以下、本発明の好適な実施形態について� ��細に説明する。

  MGAT2
 本発明のMGAT2遺伝子(当該遺伝子によってコ� ��ドされるタンパク質を「MGAT2」と表す)は、� ��ト(Accession No. NM_ 025098:配列番号1及び2)と� �ウス(Accession No. AY157609:配列番号3及び4)等に ついて知られている。

 また、本発明のMGAT2は上記の例に限定さ� �ず、上記MGA2と機能的に同等なタンパク質も� ��む。機能的に同等なタンパク質には、天然� ��MGAT2のアミノ酸配列において1又は2以上のア ミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入さ� �たアミノ酸配列からなるタンパク質が含ま� �る。本発明のMGAT2と機能的に同等な変異タン パク質をコードするDNAを調製するために、当 業者によく知られた他の方法としては、スト リンジェントな条件下でのハイブリダイゼー ション技術やポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術� ��利用する方法が挙げられる。

 本発明においてストリンジェントなハイ� ��リダイゼーション条件とは、6M尿素、0.4%SDS� ��0.5×SSCの条件又はこれと同等のストリンジ� �ンシーのハイブリダイゼーション条件をさ� �。よりストリンジェンシーの高い条件、例� �ば、6M尿素、0.4%SDS、0.1×SSCの条件下では、よ り相同性の高いDNAを単離できると期待される 。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少な くとも55%以上、好ましくは70%以上、より好ま しくは90%以上、特に好ましくは95%以上の配列 の同一性を指す。また、変異体における、変 異するアミノ酸数は、通常、30アミノ酸以内� ��あり、好ましくは15アミノ酸以内であり、� �り好ましくは5アミノ酸以内、さらに好まし� ��は3アミノ酸以内であり、特に好ましくは2� �ミノ酸以内である。ここで、アミノ酸配列� �塩基配列の同一性は、カーリンおよびアル� �ュールによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Aca d. Sci. USA、第87巻、2264頁、1990年;Proc. Natl. A cad. Sci. USA、第90巻、5873頁、1993年)を用いて� ��定することができる。BLASTのアルゴリズム� �基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラム� �開発されており(J. Mol/ Biol.、第215巻、403頁� ��1990年)、BLASTNを用いて塩基配列を解析する� �合は、パラメーターは、例えばscore=100、wordl ength=3とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸� �列を解析する場合は、パラメータは、例え� �、score=50、wordlength=3とする。

 本発明に用いられるMGAT2が由来する生物� �としては、特に限定されないが、例えば、� �ト、マウス、ラット、サル、モルモット、� �タ、フェレットを挙げることができる。

  遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び遺 伝子改変非ヒト動物細胞
 本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、MGAT 2遺伝子の発現が人為的に抑制されているこ� �を特徴とする。

 本発明において「MGAT2遺伝子の発現が人� �的に抑制されている」とは、通常、MGAT2遺伝 子の遺伝子対の一方または双方に、ヌクレオ チドの挿入、欠失、置換等の遺伝子変異を有 することにより該遺伝子の発現が抑制されて いる状態を指す。正常なMGAT2タンパク質とし� ��の機能が減少または喪失している変異MGAT2� �ンパク質が発現している場合も、この「MGAT2 遺伝子の発現の抑制」に含まれる。上記「抑 制」には、MGAT2遺伝子の発現が完全に抑制さ� ��ている場合のほか、当該遺伝子の遺伝子対� ��一方の遺伝子の発現のみが抑制されている� ��合も含まれる。本発明における遺伝子変異� ��存在する部位は、MGAT2遺伝子の発現が抑制� �れるような部位であれば特に制限されず、� �えばエクソン部位、プロモーター部位等を� �げることができる。

 本発明においてMGAT2遺伝子の改変の対象� �なる動物が由来する生物種は、通常、ヒト� �外の哺乳動物であり、好ましくはマウス、� �ット、ハムスター、ウサギ、ブタ等のげっ� �類であり、その中でも特にマウスが好まし� �。

 また、本発明は、MGAT2遺伝子の発現が人� �的に抑制されていることを特徴とする遺伝� �改変哺乳動物細胞を提供する。このような� �胞は、脂質代謝の異常に起因する疾患のモ� �ル細胞として有用である。本発明においてMG AT2遺伝子の改変の対象となる細胞が由来する 生物種は、特に制限はなく、ヒトを含む種々 の生物種由来の細胞である。また、本発明に おいてMGAT2遺伝子の改変の対象となる細胞の� ��類としては、例えば、体細胞、受精卵、ES� �胞、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物か� �樹立された細胞が挙げられるが、これらに� �定されない。上記遺伝子改変非ヒト哺乳動� �由来の細胞株を樹立する方法としては、公� �の方法を利用することができるが、例えば� �げっ歯類においては、胎仔細胞の初代培養� �方法を用いることが可能である。

 本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び� ��伝子改変非ヒト哺乳動物細胞において、MGAT 2遺伝子の発現を人為的に抑制する手段とし� �は、MGAT2遺伝子全体又はその一部を欠損させ る方法やMGAT2遺伝子の発現制御領域の全部又� ��その一部を欠損させる方法等を挙げること� ��できるが、好ましくはMGAT2遺伝子の遺伝子� �の一方又は双方に外来遺伝子を挿入するこ� �によりMGAT2遺伝子を不活性化する方法である 。すなわち、本発明の好ましい態様において 、遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び遺伝子改変 非ヒト哺乳動物細胞は、MGAT2遺伝子の遺伝子� ��の一方又は双方に外来遺伝子が挿入されて� ��ることを特徴とする。

 本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、� ��業者に公知の遺伝子工学技術により作製す� ��ことができる。例えば、以下のようにして� ��伝子改変マウスを作製することができる。� ��ず、マウスからMGAT2遺伝子のエクソン部分� �含むDNAを単離し、遺伝子工学的手法によりMG AT2遺伝子配列の一部又は全部を削除、若しく は他遺伝子を挿入又は置換する。一般に、MGA T2遺伝子配列の一部又は全部に適当なマーカ� ��遺伝子を挿入し、ターゲティングベクター� ��構築する。挿入するマーカー遺伝子として� ��、ネオマイシン耐性遺伝子やハイグロマイ� ��ン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子;β- ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)、クロラムフェ ニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子 (cat)、ルシフェラーゼ遺伝子又はGFP(Green Fluor escent Protein)遺伝子のようなレポーター遺伝� �が好ましい。抗生物質耐性遺伝子を挿入し� �場合には、抗生物質を含む培地で培養する� �けで相同組み換えを生じた細胞株を選抜す� �ことができる。また、より効率的な選抜を� �うためには、ターゲティングベクターにチ� �ジンキナーゼ遺伝子などを結合させておく� �とも可能である。これにより、非相同組み� �えを起こした細胞株を排除することができ� �。また、レポーター遺伝子を挿入してエキ� �ンの機能を破壊する場合、当該レポーター� �伝子は、MGAT2のプロモーターの制御下で発現 するように挿入することが好ましい。また、 ターゲティングベクターの調製に用いるベク ターとしては、例えば、pBR322、pBR325、pUC12、p UB110、pTB5、pSH19、pSH15、pKOを挙げることがで� �る。

 また、細胞内における遺伝子の組み換え� ��誘導するシステムを利用することもできる� ��このようなシステムとしては、例えば、Cre- loxPシステム、FLP-FRTシステムを挙げることが� ��きる。Cre-loxシステムは、loxPと呼ばれる特� �の塩基配列からなるDNAと、loxP配列を認識し� ��遺伝子を組み換えるCreリコンビナーゼと呼� ��れる酵素によって構成される。Creはバクテ� ��オファージP1から得られたリコンビナーゼ� �あり、ターゲティングベクターに所望の領� �を2つのloxP配列で挟むようにloxP配列を導入� �ることにより、loxP配列で挟まれた領域をCre� ��コンビナーゼ酵素によって切り出すことが� ��きるシステムを構築することができる。例� ��ば、上述のマーカー遺伝子やレポーター遺� ��子を2つのloxP配列で挟むような構造をした� �ーゲティングベクターを作製し、これを用� �て遺伝子改変動物を作製する。こうして作� �された動物と、Creリコンビナーゼを発現し� �マウスとを交配することにより、CreがloxP配� ��を認識してDNAを組み換える。その結果、loxP 配列同士の接合が生じ、loxP配列の間に配置� �れたマーカー遺伝子やレポーター遺伝子が� �かれた遺伝子改変動物を得ることができる� �

 また、Creリコンビナーゼを発現するトラ� ��スジェニック動物は、公知の方法により作� ��することができ、例えば、適当な発現制御� ��域の下流にCreリコンビナーゼ遺伝子(Accession  No. X03453)を配置した発現ベクターを、未受� ��卵、受精卵、精子及びその始原細胞を含む� ��芽細胞などに導入し、一晩程度培養した後� ��代理母の卵管に移植し、トランスジェニッ� ��キメラ動物を得る。得られたトランスジェ� ��ックキメラ動物は、その体細胞の遺伝子を� ��析することによって、ゲノムにベクターの� ��ンストラクトが組み込まれていることを確� ��し、正常な動物と交配させる。交配によっ� ��得られたF1動物はヘテロザイゴートのトラ� �スジェニック動物であり、F1を掛け合わせる ことで、ホモザイゴートのCreトランスジェニ ック動物を得ることができる。

 Cre-loxPシステム等によってマーカー遺伝� �やレポーター遺伝子が除かれた遺伝子改変� �位を有する動物は、マーカー遺伝子やレポ� �ター遺伝子の存在によって生じ得る表現系� �示すことがないため、解析の対象となるMGAT2 にのみ焦点をあてた表現系解析が可能となる 。

 こうして得られたターゲティングベクタ� ��をエレクトロポーレーション法等によりマ� ��ス等のES細胞株に導入し、相同組み換えを� �じた細胞株を選抜する。具体的には、ター� �ティングベクターを非ヒト哺乳動物ES細胞又 は非ヒト動物卵細胞に公知の方法(エレクト� �ポレーション法、マイクロインジェクショ� �法、リン酸カルシウム法、リポフェクショ� �法、パーティクルガン法等)によって導入し� ��ターゲティングベクターに含まれる不活性� ��されたMGAT2遺伝子配列を相同組換えにより� �非ヒト動物ES細胞又は非ヒト動物卵細胞の染 色体上のMGAT2遺伝子と入れ替えることにより� ��抜することができる。

 MGAT2遺伝子がノックアウトされた細胞は� �MGAT2遺伝子上又はその近傍のDNA配列をプロー ブとしたサザンハイブリダイゼーション解析 又はターゲティングベクター上のDNA配列とMGA T2遺伝子近傍領域のDNA配列とをプライマーと� ��たPCR法による解析で判定することができる� ��

 非ヒト動物ES細胞を用いた場合は、相同� �換えにより、MGAT2遺伝子が不活性化された細 胞株をクローニングし、その細胞を胚形成の 初期の適当な時期、例えば、8細胞期の非ヒ� �動物胚または胚盤胞に注入し、又はMGAT2遺伝 子が不活性化されたES細胞塊を2個の8細胞期� �ではさみ込むことにより作製したキメラ胚� �偽妊娠させた非ヒト動物の子宮に移植する� �

 作出された動物は正常なMGAT2遺伝子座を� �する細胞と人為的に変異したMGAT2遺伝子座を もつ細胞との両者から構成されるキメラ動物 である。当該キメラ動物の生殖細胞の一部が 変異したMGAT2遺伝子座をもつ場合、このよう� ��キメラ個体と正常個体を交配することによ� ��得られた個体群より、全ての組織が人為的� ��変異を加えたMGAT2遺伝子座をもつ細胞で構� �された個体を、例えば、コートカラーの判� �等により選別することにより得られる。こ� �ようにして得られた個体は、通常、MGAT2ヘテ ロ発現不全個体であり、MGAT2ヘテロ発現不全� ��体同志を交配し、それらの産仔からMGAT2ホ� �発現不全個体を得ることができる。

 卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細� ��核内にマイクロインジェクション法で遺伝� ��溶液を注入することによりターゲティング� ��クターを染色体内に導入したトランスジェ� ��ック非ヒト動物を得ることができ、これら� ��トランスジェニック非ヒト動物を比較する� ��とにより、相同組換えによりMGAT2遺伝子座� �変異のあるものを選択することにより得ら� �る。

 MGAT2遺伝子発現不全非ヒト動物は、当該� �物のMGAT2のmRNA量を公知の方法を用いて測定� �て間接的にその発現量を比較することによ� �、正常動物と区別することが可能である。

 このようにしてMGAT2遺伝子がノックアウ� �されている個体は、交配により得られた動� �個体もMGAT2遺伝子がノックアウトされている ことを確認して通常の飼育環境で飼育継代を 行なうことができる。さらに、生殖系列の取 得および保持についても公知の方法に従って 行うことができる。すなわち、MGAT2の不活化� ��伝子配列を保有する雌雄の動物を交配する� ��とにより、不活化遺伝子配列を相同染色体� ��両方に持つホモザイゴート動物を取得する� ��とができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄� ��交配することにより、MGAT2不活化遺伝子配� �を有するホモザイゴート及びヘテロザイゴ� �ト動物を繁殖継代することができる。この� �うにして得られたMGAT2不活化遺伝子配列を有 する動物の子孫も本発明のMGAT2遺伝子発現不� ��非ヒト動物に含まれる。

 MGAT2遺伝子の発現が抑制された遺伝子改� �非ヒト哺乳動物は、以下のような表現系、� �なわち、体重及び体脂肪率の減少、血漿TG、 コレステロール、グルコース量、血中遊離脂 肪酸及び肝中TGの低下が見られる。これらは� ��いずれも脂質の代謝に関連するパラメータ� ��あり、遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、高脂� ��症、糖尿病、肥満をはじめとするいわゆる� ��タボリックシンドロームの症状の改善症状� ��呈している。血中で、アポ蛋白と結びつい� ��コレステロール・中性脂肪又はリン脂質か� ��形成されるリポ蛋白(カイロミクロン、超比 重リポ蛋白(VLDL)、低比重リポ蛋白(LDL)、高比� ��リポ蛋白(HDL)のうち、LDLコレステロールが14 0mg/dl以上、HDLコレステロールが40mg/dl未満で� �り、且つ、総コレステロール(TC)が220mg/dl以� �、TGが150mg/dl以上である場合に、高脂血症と� ��断される。高脂血症は動脈硬化の主要な原� ��となり、動脈硬化はさらに虚血性心疾患(狭 心症・心筋梗塞)、脳卒中(脳出血・脳梗塞)、 腎障害(腎動脈硬化症、腎不全)、眼底異常(眼 底出血、失明)、四肢血行障害(間欠性跛行、� ��疽)等の原因となることが知られている。す なわち、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物 を使用することにより、これらの疾患をはじ めとする脂質代謝の異常に起因する疾患の予 防又は治療に有効な化合物の評価、スクリー ニングを行うことが可能となる。

 一方、本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動� ��は、上述のような生理的症状を呈すること� ��ら、低脂血症のモデル動物としても有用で� ��る。血液中に存在するコレステロール、ト� ��グリセライド、リン脂質及び遊離脂肪酸の4 種類の脂質のうち、いずれか1つが正常以下� �なれば低脂血症と診断される。低脂血症の� �因となる疾患としては、例えば、無(低)βリ� ��蛋白血症、アポ蛋白B異常症、Anderson病、Tang ier病、アポA-I欠損(変異体)症、慢性肝炎、甲� ��腺機能亢進症、肝硬変、溶血性貧血、慢性� ��炎、白血病、吸収不良症候群、悪性リンパ� ��、アジソン病、慢性(急性)炎症、悪性腫瘍� �脾腫、感染症、肥満、2型糖尿病、慢性肝炎� ��骨髄増殖性疾患、腎不全、悪性腫瘍、低栄� ��、ネフローゼ症候群、吸収不良症候群を挙� ��ることができる。すなわち、本発明の遺伝� ��改変非ヒト哺乳動物を使用することにより� ��これらの疾患をはじめとする脂質代謝の異� ��によって血中の脂質が低下する症状を呈す� ��疾患、あるいは、当該症状を原因とする疾� ��の予防又は治療に有効な化合物の評価、ス� ��リーニングを行うことが可能となる。

  遺伝子改変非ヒト哺乳動物(細胞)� ��用いる、化合物のスクリーニング
 本発明の脂質代謝異常に起因する疾患の予� ��又は治療に有効な化合物のスクリーニング� ��法は、MGAT2遺伝子の発現が人為的に抑制さ� �ている遺伝子改変非ヒト哺乳動物又は当該� �乳動物に由来する組織若しくは細胞を用い� �ことを特徴とする。

 当該スクリーニング方法において用いら� ��る遺伝子改変非ヒト哺乳動物としては、そ� ��MGAT2の抑制方法について特に制限はないが� �例えば、MGAT2遺伝子がレポーター遺伝子を導 入することにより不活性化され、当該レポー ター遺伝子がMGAT2遺伝子に対するプロモータ� ��の制御下で発現しうるものが用いられる。� ��ポーター遺伝子としては、例えば、β-ガラ� ��トシダーゼ遺伝子(lacZ)、クロラムフェニコ� ��ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(cat)� �ルシフェラーゼ遺伝子又はGFP(Green Fluorescent� �Protein)遺伝子を挙げることができる。

 MGAT2遺伝子をレポーター遺伝子で置換し� �遺伝子改変非ヒト哺乳動物では、レポータ� �遺伝子がMGAT2に対するプロモーターの支配下 に存在するので、レポーター遺伝子がコード する物質の発現をトレースすることにより、 プロモーターの活性を検出することができる 。例えば、MGAT2遺伝子領域の一部をlacZで置換 した場合、本来、MGAT2が発現する組織で、MGAT 2の代わりにβ-ガラクトシダーゼが発現する� �従って、例えば、X-galのようなβ-ガラクトシ ダーゼの基質となる試薬を用いて染色するこ とにより、MGAT2の生体内の発現を観察するこ� ��ができる。具体的には、MGAT2遺伝子欠損マ� �ス又はその組織切片をグルタルアルデヒド� �で固定し、リン酸緩衝液(PBS)で洗浄後、X-gal� ��含む染色液で、37℃程度で30~60分反応させた 後、組織標本を1mM EDTA/PBS溶液で洗浄するこ� �によって、β-ガラクトシダーゼ反応を停止� �せ、呈色を観察すればよい。

 例えば、当該スクリーニング方法におい� ��、遺伝子改変非ヒト哺乳動物に被検化合物� ��投与し、レポータータンパク質の発現が増� ��した場合、当該被検化合物は、MGAT2遺伝子� �プロモーター活性を増強する物質として選� �することができる。一方、レポータータン� �ク質の発現が減少した場合、当該被検化合� �は、MGAT2遺伝子のプロモーター活性を阻害す る物質として選択できる。MGAT2遺伝子のプロ� ��ーター活性を増強又は阻害する物質は、MGAT 2の発現を調節することができるので、MGAT2が 関与する脂質代謝異常に起因する疾患、例え ば、肥満、高脂血症(高コレステロール血症� �高LDLコレステロール血症、低HDLコレステロ� �ル血症、高トリグリセリド血症)、高インス� ��ン血症、動脈硬化、虚血性心疾患(狭心症、 心筋梗塞)、脳卒中(脳出血、脳梗塞)、腎障害 (腎動脈硬化症、腎不全)、眼底異常(眼底出血 、失明)、四肢血行障害(間欠性跛行、壊疽)、 無(低)βリポ蛋白血症、アポ蛋白B異常症、Ande rson病、Tangier病、アポA-I欠損(変異体)症、慢� �肝炎、甲状腺機能亢進症、肝硬変、溶血性� �血、慢性膵炎、白血病、吸収不良症候群、� �性リンパ腫、アジソン病、慢性(急性)炎症、 悪性腫瘍、脾腫、感染症、肥満、2型糖尿病� �慢性肝炎、骨髄増殖性疾患、腎不全、悪性� �瘍、低栄養、ネフローゼ症候群、吸収不良� �候群の予防又は治療剤として使用すること� �できる。

 本発明の脂質代謝異常に起因する疾患の� ��防又は治療に有効な化合物のスクリーニン� ��方法の第二の態様としては、MGAT2遺伝子の� �現が人為的に抑制された遺伝子改変非ヒト� �乳動物に被検化合物を投与する工程と、被� �化合物がMGAT2の機能を代替しているか否かを 判定する工程と、被検化合物を投与していな い場合と比較して、MGAT2の機能を代替する化� ��物を選択する工程と、を有することを特徴� ��する。

 第二の態様として、まず、被検化合物を� ��発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物に投与す� ��。本発明の遺伝子改変非ヒト哺乳動物への� ��与は、例えば、経口的又は経皮的のような� ��経口的に行うことができるが、それらに限� ��されない。被検化合物がタンパク質である� ��合には、例えば、当該タンパク質をコード� ��る遺伝子を有するウイルスベクターを構築� ��、その感染力を利用して、本発明の遺伝子� ��変非ヒト哺乳動物に遺伝子を導入すること� ��可能である。

 第二の態様としては、次いで、被検化合� ��がMGAT2の機能を代替しているか否かを判定� �、被検化合物を投与していない場合と比較� �て、MGAT2の機能を代替する化合物を選択する 。

 例えば以下のような場合に、被検化合物� ��MGAT2の機能を代替しているものと判定され� �。すなわち、被検化合物を投与した本発明� �遺伝子改変非ヒト哺乳動物と、被検化合物� �投与していない当該動物における体重、体� �肪率、摂食量、各種血中パラメーター(血漿� ��ルコース、血漿TG、総コレステロール)、肝� ��中TG又は遊離脂肪酸を測定し、これらの数� �が被検化合物投与によって増加している場� �に、当該被検化合物がmGAT2の機能を代替して いるものと判定される。このような化合物は MGAT2の機能を増強する薬剤として利用可能で� ��り、脂質の減少が起因となって生じる疾患� ��例えば、低脂血症の原因となる疾患として� ��、例えば、無(低)βリポ蛋白血症、アポ蛋白 B異常症、Anderson病、Tangier病、アポA-I欠損(変� ��体)症、慢性肝炎、甲状腺機能亢進症、肝硬 変、溶血性貧血、慢性膵炎、白血病、吸収不 良症候群、悪性リンパ腫、アジソン病、慢性 (急性)炎症、悪性腫瘍、脾腫、感染症、肥満� ��2型糖尿病、慢性肝炎、骨髄増殖性疾患、腎 不全、悪性腫瘍、低栄養、ネフローゼ症候群 、吸収不良症候群の予防又は治療に有効であ る。

 また、本発明の脂質代謝異常に起因する� ��患の予防又は治療に有効な化合物のスクリ� ��ニング(評価)方法の第三の態様は、脂質代� �異常に起因する疾患の予防又は治療に有効� �化合物の評価方法であって、上記のいずれ� �の遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び野生型非� �ト哺乳動物に被検化合物を投与する工程と� �遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び野生型非ヒ� �哺乳動物における表現型(例えば、体重、体� ��肪量、TG量、コレステロール、グルコース� �遊離脂肪酸)を解析する工程と、遺伝子改変� ��ヒト哺乳動物及び野生型非ヒト哺乳動物に� ��ける表現型を比較し、野生型非ヒト哺乳動� ��にのみ脂質代謝異常改善作用を示した化合� ��を選択する工程と、を有することを特徴と� ��る。

 第三の態様として、まず、遺伝子改変非� ��ト哺乳動物及び野生型非ヒト哺乳動物に被� ��化合物を投与する。本発明の遺伝子改変非� ��ト哺乳動物及び野生型非ヒト哺乳動物への� ��与は、例えば、経口的又は経皮的のような� ��経口的に行うことができるが、それらに限� ��されない。被検化合物がタンパク質である� ��合には、例えば、当該タンパク質をコード� ��る遺伝子を有するウイルスベクターを構築� ��、その感染力を利用して、本発明の遺伝子� ��変非ヒト哺乳動物に遺伝子を導入すること� ��可能である。

 第三の態様としては、次いで、遺伝子改� ��非ヒト哺乳動物及び野生型非ヒト哺乳動物� ��おける表現型(例えば、体重、体脂肪量、TG� ��、コレステロール、グルコース、遊離脂肪� ��)を解析する。表現形の解析は、解析対象の 表現型に応じて適宜好適な手段を用いること が可能であり、例えば、血中のTG量、コレス� ��ロール量、グルコース量、遊離脂肪酸を測� ��する場合には、血液を採取した後、市販の� ��定キットを用いて各パラメーターを測定す� ��ことができる。また、解析対象となる表現� ��が体脂肪量である場合には、NMR法等を用い� ��体脂肪率を測定し、算出することができる� ��

 次いで、遺伝子改変非ヒト哺乳動物及び� ��生型非ヒト哺乳動物における表現型を比較� ��、野生型非ヒト哺乳動物にのみ脂質代謝異� ��改善作用を示した化合物を選択する。

 例えば、体重の減少、体脂肪量の減少、T G量の減少、コレステロール値の減少、グル� �ース値の減少、遊離脂肪酸の減少が見られ� �場合、被検化合物が脂質代謝異常の改善作� �を示したと判定される。これに対して、MGAT2 遺伝子改変非ヒト哺乳動物においてこれらの 数値に変化が見られない場合、被検化合物は MGAT2阻害剤として機能すると評価することが� ��きる。一方、野生型非ヒト哺乳動物におい� ��、例えば、体重の増加、体脂肪量の増加、T G量の増加、コレステロール値の増加、グル� �ース値の増加、遊離脂肪酸の増加が見られ� �同じ被検化合物を投与したMGAT2遺伝子改変非 ヒト哺乳動物においてこれらの数値に変化が 見られない場合、被検化合物はMGAT2増強剤と� ��て機能すると評価することができる。

 かかるスクリーニング方法により、MGAT2� �機能を阻害又は増強する作用を有する化合� �をスクリーニングすることが可能となる。� �た、例えば、代謝性疾患に有効であること� �知られているが生体に対する作用機序が不� �な化合物があった場合、これを被検化合物� �して本発明のスクリーニング方法により化� �物を評価した結果、野生型非ヒト哺乳動物� �は代謝性疾患改善作用を示し、MGAT2遺伝子改 変非ヒト哺乳動物ではなんらの表現型も示さ なかった場合には、当該被検化合物はMGAT2を� ��的として作用する化合物であると評価する� ��とができる。

 第三の態様においては、MGAT2が関与する� �質代謝異常に起因する疾患、例えば、肥満� �高脂血症(高コレステロール血症、高LDLコレ� ��テロール血症、低HDLコレステロール血症、� ��トリグリセリド血症)、高インスリン血症、 動脈硬化、虚血性心疾患(狭心症、心筋梗塞)� ��脳卒中(脳出血、脳梗塞)、腎障害(腎動脈硬� ��症、腎不全)、眼底異常(眼底出血、失明)、� ��肢血行障害(間欠性跛行、壊疽)、無(低)βリ� ��蛋白血症、アポ蛋白B異常症、Anderson病、Tang ier病、アポA-I欠損(変異体)症、慢性肝炎、甲� ��腺機能亢進症、肝硬変、溶血性貧血、慢性� ��炎、白血病、吸収不良症候群、悪性リンパ� ��、アジソン病、慢性(急性)炎症、悪性腫瘍� �脾腫、感染症、肥満、2型糖尿病、慢性肝炎� ��骨髄増殖性疾患、腎不全、悪性腫瘍、低栄� ��、ネフローゼ症候群、吸収不良症候群の予� ��又は治療剤となる化合物のスクリーニング� ��可能となる。

  化合物のスクリーニング方法
 本発明の化合物のスクリーニング方法の第� ��の態様は、脂質代謝異常に起因する疾患の� ��防又は治療に有効な化合物のスクリーニン� ��方法であって、被検化合物をMGAT2に接触さ� �る工程と、当該MGAT2の活性を測定する工程と 、被検化合物を投与していない場合と比較し て、当該MGAT2の活性を抑制する被検化合物を� ��択する工程と、を有することを特徴とする� ��

 本発明の化合物のスクリーニング方法に� ��いて、まず、被検化合物をMGAT2に接触させ� �。第一の態様において使用されるMGAT2の状態 は特に制限はなく、例えば、精製された状態 、細胞内に発現した状態、細胞抽出液内に発 現した状態であってもよい。

 MGAT2の精製は公知の方法により行うこと� �できる。また、MGAT2を発現している細胞とし ては、内在性のMGAT2を発現している細胞又は� ��来性のMGAT2を発現している細胞を挙げるこ� �ができる。内在性のMGAT2を発現している細胞 としては、培養細胞等を挙げることができる が、これに限定されるものではない。当該培 養細胞としては、特に制限はなく、例えば、 市販のものを用いることができる。また、内 在性のMGAT2を発現している細胞が由来する生� ��種としては特に制限はなく、ヒト、マウス� ��ラット、サル、モルモット、フェレット等� ��挙げることができる。また、前記外来性のM GAT2を発現している細胞は、例えば、MGAT2をコ ードするDNAを含むベクターを細胞に導入する ことで作製できる。ベクターの細胞への導入 は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウ ム法、エレクトロポレーション、リポフェタ ミン法、マイクロインジェクション法によっ て実施することができる。

 また、MGAT2が発現している細胞抽出液は� �例えば、試験管内転写翻訳系に含まれる細� �抽出液に、MGAT2をコードするDNAを含むベクタ ーを添加したものを挙げることができる。こ のような試験管内転写翻訳系としては、特に 制限はなく、市販の試験管内転写翻訳キット 等を使用することができる。

 本発明のスクリーニング方法における本� ��明に係る「被検化合物」としては、例えば� ��天然化合物、有機化合物、無機化合物、タ� ��パク質、抗体、ペプチド、核酸等の単一化� ��物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子� ��イブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞� ��養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出� ��、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細� ��抽出物若しくは動物細胞抽出物等を挙げる� ��とができる。上記被検化合物は、必要に応� ��て適宜標識して用いることができる。標識� ��しては、例えば、放射標識、蛍光標識等を� ��げることができる。

 また、本発明において「接触」は、MGAT2� �状態に応じて行う。例えば、MGAT2が精製され た状態であれば、精製表品に被検化合物を添 加することにより接触させることができる。 また、細胞内に発現した状態又は細胞抽出液 内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞 の培養液又は細胞抽出液に被検化合物を添加 することにより接触させることができる。被 検化合物がタンパク質の場合には、例えば、 当該タンパク質をコードするDNAを含むベクタ ーを、MGAT2が発現している細胞へ導入する、� ��は当該ベクターをMGAT2が発現している細胞� �出液に添加することにより接触させること� �できる。また、例えば、酵母又は動物細胞� �を用いたツーハイブリッド法を用いること� �可能である。

 第一の態様では、次いで、MGAT2の活性を測� �する。MGAT2の活性としては、モノアシルグリ セロールを基質としたモノアシルグリセロー ルアシルトランスフェラーゼ活性(ジアシル� �リセロールの生成活性)等を挙げることがで� ��る。具体的には、例えば、ミクロソーム画� ��、5mM MgCl2、1mg/ml BSA、200mMスクロース、100mM  Tris-HCl(pH7.5)、200μMモノオレイン/1000μMホス� �ァチジルコリン、25μM[ ¹⁴ C]-オレオイル-CoAを含む溶液に、被検化合物� �添加することにより反応を行うことができ� �が、これに限定されず、例えば、Proc.Natl.Acad .Sci.USA、第99巻、8512頁、2002年に記載の方法に よって行うこともできる。ここで、アシルア クセプターとしては、モノアシルグリセロー ルを挙げることができ、アシルドナーとして は、脂肪性アシルCoA(fatty acyl-CoA)を挙げるこ� ��ができる。反応は、例えば、30~37℃にて5~15� ��行い、クロロホルム/メタノール(体積比で2: 1)を添加することにより停止させる。活性の� ��出、定量は、例えば、アシルドナーとして ¹⁴ C標識されたオレオイルCoA(oleoyl CoA)を用いた� ��合には、モノアシルグリセロールに取り込� ��れて ¹⁴ Cを有するジアシルグリセロールを検出する� �とにより、MGAT2の活性を測定することができ る。

 こうして測定されたMGAT2の活性は、被検� �合物非存在下で同様にして測定したMGAT2の活 性と比較し、MGAT2の活性を抑制又は増強した� ��合物をMGAT2阻害剤もしくはMGAT2増強剤として 単離すればよい。このような阻害剤は、MGAT2� ��発現又は活性を抑制する作用を有し、TGの� �成抑制すなわち脂肪の合成・蓄積を抑制す� �ことが可能となり、脂肪の合成・蓄積の過� �に起因する疾患の予防又は治療に有効な化� �物を得ることが可能となる。一方、比較の� �果、MGAT2の活性を増強することが明らかとな った化合物は、MGAT2増強剤として単離すれば� ��い。このような増強剤は、MGAT2の発現又は� �性を増強する作用を有し、TGの合成欠如・不 足すなわち脂肪の合成不備を正常化させるこ とが可能となり、脂肪の合成不備に起因する 疾患の予防又は治療に有効な化合物を得るこ とが可能となる。

 本発明の化合物のスクリーニング方法の� ��二の態様は、脂質代謝異常に起因する疾患� ��予防又は治療に有効な化合物のスクリーニ� ��グ方法であって、MGAT2を発現する細胞に被� �化合物を接触させる工程と、当該MGAT2の発現 レベルを測定する工程と、被検化合物を接触 させていない場合と比較して、該MGAT2の発現� ��ベルを減少又は増加させた被検化合物を選� ��する工程と、を有することを特徴とする。

 第二の態様では、まず、MGAT2を発現する� �胞に被検化合物を接触させる。

 MGAT2を発現する細胞は以下のようにして� �製することができる。すなわち、MAGT伝子を� ��入し、MGAT2タンパク質を発現する細胞の調� �は、当業者に公知の方法で行うことができ� �が、例えば、MGAT2遺伝子又はその一部からな る核酸を好適なプロモーター及び転写調節エ レメントを含む発現ベクターにクローニング し、クローニングされた核酸を有するベクタ ーを宿主細胞に導入することにより調製する 。ここで、前記ベクターとしては、発現ベク ターとして利用可能なものであれば特に限定 されないが、例えば、pCMV-Tag、pcDNA3.1、pBlueBac His2、pCI-neo、pcDNAI、pMC1neo、pXT1、pSG5、pEF1/V5-Hi sB、pCR2.1、pET11、λgt11又はpCR3.1が挙げられる� �

 次に、MGAT2遺伝子又はその一部からなる� �酸が導入された発現ベクターを宿主細胞に� �入する。かかる宿主細胞としては、遺伝子� �発現に通常使用されるものであれば特に限� �されず、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、� �生物のいずれであってもよく、例えば、SW480 、DLD-1、CCD-18Co、CCD-841CoN、COS1、COS7、CHO、NIH/3 T3、293、Raji、CV11、C1271、MRC-5、CPAE、HeLa、293T� ��はSf9が挙げられる。また、発現ベクターを� ��主細胞に導入する方法としては、公知の方� ��であれば特に限定されないが、例えば、エ� ��クトロポレーション、リン酸カルシウム法� ��DEAE-デキストラン法又はリポフェクション� �が挙げられる。

 本発明において「接触」は、以下のよう� ��行うことできる。細胞内に発現した状態又� ��細胞抽出液内に発現した状態であれば、そ� ��ぞれ、細胞の培養液又は細胞抽出液に被検� ��合物を添加することにより接触させること� ��できる。被検化合物がタンパク質の場合に� ��、例えば、当該タンパク質をコードするDNA� ��含むベクターを、MGAT2が発現している細胞� �導入する、又は当該ベクターをMGAT2が発現し ている細胞抽出液に添加することにより接触 させることができる。また、例えば、酵母又 は動物細胞等を用いたツーハイブリッド法を 用いることも可能である。

 第二の態様では、次いで、MGAT2の発現レ� �ルを測定する。MGAT2の発現レベルの測定は、 当業者に公知の方法によって行うことができ る。例えば、MGAT2遺伝子のmRNAを定法に従って 抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイ� �リダイゼーション法又はRT-PCR法を実施する� �とによってMGAT2遺伝子の転写レベルの測定を 行うことができる。さらに、DNAアレイ技術を 用いて、MGAT2遺伝子の発現レベルを測定する� ��とも可能である。

 また、MGAT2遺伝子にコードされるMGAT2を含 む画分を定法に従って回収し、MGAT2の発現をS DS-PAGE等の電気泳動法により検出することに� �り、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うこと� �できる。また、MGAT2に対する抗体を用いてウ エスタンブロッティング法を実施し、MGAT2の� ��現を検出することにより、遺伝子の翻訳レ� ��ルでの測定を行うことも可能である。ここ� ��、MGAT2の検出に用いる抗体としては、検出� �能な抗体であれば、特に制限はないが、モ� �クローナル抗体であってもよくポリクロー� �ル抗体であってもよい。当該抗体は、当業� �に公知の方法により調製することができる� �具体的には、例えば、ポリクローナル抗体� �あれば、以下のようにして調製することが� �きる。すなわち、MGAT2又はMGAT2とGSTとの融合� ��ンパク質として大腸菌等の微生物において� ��現させたリコンビナントタンパク質又はそ� ��部分ペプチドをウサギ等に免疫し血清を得� ��。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA カラム、プロテインGカラム、イオン交換ク� �マトグラフィー、MGAT2をカップリングしたア フィニティーカラム等により精製することに より調製できる。また、モノクローナル抗体 であれば、例えば、MGAT2又はその部分ペプチ� ��をマウス等の小動物に対して免疫し、同マ� ��スより脾臓を取り出し、これをすりつぶし� ��細胞を分離し、当該細胞とマウスミエロー� ��細胞とをポリエチレングリコール等の試薬� ��用いて融合させ、これにより得られた融合� ��胞(ハイブリドーマ)の中から、MGAT2に結合す る抗体を産生するクローンを選択する。次い で、得られたハイブリドーマを、マウス腹腔 内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得 られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安 沈殿、プロテインAカラム、プロテインGカラ� ��、イオン交換クロマトグラフィー、MGAT2を� �ップリングしたアフィニティーカラム等に� �り精製することにより調製できる。

 第二の態様では、次いで、被検化合物を� ��触させていない場合と比較して、当該MGAT2� �発現レベルを減少又は増加させた被検化合� �を選択する。選択された化合物には、MGAT2の 発現を減少又は増加させる化合物が含まれ、 発現を減少させる化合物はMGAT2阻害剤として� ��発現を増強する化合物はMGAT2増強剤として� �用する。MGAT2阻害剤は、MGAT2の発現又は活性� ��抑制する作用を有し、TGの合成抑制すなわ� �脂肪の合成・蓄積を抑制することが可能と� �り、脂肪の合成・蓄積の過剰に起因する疾� �の予防又は治療に有効な化合物を得ること� �可能となる。一方、比較の結果、MGAT2の活性 を増強する増強剤は、MGAT2の発現又は活性を� ��強する作用を有し、TGの合成欠如・不足す� �わち脂肪の合成不備を正常化させることが� �能となり、脂肪の合成不備に起因する疾患� �予防又は治療に有効な化合物を得ることが� �能となる。

 本発明の化合物のスクリーニング方法の� ��三の態様は、脂質代謝異常に起因する疾患� ��予防又は治療に有効な化合物のスクリーニ� ��グ方法であって、MGAT2をコードするDNAのプ� �モーター領域の下流にレポーター遺伝子が� �能的に結合したDNAを有する細胞又は細胞抽� �液を提供する工程と、当該細胞又は該細胞� �出液に被検化合物を接触させる工程と、当� �細胞又は該細胞抽出液における該レポータ� �遺伝子の発現レベルを測定する工程と、被� �化合物を接触させていない場合と比較して� �該レポーター遺伝子の発現レベルを減少又� �増加させた被検化合物を選択する工程と、� �有することを特徴とする。

 第三の態様において、「機能的に結合し� ��」とは、MGAT2遺伝子のプロモーター領域に� �写因子が結合することにより、レポーター� �伝子の発現が誘導されるように、MGAT2遺伝子 のプロモーター領域とレポーター遺伝子とが 結合していることをいう。したがって、レポ ーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、 他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成す る場合であっても、MGAT2遺伝子のプロモータ� ��領域に転写因子が結合することによって、� ��該融合タンパク質の発現が誘導されるもの� ��あれば、「機能的に結合した」の意に含ま� ��る。ここで、レポーター遺伝子としては、� ��の発現が検出可能なものであれば特に制限� ��れず、例えば、CAT遺伝子、LacZ遺伝子、ルシ フェラーゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝 子(GUS)及びGFP遺伝子を挙げることができる。� ��た、上記レポーター遺伝子には、MGAT2をコ� �ドするDNAも含まれる。

 MGAT2をコードするDNAのプロモーター領域� �下流にレポーター遺伝子が機能的に結合し� �DNAを有する細胞又は細胞抽出液は、第一の� �様において述べた方法で調製することがで� �る。

 第三の態様では、次いで、上記細胞又は� ��記細胞抽出液に被検試料を接触させる。本� ��明において「接触」は第二の態様において� ��べた方法と同様に行うことができる。

 次いで、当該細胞又は当該細胞抽出液に� ��ける上記レポーター遺伝子の発現レベルを� ��定する。

 レポーター遺伝子の発現レベルは、使用� ��るレポーター遺伝子の種類に応じて、当業� ��に公知の方法により測定することができる� ��例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子であ� ��場合には、当該遺伝子産物によるクロラム� ��ェニコールのアセチル化を検出することに� ��って、レポーター遺伝子の発現レベルを測� ��することができる。また、レポーター遺伝� ��がLacZ遺伝子である場合には、当該遺伝子発 現産物の触媒作用による色素化合物の発色を 検出することにより、また、ルシフェラーゼ 遺伝子である場合には、当該遺伝子発現産物 の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出す ることにより、また、β-グルクロニダーゼ遺 伝子である場合には、当該遺伝子発現産物の 触媒作用によるグルクロン(Glucuron)の発光や5- ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-グルクロニ� �(X-Gluc)の発光を検出することにより、レポー ター遺伝子の発現レベルを測定することがで きる。また、MGAT2遺伝子をレポーター遺伝子� ��する場合、当該遺伝子の発現レベルの測定� ��、第二の態様に記載された方法で行うこと� ��できる。

 第三の態様において、次いで、被検化合� ��を接触させていない場合と比較して、当該� ��ポーター遺伝子の発現レベルを減少又は増� ��させた被検化合物を選択する。選択された� ��合物には、MGAT2の発現を減少又は増加させ� �化合物が含まれ、発現を減少させる化合物� �MGAT2阻害剤として、発現を増強する化合物は MGAT2増強剤として作用する。MGAT2阻害剤は、MG AT2の発現又は活性を抑制する作用を有し、TG� ��合成抑制すなわち脂肪の合成・蓄積を抑制� ��ることが可能となり、脂肪の合成・蓄積の� ��剰に起因する疾患の予防又は治療に有効な� ��合物を得ることが可能となる。一方、比較� ��結果、MGAT2の活性を増強する増強剤は、MGAT2 の発現又は活性を増強する作用を有し、TGの� ��成欠如・不足すなわち脂肪の合成不備を正� ��化させることが可能となり、脂肪の合成不� ��に起因する疾患の予防又は治療に有効な化� ��物を得ることが可能となる。

  脂質代謝異常に起因する疾患の予 防又は治療のための薬剤
 本発明の脂質代謝異常に起因する疾患の予� ��又は治療のための薬剤は、MGAT2の発現又は� �性を低下させる化合物を有効成分とするこ� �を特徴する。上述した、本発明の化合物の� �クリーニング方法によって得られた化合物� �、本発明の薬剤に含まれる。

 脂質代謝異常に起因する疾患の予防又は� ��療のための薬剤としては、MGAT2の発現又は� �性を低下又は増強させる化合物を有効成分� �する薬剤を挙げることができる。MGAT2の発現 又は活性を低下又は増強させる化合物として は、結果としてMGAT2の発現又は活性を低下又� ��増強させるものであれば、その種別は限定� ��れない。このような化合物としては、例え� ��、天然化合物、有機化合物、無機化合物、� ��ンパク質、抗体、ペプチド又は核酸を挙げ� ��ことができる。当該核酸にはDNA及びRNAが含� ��れ、例えば、アンチセンスRNAやsiRNAを挙げ� �ことができる。

 前記抗体としては特に制限はなく、ポリ� ��ローナル抗体の他、モノクローナル抗体も� ��まれる。また、ウサギ等の免疫動物にMGAT2� �免疫して得た抗血清、全てのクラスのポリ� �ローナル抗体及びモノクローナル抗体、さ� �に遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、ヒ� �抗体も含まれる。上記抗体は、以下の方法� �より調製することが可能である。ポリクロ� �ナル抗体であれば、例えば、MGAT2をウサギな どの小動物に免疫し血清を得て、これをMGAT2� ��カップリングさせたアフィニティーカラム� ��より、MGAT2のみを認識する画分を得て、さ� �にこの画分から免疫グロブリンGあるいはMを 、プロテインA、あるいはプロテインGカラム� ��より精製することにより調製することがで� ��る。また、モノクローナル抗体であれば、M GAT2をマウスなどの小動物に免疫を行い、同� �ウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶし� �細胞にし、マウスミエローマ細胞とポリエ� �レングリコールなどの試薬により融合させ� �これによりできた融合細胞(ハイブリドーマ) の中から、MGAT2に対する抗体を産生するクロ� ��ンを選択する。次いで、得られたハイブリ� ��ーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスよ� ��腹水を回収し、得られたモノクローナル抗� ��を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロ テインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラ� ��ィー、MGAT2をカップリングしたアフィニテ� �ーカラムなどにより精製することで調製す� �ことが可能である。上記抗体は、MGAT2の精製 や検出に用いられる他、MGAT2の機能を制御す� ��ための薬剤として用いることが可能である� ��抗体をヒトのための薬剤として用いる場合� ��は、免疫原性の点で、ヒト抗体またはヒト� ��抗体が有効である。ヒト抗体またはヒト化� ��体は当業者に公知の方法により調製するこ� ��ができる。例えば、ヒト抗体は、例えば、� ��疫系をヒトと入れ換えたマウスにMGAT2を免� �することにより調製することが可能である� �また、ヒト化抗体は、例えば、モノクロー� �ル抗体産生細胞から抗体遺伝子をクローニ� �グし、その抗原決定部位を既存のヒト抗体� �移植するCDRグラフト法により調製すること� �可能である。

 また、MGAT2の発現を低下する化合物とし� �は、MGAT2をコードするDNAの転写産物と相補的 なRNA又は当該転写産物を特異的に開裂するリ ボザイムを挙げることができる。MGAT2をコー� ��するDNAとしては、配列番号1(ヒト)及び3(マ� �ス)に記載の塩基配列からなるDNA、配列番号2 (ヒト)及び4(マウス)に記載のアミノ酸配列か� ��なるタンパク質をコードするDNA、及び配列� ��号2又は4に記載のアミノ酸配列において1又� ��2以上のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/� �は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパ� �質をコードする天然由来のDNA等も含まれる� �

 上記の「MGAT2をコードするDNAの転写産物� �相補的なRNA」の一つの態様は、MGAT2をコード するDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNA である。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発 現を抑制する作用としては、以下のような要 因が存在する。すなわち、三重鎖形成による 転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部 的に開状ループ構造がつくられた部位とのハ イブリッド形成による転写抑制、合成の進み つつあるRNAとのハイブリッド形成による転写 阻害、イントロンとエキソンとの接合点での ハイブリッド形成によるスプライシング抑制 、mRNAとのハイブリッド形成による核から細� �質への移行抑制、キャッピング部位やポリA� ��加部位とのハイブリッド形成によるスプラ� ��シング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハ� ��ブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領 域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形 成によるペプチド鎖の伸長阻止、及び核酸と タンパク質との相互作用部位とのハイブリッ ド形成による遺伝子発現抑制等である。これ らは、転写、スプライシング又は翻訳の過程 を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。

 本発明で用いられるアンチセンス配列は� ��上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を� ��制してもよい。一つの態様としては、遺伝� ��のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なア� ��チセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳� ��害に効果的である。一方、コード領域又は3 ’側の非翻訳領域に相補的な配列を使用する こともできる。このように、遺伝子の翻訳領 域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセン ス配列を含むDNAも、本発明において使用され るアンチセンスDNAに含まれる。使用されるア ンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流 に連結され、好ましくは3’側に転写終結シ� �ナルを含む配列が連結される。このような� �ンチセンスDNAの配列は、MGAT2遺伝子又はその 一部と相補的な配列であることが好ましいが 、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完 全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは 、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ま しくは90%以上、より好ましくは95%以上の相補 性を有する。アンチセンス配列を用いて、効 果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、ア ンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以� ��であり、好ましくは100塩基以上であり、さ� ��に好ましくは500塩基以上である。通常、用� ��られるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短� ��、好ましくは2.5kbよりも短い。

 本発明のMGAT2に作用する化合物をヒトや� �の動物の医薬として使用する場合には、こ� �らの物質自体を直接患者に投与する以外に� �公知の製剤学的方法により製剤化して投与� �行うことも可能である。例えば、必要に応� �て糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキ� �ル剤、マイクロカプセル剤として経口的に� �あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許� �し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の� �射剤の形で非経口的に使用できる。例えば� �薬理学上許容される担体若しくは媒体、具� �的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳� �剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤� �賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適� �組み合わせて、一般に認められた製薬実施� �要求される単位用量形態で混和することに� �って製剤化することが考えられる。

 錠剤、カプセル剤に混和することができ� ��添加剤としては、例えば、ゼラチン、コー� ��スターチ、トラガントガム、アラビアゴム� ��ような結合剤、結晶性セルロースのような� ��形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギ� ��酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシ� ��ムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッ� ��リンのような甘味剤、ペパーミント、アカ� ��ノ油又はチェリーのような香味剤が用いら� ��る。調剤単位形態がカプセルである場合に� ��、上記の材料にさらに油脂のような液状担� ��を含有することができる。注射のための無� ��組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを� ��いて通常の製剤実施に従って処方すること� ��できる。

 注射用の水溶液としては、例えば生理食� ��水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張� ��、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-� ��ンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、� ��当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体� ��にはエタノール、ポリアルコール、例えば� ��ロピレングリコール、ポリエチレングリコ� ��ル、非イオン性界面活性剤、例えばポリソ� ��ベート80(TM)、HCO-50と併用してもよい。

 油性液としてはゴマ油、大豆油があげら� ��、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベ� ��ジルアルコールと併用してもよい。また、� ��衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリ� ��ム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカ� ��ン、安定剤、例えばベンジルアルコール、� ��ェノール、酸化防止剤と配合してもよい。� ��製された注射液は通常、適当なアンプルに� ��填させる。

 患者への投与は、例えば、動脈内注射、� ��脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的� ��経気管支的、筋内的、経皮的、または経口� ��に当業者に公知の方法により行いうる。投� ��量は、患者の体重や年齢、投与方法などに� ��り変動するが、当業者であれば適当な投与� ��を適宜選択することが可能である。また、� ��該化合物がDNAによりコードされうるもので� ��れば、当該DNAを遺伝子治療用ベクターに組� ��み、遺伝子治療を行うことも考えられる。� ��与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症� ��などにより変動するが、当業者であれば適� ��選択することが可能である。

 化合物の投与量は、症状により差異はあ� ��が、経口投与の場合、一般的に成人(体重60k gとして)においては、1日あたり約0.1から100mg� ��好ましくは約1.0から50mg、より好ましくは約 1.0から20mgであると考えられる。

 非経口的に投与する場合は、その1回の投 与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法 によっても異なるが、例えば注射剤の形では 通常成人(体重60kgとして)においては、通常、 1日当り約0.01から30mg、好ましくは約0.1から20m g、より好ましくは約0.1から10mg程度を静脈注� ��により投与するのが好都合であると考えら� ��る。

 このような化合物の投与の対象となる疾� ��として、例えば、肥満、高脂血症(高コレス テロール血症、高LDLコレステロール血症、低 HDLコレステロール血症、高トリグリセリド血 症)、高インスリン血症、動脈硬化、虚血性� �疾患(狭心症、心筋梗塞)、脳卒中(脳出血、� �梗塞)、腎障害(腎動脈硬化症、腎不全)、眼� �異常(眼底出血、失明)、四肢血行障害(間欠� �跛行、壊疽)、無(低)βリポ蛋白血症、アポ蛋 白B異常症、Anderson病、Tangier病、アポA-I欠損(� ��異体)症、慢性肝炎、甲状腺機能亢進症、肝 硬変、溶血性貧血、慢性膵炎、白血病、吸収 不良症候群、悪性リンパ腫、アジソン病、慢 性(急性)炎症、悪性腫瘍、脾腫、感染症、肥� ��、2型糖尿病、慢性肝炎、骨髄増殖性疾患、 腎不全、悪性腫瘍、低栄養、ネフローゼ症候 群、吸収不良症候群を挙げることができる。

  脂質代謝異常に起因する疾患の検 査方法
 本発明の脂質代謝異常に起因する疾患の検� ��方法は、MGAT2遺伝子の発現量を測定する工� �を含むことを特徴とする。本発明は、MGAT2遺 伝子の発現量を測定する工程を含む、脂質代 謝異常に起因する疾患の検査方法を提供する 。ここで、「MGAT2遺伝子の発現」には、MGAT2� �mRNAの発現だけでなく、MGAT2の発現も含まれ� �。本発明の検査方法によって、MGAT2遺伝子の 発現が増加又は減少している場合に、脂質代 謝異常の可能性があり、それに起因する疾患 の罹患の可能性があると判定される。

 以下に、本発明の検査方法の態様を例示� ��るが、本発明の検査方法はそれらに限定さ� ��るものではない。上記検査方法の一つの態� ��としては、まず、被検者のRNA試料を調製す� ��。RNA試料は、例えば被検者の血液、皮膚、� ��術により採取あるいは切除した組織または� ��胞から抽出することができる。

 本方法においては、次いで、当該RNA試料� ��含まれるMGAT2をコードするRNAの量を測定す� �。次いで、測定されたRNAの量を対照と比較� �る。このような方法としては、ノーザンブ� �ッティング法、DNAアレイ法、または、RT-PCR� �等を例示することができる。

 また、上記検査方法は、MGAT2の発現量を� �定することにより、下記の如く実施するこ� �ができる。まず、被検者からポリペプチド� �料を調製する。ポリペプチド試料は、例え� �被検者の血液、皮膚、口腔粘膜、毛髪、手� �により採取あるいは切除した組織または細� �から調製することができる。

 本方法においては、次いで、該ポリペプ� ��ド試料に含まれるMGAT2の量を測定する。次� �で、測定されたMGAT2の量を対照と比較する。 このような方法としては、SDSポリアクリルア ミド電気泳動法、並びにMGAT2に結合する抗体� ��用いた、ウェスタンブロッティング法、ド� ��トブロッティング法、免疫沈降法、酵素結� ��免疫測定法(ELISA)、及び免疫蛍光法を例示す ることができる。

 また、本発明は、MGAT2遺伝子領域におけ� �変異を検出する工程を含む、脂質代謝異常� �起因する疾患の検査方法を提供する。該検� �方法によって、MGAT2遺伝子領域に変異が生じ ている場合に、MGAT2の発現量に異常を来たし� ��その結果、脂質代謝異常が生じていると判� ��される。本発明において、MGAT2遺伝子領域� �は、MGAT2遺伝子及び該遺伝子の発現に影響す る領域を意味する。MGAT2遺伝子の発現に影響� ��る領域としては、特に制限はないが、例え� ��、プロモーター領域などが例示できる。

 また、本発明における変異は、細胞の増� ��異常又は分化異常を引き起こす変異であれ� ��、その種類、その数、その部位などに制限� ��ない。上記変異の種類としては、例えば、� ��失、置換または挿入変異などが挙げられる� ��

 以下、MGAT2遺伝子領域に生じた変異を検� �する工程を含む検査方法の好ましい態様を� �載するが、本発明の方法はそれらの方法に� �定されるものではない。

 上記検査方法の好ましい態様においては� ��まず、被検者からDNA試料を調製する。DNA試� ��は、例えば被検者の血液、皮膚、口腔粘膜� ��毛髪、手術により採取あるいは切除した組� ��または細胞から抽出した染色体DNA、あるい� ��RNAを基に調製することができる。

 本方法においては、次いで、MGAT2遺伝子� �域を含むDNAを単離する。MGAT2遺伝子領域の単 離は、例えば、当該遺伝子領域を含むDNAにハ イブリダイズするプライマーを用いて、染色 体DNA、あるいはRNAを鋳型としたPCR等によって 行うことができる。

 本方法においては、次いで、単離したDNA� ��塩基配列を決定する。単離したDNAの塩基配� ��の決定は、当業者に公知の方法で行うこと� ��できる。

 本方法においては、次いで、決定したDNA� ��塩基配列を、対照と比較する。本発明にお� ��て、対照とは、正常な(野生型の)MGAT2遺伝子 領域を含むDNAを言う。一般に健常人のMGAT2遺� ��子領域を含むDNAの配列は正常であるものと� ��えられることから、上記「対照と比較する� ��とは、通常、健常人のMGAT2遺伝子領域を含� �DNAの配列と比較することを意味する。

 本発明における変異の検出は、以下のよ� ��な方法によっても行うことができる。まず� ��被検者からDNA試料を調製する。次いで、調� ��したDNA試料を制限酵素により切断する。次� ��で、DNA断片をその大きさに応じて分離する� ��次いで、検出されたDNA断片の大きさを、対� ��と比較する。また、他の一つの態様におい� ��は、まず、被検者からDNA試料を調製する。� ��いで、MGAT2遺伝子領域を含むDNAを増幅する� �さらに、増幅したDNAを制限酵素により切断� �る。次いで、DNA断片をその大きさに応じて� �離する。次いで、検出されたDNA断片の大き� �を、対照と比較する。

 このような方法としては、例えば、制限� ��素断片長変異(Restriction Fragment Length Polymorp hism/RFLP)を利用した方法やPCR-RFLP法等が挙げら れる。具体的には、制限酵素の認識部位に変 異が存在する場合、あるいは制限酵素処理に よって生じるDNA断片内に塩基挿入または欠失 がある場合、制限酵素処理後に生じる断片の 大きさが対照と比較して変化する。この変異 を含む部分をPCR法によって増幅し、それぞれ の制限酵素で処理することによって、これら の変異を電気泳動後のバンドの移動度の差と して検出することができる。あるいは、染色 体DNAをこれらの制限酵素によって処理し、電 気泳動した後、本発明のプローブDNAを用いて サザンブロッティングを行うことにより、変 異の有無を検出することができる。用いられ る制限酵素は、それぞれの変異に応じて適宜 選択することができる。この方法では、ゲノ ムDNA以外にも被検者から調製したRNAを逆転写 酵素でcDNAにし、これをそのまま制限酵素で� �断した後、サザンブロッティングを行うこ� �も可能である。また、このcDNAを鋳型としてP CRでMGAT2遺伝子領域を含むDNAを増幅し、それ� �制限酵素で切断した後、移動度の差を調べ� �ことも可能である。

 さらに別の方法においては、まず、被検� ��からDNA試料を調製する。次いで、MGAT2遺伝� �領域を含むDNAを増幅する。さらに、増幅し� �DNAを一本鎖DNAに解離させる。次いで、解離� �せた一本鎖DNAを非変性ゲル上で分離する。� �離した一本鎖DNAのゲル上での移動度を対照� �比較する。このような方法としては、例え� �PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism、一本 鎖高次構造変異)法が挙げられる。この方法� �操作が比較的簡便であり、また被検試料の� �も少なくて済む等の利点を有するため、特� �多数のDNA試料をスクリーニングするのに好� �である。その原理は次の通りである。二本� �DNA断片を一本鎖に解離すると、各鎖はその� �基配列に依存した独自の高次構造を形成す� �。この解離したDNA鎖を、変性剤を含まない� �リアクリルアミドゲル中で電気泳動すると� �それぞれの高次構造の差に応じて、相補的� �同じ鎖長の一本鎖DNAが異なる位置に移動す� �。一塩基の置換によってもこの一本鎖DNAの� �次構造は変化し、ポリアクリルアミドゲル� �気泳動において異なる移動度を示す。従っ� �、この移動度の変化を検出することによりDN A断片に点突然変異や欠失、あるいは挿入等� �よる変異の存在を検出することができる。

 具体的には、まず、MGAT2遺伝子領域を含むDN AをPCR法等によって増幅する。増幅される範� �としては、通常200~400bp程度の長さが好まし� �。PCRは、当業者においては反応条件等を適� �選択して行うことができる。PCRの際に、 ³² P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオ� �ン等によって標識したプライマーを用いる� �とにより、増幅DNA産物を標識することがで� �る。あるいはPCR反応液に ³² P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオ� �ン等によって標識された基質塩基を加えてPC Rを行うことにより、増幅DNA産物を標識する� �とも可能である。さらに、PCR反応後にクレ� �ウ酵素等を用いて、 ³² P等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオ� �ン等によって標識された基質塩基を、増幅DN A断片に付加することによっても標識を行う� �とができる。こうして得られた標識DNA断片� �、熱を加えること等により変性させ、尿素� �どの変性剤を含まないポリアクリルアミド� �ルによって電気泳動を行う。この際、ポリ� �クリルアミドゲルに適量(5~10%程度)のグリセ� ��ールを添加することにより、DNA断片の分離� ��条件を改善することができる。また、泳動� ��件は各DNA断片の性質により変動するが、通� ��、室温(20~25℃)で行い、好ましい分離が得ら れないときには4~30℃までの温度で最適の移� �度を与える温度の検討を行う。電気泳動後� �DNA断片の移動度を、X線フィルムを用いたオ� ��トラジオグラフィーや、蛍光を検出するス� ��ャナー等で検出し、解析を行う。移動度に� ��があるバンドが検出された場合、このバン� ��を直接ゲルから切り出し、PCRによって再度� ��幅し、それを直接シークエンシングするこ� ��により、変異の存在を確認することができ� ��。また、標識したDNAを使わない場合におい� ��も、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマ� ��ドや銀染色法などによって染色することに� ��って、バンドを検出することができる。

 さらに別の方法においては、まず、被検� ��からDNA試料を調製する。次いで、MGAT2遺伝� �領域を含むDNAを増幅する。さらに、増幅し� �DNAを、DNA変性剤の濃度が次第に高まるゲル� �で分離する。次いで、分離したDNAのゲル上� �の移動度を対照と比較する。このような方� �としては、例えば、変性剤濃度勾配ゲル(dena turant gradient gel electrophoresis:DGGE法)等を例示� ��ることができる。DGGE法は、変性剤の濃度勾 配のあるポリアクリルアミドゲル中で、DNA断 片の混合物を泳動し、それぞれの不安定性の 違いによってDNA断片を分離する方法である。 ミスマッチのある不安定なDNA断片が、ゲル中 のある変性剤濃度の部分まで移動すると、ミ スマッチ周辺のDNA配列はその不安定さのため に、部分的に1本鎖へと解離する。この部分� �に解離したDNA断片の移動度は、非常に遅く� �り、解離部分のない完全な二本鎖DNAの移動� �と差がつくことから、両者を分離すること� �できる。具体的には、MGAT2遺伝子領域を含む DNAを本発明のプライマー等を用いたPCR法等に よって増幅し、これを尿素などの変性剤の濃 度が移動するに従って徐々に高くなっている ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、対 照と比較する。変異が存在するDNA断片の場合 、より低い変性剤濃度位置でDNA断片が一本鎖 になり、極端に移動速度が遅くなるため、こ の移動度の差を検出することにより変異の有 無を検出することができる。

 さらに別の方法においては、まず、被検� ��から調製したMGAT2遺伝子領域を含むDNA、お� �び、当該DNAにハイブリダイズするヌクレオ� �ドプローブが固定された基板、を提供する� �本発明において「基板」とは、ヌクレオチ� �プローブを固定することが可能な板状の材� �を意味する。本発明においてヌクレオチド� �は、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオ� �ドが含まれる。本発明の基板は、ヌクレオ� �ドプローブを固定することができれば特に� �限はないが、一般にDNAアレイ技術で使用さ� �る基板を好適に用いることができる。一般� �DNAアレイは、高密度に基板にプリントされ� �何千ものヌクレオチドで構成されている。� �常これらのDNAは非透過性(non-porous)の基板の� �層にプリントされる。基板の表層は、一般� �にはガラスであるが、透過性(porous)の膜、例 えばニトロセルロースメンブレムを使用する ことができる。

 本発明において、ヌクレオチドの固定(ア レイ)方法として、アフィメトリクス(Affymetrix )社製のオリゴヌクレオチドを基本としたア� �イが例示できる。オリゴヌクレオチドのア� �イにおいて、オリゴヌクレオチドは通常in s ituで合成される。例えば、photolithographicの技� ��(アフィメトリクス社)、および化学物質を� �定させるためのインクジェット(ロゼッタイ� ��ファーマティクス(Rosetta Inpharmatics)社)技術� ��によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ� ��成法が既に知られており、いずれの技術も� ��発明の基板の作製に利用することができる� ��

 基板に固定するヌクレオチドプローブは� ��MGAT2遺伝子領域の変異を検出することがで� �るものであれば、特に制限されない。即ち� �該プローブは、例えば、MGAT2遺伝子領域を含 むDNAにハイブリダイズするようなプローブで ある。特異的なハイブリダイズが可能であれ ば、ヌクレオチドプローブは、当該遺伝子領 域を含むDNAに対し、完全に相補的である必要 はない。本発明において基板に結合させるヌ クレオチドプローブの長さは、オリゴヌクレ オチドを固定する場合は、通常10~100bpであり� ��好ましくは10~50bpであり、さらに好ましくは 15~25bpである。

 本方法においては、次いで、MGAT2遺伝子� �域を含むDNAと基板を接触させる。この過程� �より、上記ヌクレオチドプローブに対し、DN Aをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼ� �ションの反応液および反応条件は、基板に� �定するヌクレオチドプローブの長さ等の諸� �因により変動しうるが、一般的に当業者に� �知の方法により行うことができる。

 本方法においては、次いで、MGAT2遺伝子� �域を含むDNAと当該基板に固定されたヌクレ� �チドプローブとのハイブリダイズの強度を� �出する。この検出は、例えば、蛍光シグナ� �をスキャナー等によって読み取ることによ� �て行うことができる。尚、DNAアレイにおい� �は、一般的にスライドガラスに固定したDNA� �プローブといい、一方溶液中のラベルしたDN Aをターゲットという。従って、基板に固定� �れた上記ヌクレオチドを、本明細書におい� �ヌクレオチドプローブと記載する。本方法� �おいては、さらに、検出したハイブリダイ� �の強度を対照と比較する。

 上記の方法以外にも、特定位置の変異の� ��を検出する目的にはアレル特異的オリゴヌ� ��レオチド(Allele Specific Oligonucleotide/ASO)ハイ� ��リダイゼーション法が利用できる。変異が� ��在すると考えられる塩基配列を含むオリゴ� ��クレオチドを作製し、これとDNAでハイブリ� ��イゼーションを行わせると、変異が存在す� ��場合、ハイブリッド形成の効率が低下する� ��それをサザンブロット法や、特殊な蛍光試� ��がハイブリッドのギャップにインターカレ� ��ションすることにより消光する性質を利用� ��た方法等により検出することができる。

 また、本発明においては、MALDI-TOF/MS法、T aqMan PCR法、Invader法、Pyrosequencing法、AcycloPrime 法、SNuPE法等も使用することができる。

 本発明の検査方法による検査の結果、MGAT 2の発現が正常組織又は正常細胞と比較して� �加している、あるいはMGAT2の活性が正常組織 又は正常細胞と比較して上昇している場合に は、肥満、高脂血症(高コレステロール血症� �高LDLコレステロール血症、低HDLコレステロ� �ル血症、高トリグリセリド血症)、高インス� ��ン血症、2型糖尿病、動脈硬化等の脂質過多 に起因する疾患と診断することができる。一 方、MGAT2の発現が正常組織又は正常細胞と比� ��して減少している、あるいはMGAT2の活性が� �常組織又は正常細胞と比較して低下してい� �場合には、無(低)βリポ蛋白血症、アポ蛋白B 異常症、Anderson病、Tangier病、アポA-I欠損(変� �体)症、慢性肝炎、甲状腺機能亢進症等の脂� ��欠如に起因する疾患と診断することができ� ��。