本発明の第1の側面は,自己線維芽細胞の� �集塊の製造方法に関する。すなわち,自己線� ��芽細胞を,ビタミンCが添加された自己血清� �地または無血清培地で培養する工程と,自己� ��維芽細胞を,前記自己線維芽細胞により分泌 されたコラーゲンを含む細胞外マトリックス により糸状の凝集塊となるように,回転培養,� ��とう培養,または傾斜培養のいずれかの培養 方法で培養する工程とを含む,自己線維芽細� �の凝集塊の製造方法である。従来,線維芽細� ��を培養すると,線維芽細胞の細胞塊が偶然得 られる場合があった。しかしながら,このよ� �な細胞塊は,通常取り除かれたし,細胞同士が バラバラな状態であり,仮に生体内に注入し� �も移動しやすいものであった。一方,本発明� ��は,積極的に,コラーゲンを含む細胞外マト� �ックスを分泌させ,自己線維芽細胞の凝集塊� ��得ることを目的とする。本発明では,細胞外 マトリックスを介して,自己線維芽細胞同士� �つなげられるため,生体内に注入された際に, 良好な足場が得られ,長期間患部に滞留する� �集塊を製造することができる。

 凝集塊を製造するための線維芽細胞は,公 知の方法で,補修する軟組織などから採取し,� ��養することができる。培養条件は,当業者で あれば,培養する線維芽細胞の由来に応じて� �宜調整することができる。また,線維芽細胞� ��培養する培地は,培養する線維芽細胞の由来 に応じて,当業者であれば,適宜公知の培地を� ��いることができる。本発明の凝集塊は,凝集 塊を製造するために線維芽細胞を提供した患 者本人に投与するため,線維芽細胞を培養す� �培地は自己血清培地や,動物由来成分を使用� ��ていない無血清培地(例えばASF培地104など)� �好ましい。動物や他人のタンパク質を利用� �ないことで,ウィルスの感染や,汚染などのリ スクを軽減できる。また,動物や他人のタン� �ク質が,患者に投与されたときにおこる免疫� ��応を防ぐことができる。

 「自己線維芽細胞により分泌されたコラ� ��ゲンを含む細胞外マトリックス」は,自己線 維芽細胞を培養することにより得られた自己 コラーゲンや,コラーゲン同士を接着する機� �を有するフィブロネクチンなどを含む物が� �げられる。後述する実施例により示された� �うに,具体的な細胞外マトリックスは,I型コ� �ーゲン,VI型コラーゲン,フィブロネクチン,ビ メンチン及びミクロフィブリル関連糖タンパ ク質などがあげられる。なお,細胞外マトリ� �クスの主成分は,通常自己コラーゲンである� ��ら,本明細書において,「自己コラーゲンを� �む細胞外マトリックス」を含むとは「自己� �ラーゲンを含む」と読み替えてもよい。

 本発明の培養工程では,自己線維芽細胞を 培養する際に,培地にビタミンCを0.001mM以上10m M以下(好ましくは0.01mM以上1mM以下,より好まし くは0.05mM以上0.5mM以下)添加する。そして,自� �線維芽細胞からコラーゲンを分泌させ,それ� ��より自己線維芽細胞の凝集塊を得る。本発� ��の凝集塊を得るための培養期間は,2日~1か月 があげられ,4~20日が好ましく,7~14日がさらに� �ましい。培養工程では,数日おきに培地を交� ��することが好ましい。培地交換を行う期間� ��して,1~7日があげられ,好ましくは2~4日であ� �。定期的に培地を交換することで,長期間培� ��する細胞の生存率を高めることができるの� ��,治療効果の高い凝集塊を製造することがで きる。また,培地交換を行う場合は,培地交換� ��行う毎に培地に添加するビタミンCの濃度を 上げていってもよい。徐々に濃度を高くする ことで,コラーゲンの方向をそろえることが� �き,効率的に糸状の凝集塊を製造することが� ��きる。

 本発明において,コラーゲンの方向とは,� �ラーゲンの伸長方向のことをさす。コラー� �ンに方向性を持たせるとは,コラーゲンを特� ��の方向に伸長させることをいう。そして,コ ラーゲンの方向をそろえるとは,複数の線維� �細胞から分泌されるコラーゲンをそれぞれ� �じ方向に向かって伸長させることをいう。

 本発明の培養工程では,自己線維芽細胞を ,前記自己線維芽細胞により分泌されたコラ� �ゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状� �凝集塊となるように,回転培養,振とう培養,� �たは傾斜培養のいずれかの培養方法で培養� �る。

 回転培養は,円筒状の培養容器など公知の 回転培養用の容器を用い,公知の装置を用い� �行うことができる。回転培養を行う場合の� �転速度は,0.01~5回転/分があげられ,0.05~3回転/� ��が好ましく,0.1~2回転/分がより好ましい。回 転培養工程は,培養工程の途中で回転速度を� �更してもよい。回転速度を変更する具体的� �培養工程としては,回転培養を開始後1~2日は, 0.1~0.5回転/分で培養する工程,その後,細胞が70 ~80%コンフルエントになるまで1.5~2回転/分で� �養する工程,その後培養を終了するまで0.5~1.5 回転/分で培養する工程があげられる。細胞� �コンフルエントの割合は当業者であれば適� �判断することができる。培地に添加するビ� �ミンCは,全行程の培地に添加しておいてもよ いが,1.5~2回転/分で培養する工程,及び0.5~1.5回 転/分で培養する工程の培地に添加すること� �好ましい。これら工程に添加するビタミンC� ��度は,0.001mM~10mMがあげられ,0.01mM~1mMが好まし� ��,0.05mM~0.5mMがより好ましい。このような工程 とすることで,コラーゲンの方向をそろえる� �とができ,効率的に糸状の凝集塊を製造する� ��とができる。

 振とう培養としては,上下動培養,水平動� �養,旋回培養などがあげられる。これらの培� ��には,培養面が平面な公知の培養用容器を用 いて行うことができる。振とう培養するため の振とう培養装置は,公知の装置を用いるこ� �ができる。

 上下動培養は,シーソー状態での振とう培 養である。上下動培養においての1回とは,例� ��ば,上下動培養用装置が,培養用容器を載置� �る板の中心に支点を有し,板の両端が上下に� ��く場合,板が水平の状態から,一端が上方向� �たは下方向に動き,その後,反対の方向に動き ,そして水平の状態に戻るという1サイクルを1 回とカウントする。上下動培養を行う場合の 振とう速度は,1~50回/分があげられ,5~30回/分が 好ましく,10~20回/分がより好ましい。シーソ� �状態の上下動をする角度は,培養用容器を水� ��に置いた位置を0度としたときに,±1~15度が� �げられ,±3~13度が好ましく,±5~10度がより好ま しい。

 上下動培養工程は,培養工程の途中で振と う速度,又は振とう角度を変更してもよい。� �とう速度を変更する具体的な培養工程とし� �は,上下動培養を開始後1~2日は,5~10回/分で培� ��する工程,その後,細胞が70~80%コンフルエン� �になるまで20~30回/分で培養する工程,その後� ��養を終了するまで10~20回/分で培養する工程� ��あげられる。また,振とう角度を変更する具 体的な培養工程としては,上下動培養を開始� �1~2日は,±1~2度で培養する工程,その後,細胞が 70~80%コンフルエントになるまで±10~13度で培� �する工程,その後培養を終了するまで±5~10度� ��培養する工程があげられる。培地に添加す� ��ビタミンCは,全行程の培地に添加しておい� �もよいが,振とう速度を変更する工程では,20~ 30回/分で培養する工程,及び10~20回/分で培養� �る工程の培地に添加することが好ましい。� �た,振とう角度を変更する工程では,±10~13度� �培養する工程,及び±5~10度で培養する工程の� ��地にビタミンCを添加することが好ましい。 これら工程に添加するビタミンC濃度は,0.001mM ~10mMがあげられ,0.01mM~1mMが好ましく,0.05mM~0.5mM� ��より好ましい。振とう速度,及び振とう角度 を変更する培養工程は,振とう速度,または振� ��う角度の一方を固定にして,もう一方だけを 変更してもよいし,両工程を変更してもよい� �このような工程とすることで,コラーゲンの� ��向をそろえることができ,効率的に糸状の凝 集塊を製造することができる。

 水平動培養は,水平面を保って一方向を往 復する振とう培養であり,1往復を1回とする。 水平動培養を行う場合の振とう速度は,1~50回/ 分があげられ,5~30回/分が好ましく,10~20回/分� �より好ましい。水平動培養工程は,培養工程� ��途中で振とう速度を変更してもよい。振と� ��速度を変更する具体的な培養工程としては, 水平動培養を開始後1~2日は,5~10回/分で培養す る工程,その後,細胞が70~80%コンフルエントに� ��るまで20~30回/分で培養する工程,その後培養 を終了するまで10~20rpmで培養する工程があげ� ��れる。培地に添加するビタミンCは,全行程� �培地に添加しておいてもよいが,振とう速度� ��変更する工程では,20~30回/分で培養する工程 ,及び10~20回/分で培養する工程の培地に添加� �ることが好ましい。これら工程に添加する� �タミンC濃度は,0.001mM~10mMがあげられ,0.01mM~1mM� ��好ましく,0.05mM~0.5mMがより好ましい。このよ うな工程とすることで,コラーゲンの方向を� �ろえることができ,効率的に糸状の凝集塊を� ��造することができる。

 旋回培養は,水平面を保ち一定方向に旋回 する振とう培養である。旋回培養においての 1回とは,1回転をさす。旋回培養を行う場合の 振とう速度は,1~50回/分があげられ,5~30回/分が 好ましく,10~20回/分がより好ましい。旋回培� �工程は,培養工程の途中で振とう速度を変更� ��てもよい。振とう速度を変更する具体的な� ��養工程としては,旋回培養を開始後1~2日は,1~ 3回/分で培養する工程,その後,細胞が70~80%コ� �フルエントになるまで20~30回/分で培養する� �程,その後培養を終了するまで10~20回/分で培� ��する工程があげられる。培地に添加するビ� ��ミンCは,全行程の培地に添加しておいても� �いが,振とう速度を変更する工程では,20~30回/ 分で培養する工程,及び10~20回/分で培養する� �程の培地に添加することが好ましい。これ� �工程に添加するビタミンC濃度は,0.001mM~10mMが あげられ,0.01mM~1mMが好ましく,0.05mM~0.5mMがより 好ましい。このような工程とすることで,コ� �ーゲンの方向をそろえることができ,効率的� ��糸状の凝集塊を製造することができる。

 傾斜培養は,培養面が平面な公知の培養用 容器を用いて行うことができる。傾斜培養を 行うときの傾斜角度は,1~15度があげられ,5~10� �が好ましい。傾斜培養を行う際は,培養開始� ��1~2日は,傾斜をつけず水平な状態で培養し,� �の後培養を終了するまで傾斜角度1~15度で傾� ��培養することが望ましい。培地に添加する� ��タミンCは,培養開始時の培地から添加して� �いてもよいが,傾斜培養を開始してから添加� ��てもよい。添加するビタミンC濃度は,0.001mM~ 10mMがあげられ,0.01mM~1mMが好ましく,0.05mM~0.5mM� �より好ましい。このような工程とすること� �,コラーゲンの方向をそろえることができ,効 率的に糸状の凝集塊を製造することができる 。

 本発明の培養工程を終了後は,公知の方法 で細胞を剥離し,細胞の凝集塊を回収するこ� �ができる。本発明の細胞の凝集塊を剥離さ� �る分離液は,公知の分離液を使用することが� ��きる。具体的な分離液として,トリプシンや EDTAを含む分離液があげられる。静置培養し� �細胞から糸状の凝集塊を得るためには,細胞� ��バラバラにならないように分解力の弱いEDTA や非酵素系の分離液を使用する必要がある。 しかしながら,後述する実施例で示されたと� �り,本発明の製造方法で製造される凝集塊は, 自己線維芽細胞により分泌されたコラーゲン を含む細胞外マトリックスにより線維芽細胞 同士が強力につながっているので,プロテア� �ゼ活性を有するトリプシンなどの酵素を用� �ても凝集塊がほぐれることがない。よって,� ��リプシンなどの分解力の大きいプロテアー� ��等を含む分離液を使用して細胞を剥離させ� ��ことができる。

 本発明の細胞を剥離する工程で使用する� ��離液に含まれるトリプシンは,動物由来原料 を使用していないトリプシンであることが好 ましい。動物由来ではないトリプシンを使用 することで,製造された凝集塊を患部に投与� �た際,動物由来のトリプシンに対する免疫反� ��を防ぐことができる。動物由来ではないト� ��プシンは,市販されている組換え酵素である トリプシンなど公知のものを使用すればよい 。

 本発明の凝集塊を製造する線維芽細胞と� ��て,皮膚または歯肉由来の線維芽細胞が好ま しい。皮膚または歯肉由来の線維芽細胞は,� �ラーゲン分泌量が多いので,効率よく糸状の� ��集塊を製造することができる。

 本発明の凝集塊は,後述する実施例で示さ れたとおり,コラーゲンを多く含有し,自己線� ��芽細胞から分泌されるコラーゲンを含む細� ��外マトリックスを介して前記自己線維芽細� ��同士がつなげられることにより糸状となっ� ��凝集塊である。また,後述する実施例で示さ れたとおり,本発明の凝集塊は,プロテアーゼ� ��抗性を有する。このようなコラーゲンを含� ��細胞外マトリックスでつながった凝集塊は, 患部に投与したとき,コラーゲンを含む細胞� �マトリックスが足場となり,患部外に凝集塊� ��移動しにくくなる。また,プロテアーゼ抵抗 性を有するので,生体内のプロテアーゼによ� �て分散されにくい。さらに,自己血清培地ま� ��は無血清培地を用いて製造された凝集塊は, 凝集塊を患部に投与した際,患部で炎症反応� �起こりにくい。また,自己由来の原料を用い� ��ことで,ウィルスなどによる感染や汚染など を防止することができることになるので,高� �治療効果を得ることができる。本発明の製� �方法によって製造された凝集塊は,は,動物や 他人のタンパク質を利用しない。よって,本� �明の製造方法によって製造された凝集塊は,� ��ィルスの感染や,汚染などのリスクを軽減で きる。よって,本発明の凝集塊は,患部に留ま� ��ことでき,凝集塊を投与した際におこる免疫 反応やウィルス感染などのリスクを軽減でき ,高い治療効果を得ることができるので,軟組� ��の欠損を修復するために好適に用いること� ��できる。

 本発明の第2の側面は,凝集塊と,薬学的に� ��容される液剤とを含む,軟組織の欠損を修復 するための組成物に関する。前記凝集塊は,� �タミンCが添加された自己血清培地または無� ��清培地で培養する工程と,自己線維芽細胞を ,前記自己線維芽細胞により分泌されたコラ� �ゲンを含む細胞外マトリックスにより糸状� �凝集塊となるように,回転培養,振とう培養,� �たは傾斜培養のいずれかの培養方法で培養� �る工程とを含む,自己線維芽細胞の凝集塊の� ��造方法により製造される。前記薬学的に許� ��される液剤は,糖質,電解質,およびアミノ酸� ��含む液剤である。薬学的に許容される液剤� ��して,注射剤などに用いられる公知の液剤を 適宜用いることができる。具体的には,精製� �,蒸留水,生理食塩水などがあげられる。本発 明の組成物は,凝集塊を剥離させ,遠心分離に� ��り細胞を分離し,その後,生理食塩水などの� �浄液で洗浄し,薬学的に許容される液剤を加� ��ることで得ることができる。なお,本発明の 組成物には,凝集塊となっていない分散した� �胞が含まれていてもよい。分散した細胞は,� ��成物を患部に投与した際,凝集塊と凝集塊の 隙間を埋めることができるので,治療効果を� �めることができる。本発明の組成物におい� �,凝集塊と分散した細胞の割合は,50:50~99:1が� �げられ,70:30~80:20でもよく,80:20~95:5でもよい。 分散した細胞の割合が多すぎると,患部に細� �をとどめにくくなるので,好ましくは80:20~95:5 である。

 一方,後述する実施例により示されたとお り,高カロリー輸液など糖類,電解質及びアミ� ��酸を含む液剤中に懸濁させた場合,自己線維 芽細胞の生存性を高めることができる。高い カロリー輸液として,公知のものを適宜用い� �ことができる。糖類として,主にブドウ糖が� ��いられる。ブドウ糖の他の糖類として,フル クトース,キシリトース,又はソルビトースを� ��いてもよい。電解質として,Na(ナトリウム),K (カリウム),Cl(クロール),Ca(カルシウム),Mg(マ� �ネシウム)等があげられる。また,必要により ,Zn(亜鉛),P(リン),Fe(鉄),Cu(銅)等の微量金属類,� ��びクエン酸,グルコン酸,酢酸(アセテート類) ,乳酸(ラクテート類)等の有機酸が添加されて もよい。アミノ酸として,グリシン,L-アラニ� �,L-プロリン,L-アスパラギン酸,L-セリン,L-チ� �シン,L-グルタミン酸,L-システイン,L-ロイシ� �,L-イソロイシン,L-バリン,L-リジン,L-メチオ� �ン,L-フェニルアラニン,L-トレオニン,L-トリ� �トファン,L-アルギニン,又はL-ヒスチジンが� �げられる。これらの組成は,公知の高カロリ� ��輸液におけるものを適宜採用すればよい。

 本発明の組成物は,低温(たとえば,1℃以上 10℃以下,好ましくは2℃以上8℃以下)に保持す ることが好ましい。保持期間は,5日以下があ� ��られ,12時間以内が好ましく,4時間以内が最� �好ましい。後述する実施例に示されたとお� �,本発明の凝集塊は低温で一定時間保存した� ��も,細胞の増殖能が保たれている。よって,� �のような凝集塊を含む組成物を患部に投与� �ることで,高い治療効果をえることができる� ��本発明の組成物は,低温で保存した組成物を 低温のまま患部に投与してもよいが,投与前� �組成物を34~37度まで温めて投与してすること が好ましい。投与前に組成物を温めることに よって,患部に投与後の細胞増殖や,凝集塊の� ��部への接着性を高めることができる。

 本発明の第2の側面の好ましい態様は,前� �凝集塊は,分化した線維芽細胞を含む凝集塊� ��含む組成物である。線維芽細胞を分化させ� ��方法は,公知の方法で培養することによって 分化させることができる。細胞の分化速度は ,培養日数,培養条件によって異なるが,当業者 であれば適宜調整することができる。細胞の 分化度は公知の方法で測定することができる 。たとえば,未分化の細胞にのみ発現するタ� �パク質の活性を測定すればよい。また,未分� ��の細胞にのみ発現するタンパク質を染色し� ��もよい。当業者であれば,細胞の分化度を適 宜測定することができる。未分化の細胞は,� �胞周期が短く盛んに分裂増殖を繰り返す傾� �があるため,分化した細胞と比較して腫瘍化� ��リスクがある。一方,分化度の高い細胞は,� �器の構造・機能的性質が残っており,治療予� ��が良好である。よって,分化度の高い線維芽 細胞を含む凝集塊を含む組成物は,軟組織の� �損を修復するため好適に使用することがで� �る。

 本発明の組成物の好ましい態様は,皮膚の 軟組織の欠損を補修するための組成物であり ,しわや皮膚のたるみを除去するなど美容の� �めに用いられるもののほか,何らかの疾患に� ��り失った皮膚の何組織を回復するための医� ��組成物としても用いることができる。この� ��成物の好ましい利用態様は,注射剤であるが ,それ以外の用途に用いてもよい。

 また,本発明の組成物の好ましい態様は,� �肉の軟組織の欠損を補修するための組成物� �あり,老化,歯茎の傷,または歯肉を切るよう� �外科的治療などによって生じた歯肉退縮な� �の治療のために用いることができる。この� �成物の好ましい利用態様は,注射剤であるが, それ以外の用途に用いてもよい。

 本発明の第3の側面は,注射剤の製造方法� �関する。具体的には,ビタミンCが添加された 自己血清培地または無血清培地で培養する工 程と,自己線維芽細胞を,前記自己線維芽細胞� ��より分泌されたコラーゲンを含む細胞外マ� ��リックスにより糸状の凝集塊となるように, 回転培養,振とう培養,または傾斜培養のいず� ��かの培養方法で培養する工程と,培養した細 胞を剥離する工程とを含み,前記回収する工� �で得られた凝集塊を,第1の注射針を介して前 記凝集塊を注射器に収容した後に,前記注射� �から前記第1の注射針を取り除き,前記注射器 に前記第1の注射針よりも内径の小さな第2の� ��射針を取り付ける,注射剤の製造方法である 。このように,一端内径の太い注射針で凝集� �を吸い上げておいて,内径の細い注射針に替� ��るので,施術の際に適度な凝集塊の大きさに 成形でき,細胞への物理的なダメージを最小� �にでき,更に,凝集塊が注射針内に固まる事態 を効果的に防止できる。

 本発明の自己線維芽細胞を含む凝集塊は, 線維芽細胞同士がコラーゲンを含む細胞外マ トリックスによりつなげられたものである。 凝集塊が大きすぎると,注射針で注入できな� �なり,小さすぎると,患部に留まらない。その ような観点から,注射剤に含まれる凝集塊の� �状や大きさとして,糸状で,18~20G(ゲージ)の注� ��針により吸引できて,24Gから30Gの注射針で注 入できることが好ましい。このような大きさ の凝集塊は,培養容器の培養面積に占める細� �の割合を調整すること,細胞を剥離する分離� ��の濃度を調整すること,又は剥離して回収し た細胞を静置することで得ることができる。 培養容器の培養面積に占める細胞の割合とし ては,70~100%コンフルエントがあげられ,80~90%コ ンフルエントでもよく,90~95%コンフルエント� �もよい。細胞を剥離する分離液の濃度は,用� ��る分離液に応じて適宜調整することができ� ��。例えば,トリプシンを含む分離液を用いる 場合,分離液中のトリプシン濃度は,0.1~2%があ� ��られる。細胞を剥離した際,細胞の凝集塊が 小さい場合は,剥離した細胞を公知の容器に� �収し静置する。静置時間は30秒~10分があげら れ,1分~3分でもよく,3分~5分でもよい。剥離し� ��細胞の大きさによって適宜調整することが� ��きる。細胞を静置し沈殿させることで,分離 した細胞同士が再度つながるので,凝集塊の� �きさを大きくすることができる。沈殿させ� �細胞は,タッピング等でほぐすことで,凝集塊 を得ることができる。

以下,実施例を用いて本発明を具体的に説� �するが,本発明は以下の実施例に限定される� ��のではない。すなわち,当業者に自明は範囲 において,適宜修正を加えることができ,その� ��うなものも本発明に含まれる。