ^" ^ mole) est dissous dans 30 ml d'éthanol absolu et on ajoute 15 ml de méthylacrylate. Le milieu réactionnel est porté à reflux pendant 4 h, puis laissé à température ambiante pendant 12 h. Après évaporation de la solution, on récupère une huile jaune pâle qui est reprise par

30 ml d'éthanol absolu. Le milieu réactionnel est de nouveau évaporé. Le produit pur est obtenu quantitativement sous forme d'une huile incolore (6,5 g ;

1,18.10-2 mole). RMN lH (δ ppm, CDCI3) : 1,14-1,21 (mult) ; 1,57 (β-CH ₂ ) ; 2,32-2,72 (mult ; α-CH ₂ ) ; 3,46 (CH ₂ Ph) ; 3,57 ; 3,60 ; 3,63 (O-CH3) ; 7,20-7,26 (Ph)

RMN 1 c (δ ppm, CDCI3) : 24,3 ; 24,6 (β-CH ₂ ) ; 33,0 (CH3-O-) ; 51,1 ; 51,7 ;

51,9 (Cycle azoté) ; 60,3 (CH ₂ -Ph) 127,3 ; 128,6 ; 129,4 ; 140,5 (Ph) ; 173,4 ;

173,8 (C=O).

Etape c

1.4.8-tris-(3-méthvlpropionateVl .4.8.11 -tétraazacvclotétradécane

Le dérivé 2 (6,5 g ; 1,18.10~2 mole) est dissous, sous atmosphère inerte, dans 150 ml d'acide acétique désoxygéné avec 1 g de Pd/C à 10 %. Le milieu réactionnel est alors mis sous atmosphère d'hydrogène et l'hydrogénolyse conduite pendant 5 h. Le milieu réactionnel est ensuite filtré sur CELTTE®

(PROLABO, FRANCE), l'acide acétique évaporé et le résidu neutralisé puis amené à pH 12 par une solution de potasse 4 mol/1.

La phase aqueuse est extraite cinq fois par 50 ml de chloroforme. Les phases organiques combinées sont séchées sur MgSθ4, filtrées puis évaporées. Le composé trisubstitué est obtenu sous forme d'une huile jaune pâle (3,35 g ; 7,31.10-3 mole ; Rdt = 62 %).

RMN lH (δ ppm, CDC1 ₃ ) : 1,52 ; 1,62 (qt, β-CH2) ; 2,29-2,73 (mult ; α-CH ₂ et β-CH ₂ ) ; 3,59 ; 3,60 ; 3,61 (O-CH3)

RMN 13c (δ ppm, CDCI3) : 25,7 ; 26,5 ( β-CH ₂ ) ; 31,5 ; 32,0 ; 32,1 (CH3-O) ; 47,8 ; 48,4 ; 49,3 ; 49,4 ; 50,6 ; 51,2 ; 51,6 ; 52,0 ; 52,2 ; 53,1 ; 54,1 (cycle azoté) ; 173,3 ; 173,8 ; 173,9 (C=O).

____££___

1.4.8-tris-(2-carboxyéthvD-1.4.8.11 -tétraazacvclotétradécane

Le dérivé 3_ (0,9 g ; 1,96.10"3 mole) est dissous dans 5 ml de méthanol et refroidi à 5*C par un bain d'eau-glace. On ajoute lentement 0,175 g d'hydroxyde de sodium dissous dans 10 ml d'eau distillée. Le milieu réactionnel est maintenu à

5*C pendant 1 h, puis laissé à température ambiante pendant 24 h. Les solvants sont évaporés et le produit blanc obtenu sous forme sodique est séché sous vide pendant 1 h. Il est ensuite repris par 50 ml d'éthanol absolu et refroidi à -10*C.

Après addition de 1 ml d'acide chlorhydrique concentré, un solide blanc précipite (1,0 g). Le composé protoné ainsi obtenu est purifié sur résine échangeuse d'ions

(Dowex® 50X8.200, commercialisé par Aldrich). Après lavages à l'eau et élution par une solution d'ammoniaque (0,5 mol/1), le dérive neutre est isolé sous forme d'un solide blanc (0,15 g).

RMN lH (δ ppm, CDCI3) : 1,63 (mult) ; 2,29 (qt, β-CH ₂ ) ; 2,44-2,69 (mult) RMN 13c (δ ppm, CDCI3) : 24,5 ; 25,8 (β-CH ₂ ) ; 32,3 ; 34,7 ; 37,7 (β-CH ₂ ) ;

44,8 ; 45,7 ; 48,7 ; 48,9 ; 49,3 ; 50,0 ; 51,7 ; 52,2 ; 52,4 ; 52,6 ; 52,8 (α-CH ₂ ) ;

179,3 ; 182,4 ; 182,7 (C=O).

Exemple 7 1.4.8.11-tétra-f2-carbamovéthvn-1.4.8.11-tétraazacvcloté tradécane

On dissout à température ambiante 1,5 g de 1 ,4,8,11-tétraazacyclo- tétradécane dans 100 ml d'éthanol absolu. On additionne ensuite lentement 10 g d'acrylamide dissous dans 75 ml d'éthanol absolu. Le milieu réactionnel est ensuite porté à reflux pendant 4 h. Un produit blanc précipite qui est filtré puis lavé de nombreuses fois à l'éthanol et séché sous vide (m = 2,90 g ; Rdt = 80 %).

RMN lH (δ ppm, D ₂ O) : 1,66 (qt, 4H) ; 2,43 (t, 8H) ; 2,56 (t, 8H) ; 2,66 (s, 8H) ;

2,77 (t, 8H)

RMN 13c (δ ppm, D ₂ O ) : 23,4 ; 35,4 ; 50,1 ; 52,7 ; 53,5 ; 180,6

IR (Nujol, cm-1) : 1671,3 (v C=O) Spectrométrie de masse (DCI) : 485 [M + H]+, 414 [M-(CH ₂ -CH ₂ -CONH2)] ⁺ ,

343 [M-2(CH2-CH ₂ -CONH2)] ⁺ , 272 [M-3(CH ₂ -CH ₂ -CONH ₂ )] ⁺ , 201 [M-

4(CH ₂ -CH ₂ -CONH2)] ⁺

Analyse élémentaire : C22H44Ngθ4, 2H O. Trouvée : C : 50,9%, H : 9,3%, N :

21,5%. Calculée : C : 50,77%, H : 9,23%, N : 21,54%.

Exemple 8

1.4.8.11-tétra-f3-éthylpropionateWl .4.8. 1 -tétraazacvclotétradécane

On dissout à température ambiante 1-5 g de 1,4,8,11-tétraazacyclo- tétradécane (cyclame) dans 40 ml d'éthanol absolu. On additionne ensuite lentement 10 g d'acrylate d'ethyle dissous dans 25 ml d'éthanol absolu. Le milieu réactionnel est ensuite porté à reflux pendant 4 h.

Après évaporation sous pression réduite, on récupère une huile limpide qui est séchée sous vide (m = 4,15 g ; Rdt = 92,2 %).

RMN lH (δ ppm, CDC1 ₃ ) : 1,24 (t) ; 1,50 (q) ; 2,40 (m) ; 2,47 (s) ; 2,71 (t) ; 4,09 (q)

RMN 13c (δ ppm, CDCI3) : 14,6 ; 24,5 ; 33,1 ; 51,0 ; 51,6 ; 51,7 ; 60,6 ; 173,1 Spectrométrie de masse (DCI) : M+l à 601

Exemple 9 :

Synthèse du l.l'-o-xylénylènebis (1.4.8.11 -tétraazacvclotétradécane

Etape a

1 ,4,8-tris(tert-buty loxy carbony 1)- 1 ,4,8, 11 -tétraazacy clotétradécane (ci -après dérivé _)

On dissout à température ambiante 5 g (0,025 mol) de 1,4,8,11- tétraazacyclotétradécane (cyclame) dans 1,2 1 de dichlorométhane distillé. On ajoute goutte à goutte pendant une heure 2,5 équivalents de di-tert-

butyldicarbonate (13,6 g ; 0,0625 mol) dissous dans 100 ml de dichlorométhane distillé. Après agitation à température ambiante pendant 6 h et évaporation du solvant, le brut réactionnel est chromatographié sur gel de silice (5 x 40 cm). La fraction recueillie avec l'éluant MeOH/CH2Cl2 (3 à 8 % en MeOH) est évaporée et le solide blanc isolé est séché sous vide. Le composé trisubstitué est obtenu avec un rendement de 65 % (8,1 g ; 0,016 mol). RMN lH (CDC1 ₃ ) . δ(ppm) : t-Bu (s, 3x9H) : 1,45 β-CH ₂ (signal large; 2x2H) : 1,70 ; 1,92 CH ₂ NH (t; 2x2H) : 2,60 ; 2,77 CH ₂ NBoc (signal large; 6x2H) : 3,27-3,39

RMN 13c (CDCI3) . δ(ppm) : t-Bu : 29,1 ; 79,8 α-CH ₂ : 44,7 ; 46,5 ; 47,3 ; 48,3 ; 50,6 ; 51,1 CO : 156,0 ; 156,8 Spectrométrie de masse (DCI) : m/z = 501 ([M+H] ⁺ ) ; 400 ([M-Boc]+) ; 299 ([M- 2Boc]+) ; 199 ([M-3Boc]+).

Etape b

1 , l'-phtaloylbis(4,8,l 1 -tris(tert-buty loxycarbonyl)- 1 ,4,8,11 -tétraazacyclo- tétradécane) (ci-après dérivé 2)

BOC

A 2,78 g (5,55 mmol) du dérivé i dissous sous argon dans 50 ml de THF et

0,2 ml de triéthylamine, sont ajoutés 0,4 ml (2,78 mmol) de dichlorure de phtaloyle dilué dans 30 ml de THF. Après agitation pendant 1 h, la solution est versée dans 20 ml d'une solution de potasse à 2 mol.l~l et la phase aqueuse est extraite deux fois au chloroforme. La phase organique est sέchée puis évaporée et

à_

le résidu chromatographié sur gel de silice (5 x 10 cm) en éluant avec un mélange MeOH / CH2CI2 (1 à 3 % en MeOH). La fraction recueillie est évaporée puis séchée, le biscyclame pur est obtenu avec un rendement de 97 % (3,04 g).

Spectrométrie de masse (DCI) : m/z = 1132 ([M+H]+) ; 1032 ([M-Boc]+) ; 531 ([M-6Boc]+).

Etape c l,l'-phtaloylbis(l,4,8,ll-tétraazacyclotétradécane) (ci-après dérivé 3)

A 13,3 g (88,5 mmol) d'iodure de sodium anhydre est ajouté sous atmosphère d'argon 9,61 g (88,5 mmol) de chlorure de triméthylsilyle, et la suspension est agitée pendant 3 h à température ambiante. Le dérivé 2 (1 g ; 8,85.10-4 mol) dissous dans 10 ml de dichlorométhane sous atmosphère d'argon est alors additionné goutte à goutte. Après agitation pendant 15 min, 3 ml de méthanol sont ajoutés puis les solvants évaporés. Le résidu est repris dans 50 ml de chloroforme et 20 ml d'eau, 1 g de thiosulfate de sodium et des pastilles de potasse (= 5g) sont ensuite ajoutées afin d'ajuster le pH à une valeur supérieure à 10. Après quatre extractions de la phase aqueuse au chloroforme, séchage et évaporation, un solide blanc est isolé avec un rendement de 93 % (436 mg). RMN H (CDCI3) . δ(ppm) : β-CH ₂ (q; 4x2H) : 1,62 ; 1,85 ; 1,94 α-CH ₂ (m, 16x2H) : 2,75-3,73 xylényle(d, 2x2H) : 7,28 ; 7,41 RMN 13c (CDCI3) . δ(ppm) : β-CH ₂ : 25,9 ; 26,2 ; 28,3 ; 28,8 α-CH ₂ : 43,5-50,3 xylényle : 126,6 ; 126,9 ; 129,4 ; 135,6. CO pontant : 171,0

Spectrométrie de masse (DCI) : m/z = 530 ([M] ⁺ )

Etape d l,l'-o-xylénylènebis(l, 4,8,11-tétraazacyclotétradécane) (ci-après dérivé 4)

A une solution de 3,28 g (2,9 mmol) du dérivé 3 dans 6 ml de THF sont ajoutés, sous atmosphère d'argon et à 0*C, 25 ml d'une solution de diborane à 1 mol.1-1 dans le THF. Après chauffage pendant 24 h, la solution est refroidie à 10'C et l'excès de diborane est hydrolyse par 5 ml du mélange MeOH/ H2O (1/1). La solution est alors évaporée et le résidu porté à reflux dans 25 ml d'acide chlorhydrique (6 mol.l~l) pendant 3 h. La solution refroidie est ajustée à pH>10 et après cinq extractions au chloroforme, séchage et évaporation, le résidu est repris dans 20 ml de toluène puis filtré. L'évaporation du solvant et le séchage sous vide conduit à un solide blanc avec un rendement de 60% (874 mg). Spectrométrie de masse (DCI) : m/z = 504 ([M+H]+) ; 307 ([M-cyclame]+)

Exemple de préparation de complexe de Gdlϋ selon l'invention Exemple 10

1.4.8.1 l-r2-carboxyéthvn-1.4.8.11-tétraazacvclotétradécane/Gd mn

On fait réagir une solution aqueuse de 1,4,8,1 l-tétra-(2- carboxyéthyl)-l,4,8,ll-tétraazacyclotétradécane 0,04 molaire tamponnée par ajout d'un tampon (acide acétique/acétate de sodium = 1/1 ; pKa = 4,7) avec une solution équimoléculaire de nitrate de gadolinium (Gd(N03)3, 5H2O) préparée dans le même tampon. Des cristaux incolores de [(TETP, Gd(III)), 6H2O] ont été obtenus par évaporation lente à 293 K du mélange réactionnel et isolés à l'état

monocristallin. Une analyse diffractométrique a ainsi permis de caractériser le complexe isolé à l'état solide.

Analyse élémentaire: GdC22N4θ H37,6H2θ (750,25 g/mol). Trouvée : C : 34,0%, H : 6,2%, N : 8,9%, Gd 18,9 %. Calculée : C : 35,2%, H : 6,5%, N : 7,5%, Gd : 20,9%.

DIFFRACTION X :

L'analyse diffractométrique a permis de montrer que le complexe obtenu cristallise dans le système monoclinique avec le mode de réseau C, groupe Spatial C2/c. Le ligand l,4,8,ll-(2-carboxyéthyl)-l,4,8,ll- tétraazacyclotétradécane (TETP) n'est pas coordiné à l'atome de gadolinium via les atomes d'azote du cycle mais en revanche l'élément métallique est lié à quatre atomes d'oxygène de quatre groupements carboxylate appartenant à quatre ligands TETP différents (avec une distance de liaison moyenne < Gd-O > = 2,35 Â). L'atome de gadolinium est de plus coordiné à quatre molécules d'eau.

Données cristallographiques

Exemple 11

Synthèse du complexe 1.4.8-tris-f2-carboxvéthvn-l.4.8.11- tétraazacvclotétradécane/gadolinium

On fait réagir une solution aqueuse de l,4,8-tris-(2-carboxyéthyl)- 1,4,8,11-tétraazacyclotétradécane 0,1 molaire avec une solution équimoléculaire de nitrate de gadolinium (Gd(N03)3, 5H2O) préparée dans le même solvant. La formation du complexe est contrôlée par R.M.N. H.

Exemple 12

Synthèse des complexes DOPT/Gdffln et TE3P/Gdflffî

Les complexes DOPT/Gd(III) et TE3P/Gd(III) ont été synthétisés selon les conditions expérimentales déjà décrites dans la littérature dans le cas du complexe DOTA Gd(III). A un équivalent de macrocyle dissous dans le minimum d'eau (dont le pH est préalablement ajusté à 10 par addition de soude en pastilles) est ajouté 0,9 équivalent d'oxyde de gadolinium dissous dans le même solvant. Le milieu réactionnel est chauffé au reflux du solvant pendant 12 h. Le précipité formé lors de la réaction est éliminé par filtration sur fritte n ^* 4 et le filtrat est évaporé sous pression réduite. Après séchage sous vide pendant 4 h, le complexe attendu est isolé sous forme d'un solide de couleur blanc qui est utilisé sans purifications ultérieures pour les mesures de temps de relaxation.

Exemple 13

Etude des propriétés paramagnétiques des complexes conformes à l'invention

Rappel théorique

L'ajout d'une substance paramagnétique dans une solution aqueuse augmente les fréquences de relaxation longitudinale et transversale, respectivement

1 Tι et I/I2, des atomes d'hydrogène des molécules d'eau. Les contributions diamagnétiques et paramagnétiques s'additionnent et peuvent être données par l'équation ci-dessous (éq. 1) :

(I^i)obs = (1 i)d + (l^i)p P ^our * = !> ² (1)

A

où :

(l/Ti)obs correspond à la fréquence de relaxation observée en présence d'une substance paramagnetique ; (1/Tj)d correspond à la fréquence de relaxation (diamagnétique) du solvant en l'absence de substance paramagnetique ;

(1/Tj)p correspond à la contribution paramagnetique du complexe dissous (soluté). En l'absence d'interactions de type soluté-soluté, il a été établi que la fréquence de relaxation du solvant dépend linéairement de la concentration en espèces paramagnétiques [M]. La "relaxivité" Rj d'une substance M est ainsi définie comme la pente de la droite 1/Tj = f([M]) exprimée en M- s ^" l ou plus communément en mM-ls"l (éq.2) :

(l^i)obs = (1 Ti)d + Rj[M] pour i = 1, 2 (2)

Les valeurs de "relaxivité" de complexes paramagnétiques dépendent fortement de la fréquence d'enregistrement des signaux RMN (F en Mhz) mais également de la température et de la viscosité. En solution aqueuse, l'équation 2 est vérifiée pour des concentrations en complexe paramagnetique comprises entre 10"4 et 5.10~3 _mo l/l. L'ordonnée à l'origine est généralement de 0,25 à 0,35 s"l lorsqu'on utilise de l'eau distillée et désoxygénée. Pour des composés purs, les mesures sont reproductibles à 5 % près. Il est généralement recommandé de réaliser les mesures pour différentes gammes de fréquence, cependant aucun spectromètre RMN ne permet de moduler la fréquence d'observation des noyaux.

Il est à noter qu'aucune mesure systématique de "relaxivité" en fonction de la concentration in vivo de la substance paramagnetique n'a, à notre connaissance, été réalisée à ce jour. Toutefois, des mesures ex vivo laissent supposer que la valeur 1/T _j peut ne pas être, pour certains tissus, linéairement dépendante de la concentration [M].

Mesures expérimentales

Les mesures de "relaxivité" ont été réalisées à 400 MHz sur quatre échantillons et chaque échantillon a été étudié à cinq concentrations différentes. Les mesures ont été réalisées à 295 K et les solutions en eau légère placées dans un tube capillaire de 1 mm ; ce capillaire est ensuite introduit dans une cellule de 5

mm contenant de l'eau deutérée. Les complexes ont été dissous en présence d'un équivalent de N-méthyl-D-glucamine (méglumine) afin de comparer les résultats avec ceux obtenus sur un échantillon commercial de DOTAREM® (DOTA/Gd ¹¹¹ ). Des mesures ont également été réalisées à 20 MHz à une température de 37*C.

Tableau 1 : Valeurs de Temps de Relaxation (en secondes)

Concentration (mol/1)

4,75.10-3 3,80.10- ³ 2,85.10-3 1,90.10-3 0,95.10-3

GdDI seul 1,75.10-2 2,25.10-2 2,97.10-2 4,56.10-2 9,39.10-2 DOTA/GdHI 5,49.10-2 6,96.10-2 9,35.10-2 13,84.10-2 17,17.10-2

TETP/Gd ¹¹ ! 2,70.10-2 3,32.10-2 3,99.10-2 7,22.10-2 8,67.10-2 TE3P/Gd--Ï€ 1,69.10-2 2,25.10-2 2,93.10-2 4,42.10-2 10,15.10-2

Tableau 2 : Mesures de Relaxivité réalisées à 400 MHz*

GdlΗ _seu ι DOTA/Gdπi TETP/Gd ^m TE3P/Gdπi

"relaxivité"

Rj en 12,15 3,85 6,64 12,64 mM""ls~l

Coefficient de régression 0,99969 0,99973 0,99879 0,99858 linéaire r

⁴¹ correspondant à la pente de la droite l/Tj-f([M])

Tableau 3: Mesures de "relaxivité" réalisées à 20 MHz

Complexe DTPA/GdDI DOTA/Gd ¹¹ ! DOTP/Gd ^m TETP/Gdl ¹¹

"relaxivité"

Ri en 3,7 3,3 5,5 5,7 mM- ¹

Coefficient de régression 0,99876 0,99916 0,99920 0,99989 linéaire r

Abréviations utilisées :

DOTP : l,4,7,10-tétra-(2-carboxyéthyl)-l,4,7,10-tétraazacylclodo décane TETP : l,4,8,ll-tétra-(2-carboxyéthyl)-l,4,8,ll-tétraazacycloté tradécane TE3P : l,4,8-tris-(2-carboxyéthyl)-l,4,8,ll-tétraazacyclotétradà ©cane

La valeur obtenue dans le cas du DOTA/GdlH est très proche de celle décrite dans la littérature. A titre d'exemple, à 20 Mhz, 20^=3^ mM-ls ^_ l pour le complexe DOTA/GdHl (Références : Tweedle M.F. Lanthanide Probes in Life, Chemical and earth Sciences, Elsevier Ed. .' Amsterdam, 1989 127-179. et b) Alexander, V Chem. Rev. 1995, 95 273-342). Les valeurs de "relaxivitc" obtenues respectivement dans le cas du cyclame tétrapropionate/Gd^^ et du cyclame tripropionate/GdlH sont dans les deux cas supérieures à celle du DOTA/Gd^'.