Der Umsatz von festen, wasserunlöslichen oder partikulären Substraten in Fermentern birgt eine Vielzahl an Problemen, welche in erster Linie die Belüftung, die Durchmischung und die Nährmedienzugabe betreffen.

Wenn der umzusetzende Stoff von verschiedenen Mikroorganismen sy- nergistisch angegriffen werden soll, ist zudem eine gezielte Versorgung des Reaktionsraums mit Nährstoffen und Sauerstoff erforderlich. In großvolumigen Reaktoren lassen sich diese Fermentationen derzeit auf- grund der erschwerten Durchmischung und der damit verbundenen man- gelhaften Belüftung und Unterversorgung mit Substraten, nicht realisie- ren.

Die Durchmischung findet in handelsüblichen Reaktorsystemen durch me- chanische Rührsysteme statt. Darüber hinaus beschreibt das US-Patent 4,846,964 ein Fließbett-Bioreaktorsystem zur Umwandlung von Kohle in mikrobiologisch verflüssigte Kohleprodukte, bei dem ein aufstrebender wäßriger Strom die Kohlepartikel in Lösung hält. Die vorstehenden Mischmethoden haben den Nachteil, dass bei einer Fermentation von hö- heren Substratkonzentrationen bzw. Substraten, die zur Verklumpung neigen, eine hinreichende Durchmischung und somit ein hoher Substrat- umsatz nicht mehr gegeben ist.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand nun darin, einen Biore- aktor und ein Fermentationsverfahren zur Verfügung zu stellen, die die Nachteile des Standes der Technik nicht mehr aufweisen, insbesondere die eine hinreichende Durchmischung des zu fermentierenden Materials gewährleisten.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass in einem Bioreaktor durch gezieltes Einleiten von Druckgas, kontinuierlich oder durch Druck- gaspulse, eine hinreichende Durchmischung eines Reaktionsmediums, das feste bzw. wasserunlösliche Fermentationsstoffe enthält, gegeben ist.

Zur Lösung der gestellten Aufgabe dienen ein Bioreaktor mit den Merk- malen des Anspruchs 1 sowie ein Verfahren zur aeroben Fermentierung mit den Merkmalen des Anspruchs 19.

Der Bioreaktor dient zur Fermentierung wasserunlöslicher oder partikulä- rer Substrate wie z. B. Holz (welches aufgrund seines Ligninanteils nur von bestimmten Mikroorganismen abbaubar ist), Kohlen (mit dem Ziel, die flüssigen Fermentationsprodukte als Ausgangsstoffe für die chemische Industrie oder zur thermischen Nutzung zu verwenden), zur Sanierung von mit Xenobiotika belasteten Böden, zur schnellen Fermentierung von organischen Abfallprodukten, zur biologischen Abwasserreinigung und zur Vorbehandlung von Grundstoffen der chemischen Industrie.

Der vorgeschlagene Bioreaktor erlaubt durch mindestens eine spezielle Düsenanordnung, welche in das zu fermentierende Substrat eingebracht wird und pneumatisch mit Druckgas versorgt wird, erstmals die für Mikro- organismen nötige optimale Belüftung und Durchmischung von festen, wasserunlöslichen oder partikulären Substraten. Sowohl die Versorgung der Mikroorganismen mit Luftsauerstoff als auch deren Versorgung mit Nährmedien, Co-Substraten, Vitaminen, Mineralstoffen, Puffern oder An- tibiotika verläuft über ein einzelnes pneumatisches Drucksystem. Der Bioreaktor kann in leicht modifizierter Form in jeder beliebigen Größe vom fünf Liter Labormaßstab bis hin zum großindustriellen mehrstelligen Hek- toliterbereich genutzt werden. Der vorgeschlagene Bioreaktor kann mit einfachen Veränderungen ebenfalls als konventioneller Flüssig- /Festphasen-, Festphasen-, Rieselfilm-,"fedbatch"oder Airliftreaktor ge- nutzt werden.

Erfindungsgemäß ist eine erste, sich vertikal erstreckende Düsenanord- nung in den Reaktionsraum des Fermentationsbehälters ein-und ausfahr- bar. Die Düsenanordnung ist somit in vertikaler Richtung verschiebbar, sodass es auch möglich ist, die Düsenanordnung, während sie mit Druck- gas beaufschlagt ist, zur besseren Durchmischung und Belüftung zu be- wegen. Falls der Fermentationsvorgang jedoch unter sterilen Bedingungen ablaufen soll, ist es unumgänglich, dass der Reaktionsraum geschlossen bleibt. Die Düsenanordnung besteht aus vertikal in den Fermentations- behalter hineinragenden Leitungsrohren, die an ihren unteren Enden mit Düsen versehen sind. Auf diese Weise lässt sich das Druckgas bzw. der flüssige bioreaktive Stoff in Bodennähe des Fermentationsbehälters ein- bringen. Die Düsenanordnung ist auch zum Penetrieren von in der Fer- mentationslösung befindlichen körnigen Feststoffen geeignet. Die vertika- len Leitungsrohre können eine unterschiedliche Länge aufweisen und sind auswechselbar. Ferner kann die Düsenanordnung, wenn sie aus dem Fer- mentationsbehälter herausgezogen ist auf einfache Weise gereinigt wer- den.

Zusätzlich kann eine zweite horizontale Düsenanordnung vorgesehen sein, die aus sich horizontal und zueinander parallel durch den Reaktionsraum erstreckenden, miteinander verbundenen Leitungsrohren besteht. Die Leitungsrohre haben auf ihrer Mantelfläche verteilt angeordnete Düsen.

Die horizontale Düsenanordnung kann zusätzlich zu der vertikalen Düsen- anordnung zum Durchmischen verwendet werden.

Falls die horizontale Düsenanordnung zum besseren Durchmischen des Fermentationsstoffes rotieren soll, muss die vertikale Düsenanordnung nach oben gefahren werden oder die vertikalen Leitungsrohre müssen so gewähit werden, dass sie ein Rotieren der horizontalen Düsenanordnung nicht behindern, d. h., die"normalen"Leitungsrohre müssen durch kür- zere Leitungsrohre ersetzt werden.

Eine vorteilhafte Weiterbildung des erfindungsgemäßen Bioreaktors weist eine Messvorrichtung auf, in der in einer Messkammer beispielsweise mehrere Messelektroden zum Messen eines aus dem Fermentationsbe- hälter entnommenen Mediums vorgesehen sind. Die Messkammer ist über eine Zufuhrleitung mit dem Fermentationsbehälter, zum Zuführen von zu messendem Medium aus dem Fermentationsbehälter in die Messkammer, verbunden. Um das Medium nach dem Messen wieder in den Fermentati- onsbehälter zurückzuführen ist die Messkammer ferner über eine Rück- führleitung mit dem Fermentationsbehälter verbunden. Das Besondere dieser Anordnung ist, dass der Messkammer eine Druckkammer vorge- schaltet ist, in der sich ein definierbarer Druck aufbauen kann, der dem verdrängten Volumen in der Messkammer entspricht. Das Rückführen des gemessenen Mediums erfolgt erfindungsgemäß dadurch, dass die Messkammer mit Druck beaufschlagt wird, so dass das Medium in den Fermentationsbehälter zurückgedrückt wird.

Bei bekannten Bioreaktoren erfolgen Messungen üblicherweise direkt in dem Fermentationsbehälter. Da in dem Fermentationsbehälter feste Sub- strate enthalten sind, werden die Messelektroden häufig beschädigt. Bei einer externen Messung wird das zu messende Medium bei bekannten Bioreaktoren durch peristaltische Pumpen in eine Messkammer gefördert.

Derartige Pumpen unterliegen hohem Verschleiß und sind zur Förderung größerer Volumina nicht geeignet.

Durch das erfindungsgemäße Fördern des Mediums mit Druck können derartige verschleißbehaftete und damit wartungsintensive Pumpen ent- fallen. Ferner ist es möglich große Volumina zu fördern. Ein weiterer Vor- teil der Förderung mittels Druck ist, dass die Sterilität nicht beeinflusst wird. Dies bedeutet, dass beim Pumpvorgang keine Fremdstoffe in den Fermentationsbehälter gelangen.

Die Zufuhr von Medium über die Zuführleitung in die Messkammer kann durch Unterdruck erfolgen. Die erfindungsgemäße Messkammer kann fer- ner als zusätzliches Umwälzsystem genutzt werden. Mit einem derartigen Umwälzsystem kann eine zusätzliche Belüftung der in dem Fermentati- onsbehälter befindlichen Substrate erfolgen.

Weitere vorteilhafte Ausbildungen des Bioreaktors sind den weiteren Un- teransprüchen zu entnehmen.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zur aeroben Fermentierung fester Stoffe ein diese feste Stoffe enthaltendes Reaktionsmedium durch von oben in das Reaktionsmedium zugeführtes Druckgas durchmischt. Durch diese Durchmischung wird die Fermentationsrate drastisch gestei- gert. Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet"von oben in das Re- aktionsmedium zuführen", dass Druckgas mittels geeigneter Vorrichtun- gen (wie mit Düsen versehenen Leitungsrohren), die von oben in das Re- aktionsmedium hineinreichen, in das Reaktionsmedium geleitet werden.

Die Länge der Leitungsrohre kann dabei so gewählt werden, dass sie im eingeführten Arbeitszustand (d. h. mit oder ohne eingeführtes Druckgas) in beliebiger Höhe unter die Oberfläche des Reaktionsmediums reichen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figuren und Ausführungsbei- spiele näher beschrieben. Dabei zeigt Fig. 1 einen Bioreaktor mit einem Druckbehälter für bioreaktive Stoffe und für Druckluft, Fig. 2 eine Stirnansicht des Bioreaktors, Fig. 3 eine Seitenansicht des Bioreaktors, Fig. 4 einen Schnitt durch den Fermentationsbehälter des Bioreaktors, Fig. 5 einen Schnitt entlang der Linie V-V in Fig. 4, Fig. 6 eine Medienmisch-und Druckluftzuleitungsanordnung für den Bio- rea ktor, Fig. 7 eine schematische Ansicht einer mit dem Fermentationsbehälter verbundenen Messeinrichtung, und Fig. 8 den Reaktionsverlauf des in Beispiel 1 beschriebenen Fermentati- onsansatzes.

Der in Fig. 1 gezeigte Bioreaktor zur Fermentierung fester Stoffe und zur Durchführung eines nachfolgend näher beschriebenen Fermentationsver- fahrens weist einen Fermentationsbehälter 2 auf, der mit einem Druck- deckel 8 druckdicht verschließbar ist.

Der Fermentationsbehälter 2 ist mit mindestens einer in den Reaktorraum 49 reichenden Düsenanordnung 10,20 versehen, die über einen Druck- behälter 44, über eine Druckgasleitung 3 für eine vertikale Düsenanord- nung 10 bzw. über eine Druckgasleitung 4 für eine horizontale Düsenan- ordnung 20 mit Druckluft 48 versorgt wird.

Der Druckbehälter 44 enthält zusätzlich einen bioreaktiven flüssigen Stoff 50, der über ein Absperrventil 7 und eine Druckleitung 5 der horizontalen Düsenanordnung 20 und/oder eine Druckleitung 9 der vertikalen Düsen- anordnung 10 zugeführt werden kann. Die vertikale Düsenanordnung 10 und/oder die horizontale Düsenanord- nung 20 kann demzufolge auch als Zugabeeinrichtung für bioreaktive Stoffe alternativ zur Druckgasbeaufschlagung verwendet werden.

Am Boden des Druckbehälters 44 befindet sich eine Ablaufleitung 11 mit einem Absperrventil 12. Am oberen Ende des Druckbehälters 44 ist eine Zuführleitung 13 für die Zufuhr bioreaktiver Stoffe 50 sowie ein Absperr- ventil 15 angeordnet.

Das Druckgas 48, z. B. Druckluft, wird über eine Zuführleitung 17 und ein Absperrventil 18 zugeführt.

Seitlich neben dem Druckbehälter 44 ist ein Steigrohr 19 angeordnet.

Der Fermentationsbehälter 2 weist des weiteren eine Druckausgleichsein- richtung 21 mit einem Absperrventil auf. Am Boden des Fermentationsbe- haltes 2 ist unterhalb eines konischen Bodenabschnitts 32 (Fig. 2) eine Ablaufrinne 36 vorgesehen, die mit einem Maschennetz 38 abgedeckt ist, so dass in dem Fermentationsbehälter 2 enthaltene Flüssigkeit vor ihrem Ablauf in die Ablaufrinne 36 grob gefiltert wird. Der Boden der Ablaufrinne 36 verläuft schräg zur Horizontalen, wobei an der Stirnseite 51 des Fer- mentationsbehälters an der tiefsten Stelle der Ablaufrinne 36 ein Ablauf- ventil 40 vorgesehen ist.

An der Stirnseite 51 des Fermentationsbehälters 2 befindet sich eine ab- nehmbare Klappe 53, um den Innenraum und das Maschennetz 38 reini- gen zu können, ohne die den Reaktorraum 49 abschließende Deckplatte 8 öffnen zu müssen. An der Ablaufrinne 36 sind gegenüberliegend zwei Fenster 41 angebracht, die es ermöglichen mit einem optischen Sensor die optische Dichte des fermentierten Stoffes zu bestimmen (Fig. 3). Zu- sätzlich an den Seitenwänden angebrachte Fenster 62,64 ermöglichen eine visuelle Kontrolle der Fermentationsbedingungen, sie sind jedoch nichtobligatorisch.

Anstelle von oder zusätzlich zu einer nachfolgend beschriebenen externen Messkammer 72 kann an einer Seite des Fermentationsbehälters 2 eine abdichtbare Einrichtung 66 für regeltechnische Elektroden (z. B. pH, 02- Partialdruck, Leitfähigkeit, Ionenspezifizität, usw.) sowie eine Druckaus- gleichseinrichtung 21 für den kontrollierten Ablass von Luft oder während der Fermentation entstehender Gase aus dem Fermentationsbehälter 2 angebracht sein.

Alle mit Medium oder Gasen in Kontakt kommenden Komponenten sind unabhängig voneinander autoklavierbar.

Der erfindungsgemäße Bioreaktor kann weiterhin Vorrichtungen zum Wärmeaustauscn, d. h. Heizen und Kühlen aufweisen. Hierzu kann der Fermentationsbehälter 2 doppelwandig sein, so dass ein Hohlraum 51a ausgebildet ist. Dieser ist zwischen der inneren und äußeren Wand des Behälters 2 ausgebildet. Der Hohlraum 51a ist über ein Anschlussrohr 51b und Abflussrohr 51c, beispielsweise mit einem entsprechend temperierten Wärmetauschflüssigkeitsreservoir (z. B. Wasser-oder Ölreservoir) ver- bunden. Das Wasser oder Öl das durch einen externen Thermostaten eine definierte Temperatur aufweist, umströmt den Behälter 2. Durch diese Vorrichtung kann der Bioreaktor in einem Temperaturbereich von 10 bis 90°C stufenlos betrieben werden, wodurch zum Einen die für verschie- dene Mikroorganismen optimale Temperatur im Bioreaktor eingestellt, und zum anderen der gesamte Bioreaktor samt Inhalt schonend sterilisiert bzw. tyndalisiert werden kann. Eine solche Sterilisierung/Tyndalisierung eines gesamten Bioreaktors in einem integrierten System, das als solches noch nicht beschrieben wurde, birgt deshalb deutlich Vorteile bei Anwen- dung des Systems. Wie aus den Fig. 2 und 3 ersichtlich, wird der Fermentationsbehälter 2 von einem Gestell 6 gehalten. Das Gestell 6 nimmt auch zwei Spindeln 22 auf, mit deren Hilfe der Druckdeckel 8 des Fermentationsbehälters 2 auf diesen herabgelassen oder angehoben werden kann. Der Druckdeckel 8 bildet zugleich die vertikale Düsenanordnung, indem über den Druck- deckel 8 die Zufuhr von Druckgas oder bioreaktiven Stoffen zu den verti- kal von dem Druckdeckel 8 abstehenden vertikalen Leitungsrohren 14 erfolgt. Die vertikalen Leitungsrohre 14 können unterschiedlich lang sein, wobei die Spitzen der Leitungsrohre 14 mit den Düsen 16 sich bei ge- schlossenem Druckdeckel 8 im Bereich des Boden des Fermentationsbe- hälters befinden. Durch das Absenken des Druckdeckels können die Düsen 16 auch feste Substrate im Reaktorraum penetrieren. In der geschlosse- nen Stellung des Druckdeckels kann der Fermentationsbehälter 2 druck- dicht abgeschlossen werden.

Die Spindeln 22 werden mit Hilfe von an der Oberseite des Gestells 6 an- geordneten Handkurbeln 27 betätigt.

Eine hohle Druckplatte 8 dient als Druckdeckel des Bioreaktors 1 und ist eine von zwei Möglichkeiten, den Bioreaktorraum im Fermentationsbe- hälter 2 zu belüften oder mit Medien zu versorgen. Sie kann vertikal von Schienen geführt sein und verschließt den Fermentationsbehälter 2 bei Betrieb hermetisch. Wenn der Bioreaktor 1 mit dem umzusetzenden Substrat beschickt werden soll, kann der Druckdeckel 8 neben der vorstehend beschriebenen mechanischen Art auch hydraulisch oder pneumatisch nach oben gefahren werden.

An der Oberseite hat der Druckdeckel 8 einen manuell oder elektronisch steuerbaren Anschluss für die Zufuhr von Druckluft (o. definierten Gasen).

Optional kann der Anschluss auch für die Zufuhr von flüssigen definierten Medien, z. B. benötigte Co-Substrate, Vitamine, Mineralstoffe, Puffer oder Antibiotika genutzt werden. Die Luft trifft in dem Druckdeckel 8 zunächst auf eine Prallplatte 45. An der Unterseite des Druckdeckels 8 sind aus- wechselbare Leitungsrohre 14 mit Düsen 16 in Gewinde eingeschraubt. Baut sich ein Druck in dem Druckdeckel 8 auf, strömt die Luft kontinuier- lich durch an den Spitzen der Leitungsrohre 14 befindliche Düsen 16 in den Reaktorraum 49 des Fermentationsbehälters 2 und belüftet diesen gleichmäßig. Neben der milden Durchmischung des Reaktorraums durch den kontinuierlichen Luftstrom, kann optional durch in definierten Inter- vallen gegebene starke Druckluftpulse eine deutliche Durchmischung des Reaktorraums erreicht werden.

Durch die unterschiedliche Länge der auswechselbaren, in den Druckde- ckel 8 einschraubbaren Leitungsrohre 14 ist es möglich, den Reaktorraum 49 gezielt zu belüften. Durch bis zum Boden des Fermentationsbehälters 2 reichende Düsen 16 kann ein homogener, aerober Reaktionsraum geschaffen werden. Bei der Wahl kürzerer Düsen wird ein definierter Raum mit geringem Sauerstoff-Partialdruck erzeugt. Der Bioreaktor 1 kann entweder ohne Begasung (in diesem Fall können die Gewinde des Druckdeckels 8 durch Blindstopfen geschlossen werden) oder durch Zu- fuhr von definierten 02-frein Gasen auch obligat anaerob gefahren wer- den. In diesem Fall sollten die möglicherweise zuzugebenden Medien vor Zugabe entgast werden.

Optional können flüssige Medien durch diese Düsen 16 auch aus dem Druck-oder Mischbehälter 44,46 in den Bioreaktor 1 eingelassen werden.

Falls erforderlich, kann die Belüftung in diesem Fall durch die horizontal den Reaktorraum 49 durchziehende Düsenanordnung 20 erfolgen.

Die Fig. 4 und 5 zeigen die in dem Fermentationsbehälter 2 angeordnete horizontale Düsenanordnung 20, die ebenfalls entweder mit Druckluft 48 oder mit einem flüssigen bioreaktiven Stoff 50 beaufschlagt werden kann.

Die horizontale Düsenanordnung 20 kann, wie aus Fig. 5 ersichtlich, ein- seitig in einer Stirnwand des Fermentationsbehälters 2 oder beidseitig in den Stirnwänden gelagert sein. Des weiteren kann vorgesehen sein, dass die horizontale Düsenanordnung in unterschiedlichen Höhen an der Stirn- wand gelagert wird.

Wie aus Fig. 5 ersichtlich, besteht die horizontale Düsenanordnung 20 aus drei sich horizontal und parallel zueinander durch den Fermentationsbe- hälter 2 erstreckenden Leitungsrohren 24, die jeweils eine Vielzahl von Düsenöffnungen 28 aufweisen. Die drei Leitungsrohre 24 sind untereinan- der über eine Einlassverzweigung 20a und eine Auslassverzweigung 20b verbunden.

Wie aus Fig. 5 ersichtlich, kann die horizontale Düsenanordnung 20 um eine horizontale Drehachse gedreht werden, um zusätzlich eine gute Durchmischung des Behälterinhaltes zu erreichen. Bei Rotation der hori- zontalen Düsenanordnung 20 ist die Länge der Leitungsrohre 14 der ver- tikalen Düsenanordnung 10 so zu wählen, dass keine Kollision zwischen den Leitungsrohren 14 und den Leitungsrohren 24 auftreten kann. Alter- nativ kann-wenn keine Sterilität des Fermentationsvorgangs erforderlich ist-die vertikale Düsenanordnung so weit vertikal nach oben herausge- fahren werden, dass keine Kollision zwischen den Leitungsrohren 14 und 24 auftreten kann. Für Einhaltung steriler Bedingungen ist die rotierbare horizontale Düsenanordnung 20 vorzugsweise an der tiefstmöglichen Stelle im Fermentationsbehälter 2 angeordnet. Die Leitungsrohre 14 sind dann vorzugsweise derart verkürzt, dass sie gerade nicht in den Dreh- bereich hineinragen. Die äußeren, benachbart zu den Seitenrändern des Fermentationsbehälters 2 angeordneten Leitungsrohre 14 sind hierbei länger ais weiter innen angeordnete Leitungsrohre.

Die Auslassverzeigung 20b kann ein Ventil aufweisen, um den Auslass zu verschließen bzw. auch als Einlassverzweigung eingesetzt werden, wobei das in die Leitungsrohre 24 zugeführte Material vollständig durch die Dü- senöffnungen 28 treten muss. Die Auslassverzweigung 20b kann auch vollständig entfallen. Dies erfordert allerdings einen stabileren Aufbau der Düsenanordnung 20.

Die Düsenanordnung 20 kann auch zum Heizen/Kühlen verwendet wer- den, indem die Düsen 28 verschlossen werden, oder die Düsenanordnung 20 durch ein entsprechendes Rohrsystem ohne Düsen ersetzt wird. Dabei dient die Einlassverzweigung 20a als Zufuhr der temperierten Heiz- /Kühiflüssigkeit und die Auslassverzweigung 20b als Abfluss derselben.

Eine derartige als Kühlanordnung ausgebildete Düsenanordnung 20 kann ebenfalls drehbar sein. Ferner können mehrere Düsen-/Kühlanordnungen vorgesehen sein, sodass gleichzeitig beispielsweise eine drehbare hori- zontale Düsenanordnung und eine drehbare horizontale Kühlanordnung in einem Behälter 2 angeordnet sein können.

Selbstverständlich ist es möglich, die vertikale Düsenanordnung 10 mit Druckgas 48 und die horizontale Düsenanordnung 20 mit dem bioreakti- ven Stoff 50 und umgekehrt zu beaufschlagen.

Die zweite Düsenanordnung 20 durchzieht den Reaktorraum 49 horizon- tal. Sie kann in unterschiedlichen Höhen eingesetzt werden und ist um ihre Achse drehbar gelagert. Diese Düsenanordnung wird zur Versorgung des Bioreaktors mit flüssigen definierten Medien, z. B. Wasser, benötigte Co-substrate, Vitamine, Mineralstoffe, Puffer oder Antibiotika genutzt, kann aber optional zur Belüftung und Durchmischung des Bioreaktors 1 eingesetzt werden. Bei der Fermentation von flüssigen oder wasserlösli- chen Substanzen kann die horizontale Düsenanordnung durch einen an der Außenseite des Bioreaktors 1 befindlichen Motor rotiert werden und so zu einer deutlichen Durchmischung des Bioreaktorinhalts beitragen. In diesem Fall werden kürzere vertikale Leitungsrohre 14 eingesetzt und die horizontale Düsenanordnung 20 in deren unterster Arretierung eingesetzt. Die Durchmischung des Bioreaktorinhalts bei der Fermentation fester Substanzen und die Versorgung des Bioreaktors 1 sowohl mit Luftsauer- stoff oder definierten Gasen als auch mit Medium wird pneumatisch durch Druckluft erreicht. Über den Weg eines Druckbehälters 44, der in diesem Fall auch als Medienvorratstank verwendet wird, gelangt die Luft in den Druckdeckel 8 und von da aus in die vertikalen bzw. optional in die horizontalen Düsen 16,28. Zwischen dem Druckbehälter 44 und dem Druckdeckel 8 befindet sich ein Absperrventil 26. Wird das Absperrventil 26 geschlossen und der Absperrventil 7 am Boden des Druckbehälters 44 geöffnet, wird Medium durch die Druckluft über das horizontale und optio- nal auch über die vertikale Düsenanordnung 10,20 in den Bioreaktor 1 gedrückt.

Fig. 6 zeigt ein Ausführungsbeispiel bei dem anstelle des Druckbehälters 44 ein Mischbehälter 46 an den Bioreaktor 1 angeschlossen ist. Mit dem Mischbehälter 46 sind mehrere Druckbehälter 52,54,56,58,60 verbunden, die unterschiedliche flüssige bioreaktive Stoffe, sowie Druckgas, z. B.

Druckluft, enthalten. Diese unterschiedlichen Stoffe können dem Mischbe- hälter 46 zugeführt werden und in diesem in einem gewünschten Verhält- nis gemischt werden. Über die Druckluftzuleitung 17 und das Absperrven- til 18 gelangt Druckluft zu einer Verteileinrichtung 23, die die Druckluft 48 auf alle angeschlossenen Druckbehälter 52,54,56,58 und 60 sowie auf den Mischbehälter 46 verteilt. Die Druckluftzuleitungen 25 für die einzel- nen Druckbehälter weisen jeweils ein Absperrventil 26 auf. Von der Ver- teileinrichtung 23 zweigt auch die Druckluftleitung 3 für den Fermentati- onsbehälter 2 ab.

Um unterschiedliche Medien gezielt in den vorgestellten Bioreaktor 1 ein- bringen zu können, wird das pneumatisches System aus mehreren Druck- behältern 52,54,56,58,60 unterschiedlichen Volumens genutzt. Fig. 6 zeigt eine Anwendung mit fünf austauschbaren und getrennt voneinander autoklavierbaren Druckbehältern (z. B. für Medium, zwei Puffer, Spuren- elementlösung und Antibiotikalösung), bei denen graduierte Steigrohre 19 die jeweiligen Fü ! ! stände der Druckbehälter 52,54,56,58,60 anzeigen. Die Druckluft gelangt über eine Verteileinrichtung 23 in das pneumatische System. Ein Teil kann bei Bedarf zur Belüftung des Bioreaktors 1 direkt in die vertikale und/oder horizontale Düsenanordnung 10,20 geleitet wer- den. Die unabhängig voneinander regulierbaren Druckbehälter sind mit der Verteileinrichtung 23 verbunden. Die jeweiligen Medien aus den ein- zelnen Druckbehältern werden in einen Mischbehälter 46 gegeben. Ist der Mischbehälter mit den unterschiedlichen Medien gefüllt, wird der Druck- ausgleich über eine Druckausgleicheinrichtung 47 ermöglicht und durch eine weitere Druckgasleitung 34 der Verteileinrichtung 23 z. B. Druckluft in den Druckbehälterboden gepresst. Dadurch erfolgt die Durchmischung der unterschiedlichen Lösungen. Ist der Mischvorgang beendet, wird der Mischbehälter 46 unter Druckluft gesetzt und das gewünschte Medium in die horizontale und/oder vertikale Düsenanordnung 10,20 eingeleitet.

Jeder Druckbehälter kann mit einem Steigrohr 19 versehen sein. Die Zu- führleitungen 29 für die bioreaktiven Stoffe aus den Druckbehältern wei- sen jeweils ein Absperrventil 30 auf.

Von der Verteileinrichtung 23 zweigt desweiteren eine Druckgasleitung 34 ab, die ein Absperrventil 35 enthält, wobei die Druckgasleitung 34 zu ei- ner Abflussleitung 37 am Boden des Mischbehälters 46 führt, um für den Mischvorgang beispielsweise Druckluft zuzuführen. Die Abflussleitung ist mit einem Absperrventil 39 versehen. Von der Abflussleitung 37 zweigt eine Zuführleitung 42 mit einem Absperrventil 43 ab, über die die ge- mischten bioreaktiven Stoffe 50 dem Bioreaktor 1 zuführbar sind.

Der Mischbehälter 46 ist desweiteren mit einer Druckausgleicheinrichtung 47 für den Druckausgleich beim Mischvorgang versehen.

Das Druckgas kann der vertikalen und/oder horizontalen Düsenanordnung 10,20 auch in pulsierender Form zugeführt werden.

Mit dem Fermentationsbehälter 2 ist eine Messeinrichtung 70 verbunden.

Die Messeinrichtung 70 weist eine Messkammer 72 auf, die über eine Zu- führleitung 74 mit dem Fermentationsbehälter 2 verbunden ist. Durch die Zuführleitung 74 fließt aus dem Fermentationsbehälter 2 das zu messende Medium in die Messkammer 72. Um unabhängig von den Bedingungen in der Messkammer 72 die Fließrichtung aus dem Fermentationsbehälter 2 in die Messkammer 72 festzulegen, ist in der Zuführleitung 74 ein Rück- schlagventil 76 angeordnet.

In der Messkammer 72 sind mehrere Messelektroden 78 vorgesehen, die über Leitungen 80 mit einer Messeinrichtung 82, die vorzugsweise com- putergesteuert ist, verbunden sind. Durch die Messelektroden 78 kann beispielsweise eine pH-, Sauerstoff-, Temperatur-und Ionen-Messung erfolgen.

Am Tiefpunkt der im Wesentlichen rautenförmigen Messkammer 72 ist mit der Messkammer 72 eine Rückführleitung 84 verbunden. Über die Rück- führleitung 84 wird das gemessene Medium in den Fermentationsbehälter 2 zurückgeführt.

Zum Zurückführen des Mediums in den Fermentationsbehälter 2 wird die Messkammer 72 mit Druck beaufschlagt. Hierzu ist der Messkammer 72 eine Druckkammer 86 zugeordnet. Die Druckkammer 86 ist über Leitun- gen 88,90 mit einer Druckluftquelle verbunden. Zur Erzeugung eines Überdrucks in der Druckkammer 86 ist ein Ventil 92 geöffnet und ein Ventil 94 geschlossen, so dass die Druckluft in Richtung der Pfeile 96 in die Druckkammer 86 strömt.

Um Medium aus der Messkammer 72 durch die Rückführleitung 84 in den Fermentationsbehälter 2 zurückzuführen, wird das Ventil 92 geschlossen und das Ventil 94 geöffnet. Hierdurch strömt die Druckluft aus der Druck- kammer 86 in Richtung der Pfeile 98 durch eine mit der Messkammer 72 verbundenen Leitung 100 in die Messkammer 72 und erzeugt hierin einen Überdruck. Der definierte Überdruck in Druckkammer 86 ist zu dem Vo- lumen der zu verdrängenden Flüssigkeit in der Messkammer 72 direkt proportional. Aufgrund des in der Messkammer 72 entstehenden Über- drucks wird das Rückschlagventil 76 in der Zuführleitung 74 geschlossen und das in der Messkammer 72 befindliche Medium wird durch die Rück- führleitung 84 in den Fermentationsbehälter 2 zurückgedrückt. Um eine gleichmäßige Verteilung des Luftdrucks in der Messkammer zu erreichen und Verwirbellungen zu vermeiden, ist im Bereich des Einlasses der Druckluft in die Messkammer 72 ein Prallblech 102 vorgesehen.

Sobald das Medium aus der Messkammer 72 in den Fermentationsbehäl- ter 2 zurückgefördert ist, wird das Ventil 94 wieder geschlossen und das Ventil 92 geöffnet. Hierdurch baut sich erneut ein Überdruck in der Druck- kammer 86 auf. Sobald das Ventil 94 geschlossen ist, findet in der Mess- kammer 72 ein Druckausgleich statt, so dass das Rückschlagventil 76 durch aus dem Fermentationsbehälter 2 strömende Medium wieder geöff- net wird. Bei dem Ventil 76 kann es sich ferner um eine schaltbares Ventil handeln, um beispielsweise die der Messkammer 72 zugeführte Menge an zu messendem Medium zu steuern.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur aeroben Fermentierung fester Stoffe, wobei das diese festen Stoffe enthaltende Reaktionsmedium durch von oben in das Reaktionsmedium zugeführtes Druckgas 48 durchmischt wird. Dies erfolgt erfindungsgemäß dadurch, dass das Druckgas mittels geeigneter Vorrichtungen (wie z. B. eine verti- kale Düsenanordnung 10, wie vorstehend beschrieben) direkt in das Re- aktionsmedium eingeleitet wird, sodass die sich ausbreitenden Gasbiasen eine Durchmischung bewirken. Da bei der aeroben Fermentation vor- zugsweise sauerstoffreiches Druckgas (wie Luft, mit 02 angereicherte Luft oder Oz) verwendet wird, wird durch dieses Verfahren auch der Sau- erstoffgehalt in dem Reaktionsmedium erhöht, was üblicherweise die Fermentation zusätzlich beschleunigt. Das Einführen des Druckgases kann kontinuierlich (nachfolgend auch als"Belüftung"bezeichnet) oder durch Druckgaspulse (nachfolgend auch"Durchmischung bezeichnet) erfolgen.

"Feste Stoffe"im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens sind dabei vorzugsweise Kohle, Holz und belastete Böden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Fermentierung von Kohle, insbesondere von Braunkohle, geeignet. Die letztere besteht aus drei durch ihre unter- schiedliche Löslichkeit in Abhängigkeit vom pH-Wert definierte Faktoren : 1. Huminsäuren, die durch 0,1 N NaOH-Lösung extrahierbar sind ; 2. Fulvinsäuren, die auch im sauren Milieu löslich sind ; 3. der als Matrix bezeichnete der unlösliche Rückstand.

Zur Verflüssigung der Braunkohle wird das Ausgangsprodukt, das gege- benenfalls vorbehandelt oder voroxidiert sein kann, in zermahlenem Zu- stand (Partikelgröße vorzugsweise 0,1 mm bis 2 cm, besonders bevorzugt 1 bis 10 mm) mit einer zur Solubilisierung ausreichenden Menge Lö- sungsmittel (d. h. Wasser oder Lösungsmittelsysteme auf wässriger Ba- sis), Nährstoffe, Puffer (einschließlich Puffersubstanzen, Säuren, Basen) und Mikroorganismenkultur versetzt und unter Durchmischung mit sauer- stoffhaltigem Druckgas kultiviert.

Geeignete Mikroorganismen für die Solubilisierung von Braunkohle sind dabei Schimmelpilze, Weißfäulepilze und Hefen. Ein bevorzugter Mikroor- ganismus für diesen Anwendungszweck ist Trichoderma atroviride. Die Nährstoffe die für dieses Fermentationsverfahren eingesetzt werden rich- ten sich stark nach der Art des verwendeten Mikroorganismus. Bevorzugt ist dabei insbesondere die Zugabe von Kohlenstoffquellen zu Beginn der Reaktion an den die Braunkohle verflüssigenden Mikroorganismus, um ei- nen Wachstumsvorteil zu gewährleisten.

Es werden Puffersubstanzen eingesetzt, die den gewünschten pH-Wert zum jeweiligen Reaktionszeitpunkt gewährleisten. So wird zu Beginn der Reaktion, wo ein pH von 5,5 bis 6,0 bevorzugt ist, und in der Verflüssi- gungsphase, wo ein pH von 6,5 bis 7,2 bevorzugt ist, vorzugsweise ein Citrat-/Phosphatpuffer mit einem pH von 3 verwendet, da der Pilz beim Wachstum das Medium selbst alkalisiert und nur gegentitriert werden muss. Besonders bevorzugt wird zu Versuchsbeginn ein pH von 5,5 einge- stellt. Die Fermentation erfolgt bevorzugt bei einer Temperatur von 15 bis 35 °C.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Braunkohle, das Braun- kohle/Lösungsmittelgemisch oder das Braun- kohle/Lösungsmittel/Nährmittelgemisch vor der Zugabe der fermentieren- den Mikroorganismen sterilisiert bzw. tyndalisiert. Dies erfolgt vorzugs- weise durch mehrere Zyklen eines mindestens 45minütigen Erhitzens auf Temperaturen über 75 °C, vorzugsweise über 80 °C, und nachfolgende Abkühlung für mehrere Stunden auf Raumtemperatur.

Bei den 80°C Schritten wurden die physiologisch aktiven Mikroorganismen in Substrat, Medium und Reaktorraum, nicht jedoch ruhende Sporen ab- getötet. In den Zeiten mit moderaten Temperaturen keimten die Sporen und wurden in dem dann folgenden anschließenden Hitzeschritt abgetötet.

Beim konventionellen Tyndalisieren wird ein dreimaliges Erhitzen einer Flüssigkeit oder eines Nährmediums verstanden. In den Intervallen zwi- schen den Temperaturschritten wird das Gut bei Raumtemperatur aufbe- wahrt (Eckhard Bast, 1999, Mikrobiologische Methoden : eine Einführung in grundlegende Arbeitstechniken-Heidelberg, Berlin ; Spektrum, Akad.

Verl. ISBN 3-8274-0786-9).

Die gemäß dem vorliegenden Verfahren erhältliche mikrobiell solubilisierte Kohle kann als Kohlenstoff-und Energiequelle für Bakterien verwendet werden, die in der Lage sind, aus dem chemisch heterogenen Massen- produkt Kohle einen chemisch charakterisierten Stoff wie z. B. Polyhydro- xyfettssäuren für die Synthese biologisch abbaubarer Kunststoffe zu pro- duzieren (A. Steinbüchel und B. Füchtenbusch, Proceedings ICCS 97, 1673-1676 (1997)). Der aliphatische, mikrobiell nicht zu verflüssigende Rest, der einen geringeren Wasser-und Ascheanteil und somit einen hö- heren spezifischen Brennwert aufweist, kann zum einen für die direkte thermische Nutzung (R. Kopsel et al., Freiberger Forschungshefte, 159- 166 (1998)) zum anderen für weitere anschließende Fermentationspro- zesse durch aliphatenabbauende Hefen genutzt werden (U. Hölker et al., Proceedings of the 16th SMYTE, Slowakei, S. 16 (1998) ; Folia Microbiol 44, 226-227 (1999)).

Besonders bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren in dem vor- stehend beschriebenen Bioreaktor durchgeführt.

Die vorliegende Erfindung wird anhand des nachfolgenden Beispiels näher erläutert.

Beispiele Allaemeine Verfahren Das Produkt"verflüssigte Kohle"wurde als der Probeüberstand definiert, der nach 20 min Zentrifugieren bei 10 000 g erhalten wurde. Der Grad der Verflüssigung wurde mittels der optischen Dichte bei 450 nm oder über das Trockengewicht des Überstands bestimmt. Um die Huminsäure- verbindungen von Fuivinsäureverbindungen zu trennen, wurde der Über- stand auf pH 1,5 angesäuert und erneut zentrifugiert. Die verflüssigten Produkte wurden bezüglich ihrer optischen Dichte, Huminsäure-und Ful- vinsäuregehalt und der bakteriellen Verunreinigung mittels Inkubation von Proben in Vollmedien und anschließender mikroskopischer Analyse cha- rakterisiert.

Beispiel 1 : Fermentation von Braunkohle Ein erfindungsgemäßer Bioreaktor, wie in Fig. 1 bis 6 gezeigt, mit einer vertikalen Düsenordnung (10), einem Druckdeckel (8) mit bis zum Boden des Reaktorraums (49) reichenden Leitungsrohren (14) mit Düsen (16) und einer starren horizontalen Düsenanordnung (20) ; Volumen 25 I) wurde mit 2500 g Braunkohle (Bergheim Lithotyp A, Partikelgröße 2-10 mm, Wassergehalt der Kohle ca. 50 %) als umzusetzender Feststoff in 10 I Wasser beschickt. Als kohlesolubilisierender aerober Pilz wurde Tri- choderma atroviride eingesetzt (U. Hölker et al., Fuel Processing Technol., 52 65-71 (1997)). 50 g Glutamat wurden zugegeben, um die Induktion kohleverflüssigender Enzyme einzuleiten (U. Hölker et al., Appl. Microbiol.

Biotechnol. 44,351-255 (1995)). Der Anfangs-pH betrug 5,8, um dem Pilz gegenüber in der Kohle befindlichen Bakterien zunächst einen Wachs- tumsvorteil zu geben. Der zur Belüftung ausreichende kontinuierliche Luftdruck betrug 0,4 bar. Täglich wurde der Luftdruck durch die vertikale Düsenanordnung 10 für 10 s auf 3 bar erhöht, um den Reaktorinhalt zu durchmischen.

In einem semikontinuierlichen Ansatz wurden in Abständen von 24 Stun- den über die horizontale Düsenanordnung (20) 800 ml Wasser zugegeben und eine gleiche Menge Reaktorinhalt am Ablaufsystem entnommen. In dieser Suspension wurde die optische Dichte, der pH-Wert, der Humin- und Fulvinsäureanteil bestimmt und auf bakterielle Kontamination über- prüft. Erreichte der pH-Wert 7,3 wurde er über das Medienzulaufsystem auf 7,0 zurücktitriert (Fig. 8, Pfeile 1-5). Die in diesem Fermentationsansatz angestrebte Ausbeute an solubilisier- ter Kohle betrug 3 mg Trockengewicht pro ml Suspension bei pH 7 pro Tag und sollte kontinuierlich über einen Zeitraum von 30 Tagen hinweg konstant gehalten werden. Dies entspricht einer angestrebten Ausbeute von ca. 2 g Solubilisationsprodukte pro Tag. Bei einem Anstieg über 3,3 mg Trockenmasse pro ml wurde durch Wasserzugabe über das Medien- zulaufsystem der Reaktorinhalt verdünnt und wieder auf die gewünschte Konzentration eingestellt (Fig. 8, Pfeile 6-10).

Nach einer Fermentationszeit von 12 Tagen wurde die angestrebte Kon- zentration solubilisierter Kohle erreicht und in einem Zeitraum von weite- ren 28 Tagen wurden 71 g Solubilisierungsprodukte im vorgeschlagenen Bioreaktor produziert.

Beispiel 2 : Verfahren zur schonenden Sterilisierung von Bioreaktoren samt Inhalt ; modifizierte Tyndalisierung Ein erfindungsgemäßer Bioreaktor (wie in Fig. 1 bis 6 gezeigt, mit einer einführbaren vertikalen Düsenordnung (10) mit kurzen Leitungsrohren (14), Vorrichtungen zum Wärmeaustausch (51a, 51b, 51c) in der Außen- wand einer rotierbaren horizontalen Düsenanordnung (20) und einer Messeinrichtung (70) ; Vol. 12,5 I) wurde, exakt wie in Beispiel 1 beschrieben, beschickt. Der Druckdeckel (8) wurde geschlossen und die Düsen (16) somit pneumatisch in das Substrat gepresst. Das pneumatische Umwälz-und Mess-System wurde aktiviert und im Minu- tenintervall wurde das Medium an dem Temperaturfühler der Messkam- mer vorbei und durch das horizontale Düsensystem (20) wieder in den Bioreaktor zurückgepumpt. Wasser wurde im Thermostaten auf 95°C er- hitzt und durch den Mantel des Bioreaktors (51a, 51b, 51c) gepumpt, bis die Temperatur im Innenraum 80°C erreichte. Diese Temperatur wurde 45 min gehalten (unter ständiger Durchlüftung/Durchmischung durch das vertikale Düsensystem (10) und Umwälzens des Mediums durch das hori- zontale Düsensystem (20)). Anschließend wurde der Bioreaktor durch temperiertes Wasser in der Ummantelung auf 25°C gekühlt, dabei 12 Stunden belüftet, durchmisch und umgewälzt. Anschließend wurde die Temperatur im Bioreaktorraum wie zuvor erneut für 45 Minuten auf 80°C eingestellt. Es folgte eine erneutes Abkühlen für 20 Stunden auf 25°C, gefolgt von einem dritten Erhitzen des Reaktorinnenraums auf 80°C für 45min Um den Sterilitätserfolg zu überprüfen, wurde der Bioreaktor anschießend weiter durchmischt, belüftet und umgewälzt. Täglich (7 Tage) wurden 1 ml-Proben entnommen und mit diesen sowohl Petrischalen (1,2% Agar) als auch 50ml-Flüssigkulturen, die das im Bioreaktor verwendete Nähr- medium enthielten, angeimpft. Die Petrischalen wurden 72 Stunden bei 25°C, die Flüssigkulturen bei 25°C und 120 rpm auf dem Schüttler inku- biert. Es zeigte sich, dass keine Kontaminationen unter diesen Bedingun- gen im Reaktorraum detektierbar waren.

Nachdem die Sterilitätskontrolle durchgeführt war, wurde der Bioreaktor mit dem kohlesolubilisierenden Pilz T. atroviride angeimpft und die Kohle analog Beispiel 1, jedoch bei einer eingestellten Temperatur von 25°C fermentiert. Es wurde 60 g Verflüssigungsprodukt erhalten.