CAMPO DA INVENÇÃO

[001 ] A presente invenção relata a produção de um caldo nutritivo por meio de processos fermentativos utilizando uma cepa bacteriana geneticamente modificada. Com a aplicação de técnicas de engenharia genética foi desenvolvida uma cepa de Corynebacterium glutamicum que promove a produção de um meio nutritivo contendo ácidos orgânicos, açúcares e aminoácidos, como o ácido aminolevulínico. Esse meio nutritivo é incorporado na composição de cosméticos para promover uma pele mais saudável, evitando rugas e manchas. A área de cosméticos contendo extratos fermentados vem crescendo nos últimos anos, sendo esses compostos uma alternativa para ingredientes mais naturais nos cosméticos.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[002] Os processos fermentativos utilizam microrganismos para a produção de diversas biomoléculas que apresentam interesse comercial. Os microrganismos metabolizam o substrato presente na reação gerando metabólitos primários, como aminoácidos, e secundários, como antibióticos. Esses processos, atualmente, estão sendo bastante empregados nas indústrias alimentícias, farmacêuticas e cosméticas. Sendo essa tecnologia aplicada na produção, em escala industrial, de aminoácidos, vitaminas, ácidos orgânicos, entre outros compostos.

[003] Um maior conhecimento dos microrganismos só foi possível com o desenvolvimento de novas técnicas para a análise do genoma. Essas técnicas possibilitaram a aplicação de engenharia genética e metabólica para a realização de mutações específicas. Por meio da utilização dessas técnicas, é possível garantir uma melhor produção de biomoléculas de interesse comercial.

[004] A possibilidade de mutações em genes específicos utilizando ferramentas da engenharia genética evita alterações indesejadas no genoma microbiano. Logo, com as informações genômicas dos microrganismos e as técnicas de engenharia genética, é possível realizar modificações que visam aumentar ou diminuir a expressão de proteínas ou até mesmo a inserção e expressão de genes de diferentes organismos.

[005] O uso de microrganismos capazes de realizarem fermentações vem crescendo na indústria de cosméticos desde 1960. Já existem produtos sendo comercializados que tem em sua composição ingredientes gerados por fermentações de bactérias e leveduras. Os cosméticos contendo extratos fermentados têm crescido muito, tornando-se um dos maiores grupos de cosméticos (KR101320045).

[006] Um dos produtos mais conhecidos é o SK-II, bastante comercializado na Ásia. Esse produto apresenta um caldo fermentado obtido por leveduras como ingrediente ativo (KR101320045 e WO20171 13263). Outra empresa de origem coreana também apresenta produtos com tecnologia de fermentação (KR101320045). Os principais microrganismos utilizados nessas fermentações são lactobacilos ou leveduras, por já serem bastante conhecidos, não causarem efeitos nocivos aos seres humanos e por terem uma maior eficácia nas fermentações. Ainda existem limitações nessa área e mais pesquisas estão sendo feitas para o uso de compostos ativos provindos de fermentação em cosméticos, uma vez que existe uma demanda do mercado por compostos cada vez mais naturais (KR101320045 e WO20171 13263).

[007] O ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) é um aminoácido capaz de ser encontrado nos animais e nas plantas. Também é possível identificar esse aminoácido em alguns alimentos, como chá e vinho tinto (KR 101 180266). O 5- ALA, geralmente, é biossintetizado a partir de succinil-CoA e glicina pela ação da enzima ácido 5-aminolevulínico sintase (US 9333156). Essa molécula é um importante intermediário na biossíntese da célula, apresentando também ação no metabolismo energético propiciando uma hidratação quando aplicado na pele, além de retardar o envelhecimento da pele, evitado manchas e rugas. O aminoácido incorporado em cosmético também apresenta uma ação farmacológica sendo eficaz para tratar acne, dermatite, usado em tratamento de câncer de pele e terapia fotodinâmica, sendo uma das aplicações o tratamento de alopecia (KR 101 180266, KR 20080090741 e US 5520905).

[008] O 5-ALA é principalmente preparado por síntese química, porém esse tipo de síntese apresenta desvantagens, como alto custo, baixa conversão e poluição ambiental. Uma alternativa para esse processo é a modificação genética em microrganismos garantindo que eles passem a produzir, por meio de fermentação, o aminoácido de maneira mais eficiente e viável (CN 104450812).

[009] Existem microrganismos muito bem conhecidos e que tem um grande interesse comercial, por serem mais fáceis de trabalhar, mais seguros, apresentarem menos contaminações e atingirem produções mais altas em grande escala. A ideia é introduzir genes novos nesses microrganismos para que eles gerem diversos metabólitos de interesse que são mais difíceis de serem produzidos em larga escala pelos seus microrganismos de origem.

[010] A Corynebacterium glutamicum é um desses microrganismos de interesse industrial. Essa bactéria não patogênica já é usada na indústria para a produção, em larga escala, de L-glutamato, entre outros aminoácidos, possuindo potencial para a produção de ácidos orgânicos e biocombustíveis. A C. glutamicum tem um grande papel na indústria biotecnológica e vem sendo utilizada para a produção de 5-ALA, uma vez que o L-glutamato é precursor do ALA e esse microrganismo é considerado seguro, não apresentando riscos para o ser humano (YU et al, 2015). [01 1 ] Uma vantagem da produção de ingredientes ativos para cosméticos por fermentação é a obtenção de um caldo fermentado que contem não só o 5- ALA, como também outros aminoácidos, vitaminas, ácidos orgânicos, açúcares, entre outros compostos. A incorporação do fermentado em cosméticos garante um maior resultado, sendo mais barato, e o princípio ativo se torna o próprio caldo rico em nutrientes. Nesses fermentados já existem fatores de hidratação naturais que são responsáveis por promover o metabolismo da pele, prevenir rugas e mancha, e tem ação antioxidante (WO 20171 13263 e US 9333156).

ESTADO DA ARTE

[012] Diferentes patentes relatam o uso de caldo fermentado ou um substrato fermentado por microrganismo, na composição de cosméticos para uso tópico, como na publicação WO No. 20171 13263. Essa publicação cita o uso de bactérias acéticas, Gluconacetobacter xylinus, e um substrato que apresenta madeira, glicose e extrato de levedura. A cultura é realizada em dois estágios, cada um apresenta uma temperatura diferente. Após a fermentação é necessária uma etapa de purificação para remover a membrana de celulose formada no meio. Pode ser utilizado carvão ativado nessa etapa para a obtenção do caldo fermentado que vai ser incorporado no cosmético com uma concentração em torno de 5% (com base no peso).

[013] Já a patente KR No. 101320045 cita o uso de um lisado bacteriano na formulação de um cosmético para a pele. O composto ativo desse lisado é a bacterioclorofila obtida da lise da bactéria Rhodobacter sphaeroides. Após a lise das células a solução obtida é centrifugada para a remoção da biomassa presente.

[014] A presente invenção se diferencia dos dois casos citados pelo fato que o meio nutritivo a ser incorporado como princípio ativo em cosméticos é diferente, uma vez que o microrganismo utilizado e o substrato a ser fermentado não são os mesmos, gerando um produto final diferente. Tendo esse meio nutritivo em sua composição: açúcares, como glicose; ácidos orgânicos, como ácido cítrico; vitaminas; aminoácidos, como o ácido aminolevulínico. Promovendo uma pele mais saudável, hidrata e evitando o seu envelhecimento, além de ter ações farmacológicas, podendo ser utilizado no tratamento de acne, dermatite e alopecia, com terapia fotodinâmica.

[015] A patente US No. 9333156 cita um produto que contem o 5-ALA como ingrediente ativo para aplicação hidratante da pele. A patente KR No. 101325553 relata a possibilidade do 5-ALA, utilizado como composto ativo na formulação relatada, ter como origem um processo fermentativo, mas não cita como seria o substrato, nem o microrganismo ou o processo de purificação. A invenção aqui descrita se diferencia dos documentos já publicados por apresentar uma formulação cosmética diferente, onde o composto ativo não é somente o 5-ALA, mas um o meio nutritivo vindo da fermentação da C. glutamicum, geneticamente modificada, contendo açúcares, vitaminas, minerais e diferentes aminoácidos.

[016] A patente KR No. 101814888 cita a produção do 5-ALA por meio de uma cepa geneticamente modificada de C. glutamicum, mas não abrange uma aplicação e nem formulação de algum cosmético. A presente invenção tem como diferença das patentes citadas a utilização da bactéria C. glutamicum geneticamente modificada para a produção de um meio fermentado rico em nutrientes tendo como finalidade a formulação de um cosmético para uso na pele promovendo uma pele mais saudável e hidratada, retardando o envelhecimento da mesma, evitando manchas e rugas. Além de o cosmético poder ser usado pela sua ação farmacológica sendo eficaz para tratar acne, dermatite e alopecia.

DEFINIÇÕES [017] Os termos“aumento de expressão” ou "superexpressão do gene" são usados ao longo do texto e têm significados semelhantes.

[018] O termo “microrganismo” descrito nesta patente se refere preferencialmente, mas não se limita a, bactérias da espécie Corynebacterium glutamicum.

[019] O termo“modificação genética” se refere a qualquer tipo de alteração no genoma do organismo alvo, ou inserção de DNA na forma de plasmídeos ou análogos a estes. O DNA inserido pode ser constituído de genes do mesmo ou de outros organismos, constituindo um organismo geneticamente modificado.

[020] O termo“gene” se refere a qualquer sequência de deoxinucleotideos que codifique para uma determinada proteína.

[021] Os genes aqui descritos podem ser expressos preferencialmente a partir do DNA cromossomal, com a possibilidade de serem expressos também por meio de DNA plasmidial. Os genes aqui descritos podem ter sua atividade modificada contanto que este acumule mutações que codifiquem para a enzima com a otimização desejada.

[022] As sequências codificadoras dos genes molde descritos podem ser obtidas por PCR utilizando enzimas de alta fidelidade e com baixa taxa de incorporação de mutações, ou por síntese química realizada por empresas especializadas no serviço.

[023] O termo“glicose” se refere a fonte de carbono utilizada, variando apenas a concentração de C ₆ H ₁₂ O ₆ em sua composição.

[024] O termo“xilose” se refere a fonte de carbono utilizada, variando apenas a concentração de C ₅ H ₁₀ O ₅ em sua composição.

[025] O termo“arabinose” se refere a fonte de carbono utilizada, variando apenas a concentração de C ₅ H ₁₀ O ₅ em sua composição.

[026] O termo “glicerol”, se refere a fonte de carbono utilizada, variando apenas a concentração de C ₃ H ₈ O ₃ em sua composição. [027] O termo“glicina” se refere ao aminoácido de fórmula química C2H5N02 e número CAS 50-40-6 especificamente para o isômero L.

[028] O termo“serina” se refere ao aminoácido de fórmula quimica C3H7N03 e número CAS 56-45-1 especificamente para o isômero L.

[029] Os termos“ácido 5-amino levulinico”,“5-aminolevulinato” ou“5-ALA” se referem à mesma molécula, caracterizada por ser um aminoácido não proteico de fórmula quimica C5H9N03 e número CAS 160-60-5 especificamente para o isômero L.

[030] Define-se por gene sucD a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe C. glutamicum 13032 como NCgl2476, entre os desoxinucleotídeos 2.724.476 a 2.725.360, de acordo com o genoma de referência (Ikeda, 2003).

[031] Define-se por gene sucC a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe C. glutamicum 13032 como NCgl2477, entre os desoxinucleotídeos 2.725.382 a 2.726.578, de acordo com o genoma de referência (Ikeda, 2003).

[032] Define-se por gene Idh a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe C. glutamicum 13032 como NCgl2810, entre os desoxinucleotídeos 3.1 12.447 a 3.1 13.391 , de acordo com o genoma de referência (Ikeda, 2003).

[033] Define-se por gene pta a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe C. glutamicum 13032 como NCgl2657, entre os desoxinucleotídeos 2.936.506 a 2.937.495, de acordo com o genoma de referência (Ikeda, 2003).

[034] Define-se por gene ackA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe C. glutamicum 13032 como NCgl2656, entre os desoxinucleotídeos 2.935.313 a 2.936.506, de acordo com o genoma de referência (Ikeda, 2003). [035] Define-se por gene glyA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe C. glutamicum 13032 como NCgl0954, entre os desoxinucleotídeos 1.050.624 a 1.051.928, de acordo com o genoma de referência (Ikeda, 2003).

[036] Define-se por gene hemA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe R. capsulatus SB1003 como RCAP_rcc01447, entre os desoxinucleotídeos 1.563.630 a 1.564.859, de acordo com o genoma de referência (Strnad et al., 2010).

[037] Define-se por gene serA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe C. glutamicum 13032 como NCgl1235, entre os desoxinucleotídeos 1.350.855 a 1.352.447, de acordo com o genoma de referência (Ikeda, 2003).

197D

[038] Define-se por gene serA a variante do gene serA na qual a sequência de deoxinucleotídeos é composta por apenas 1005 nucleotídeos, de modo que após a expressão gênica, é gerada uma proteína truncada com 197 aminoácidos excluídos da região carboxi-terminal.

[039] Define-se por gene xylA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b3565, entre os desoxinucleotídeos 3.729.433 a 3.730.765, de acordo com o genoma de referência (Blattner et al., 1997).

[040] Define-se por gene xylB a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b3564, entre os desoxinucleotídeos 3.727.917 a 3.729.371 , de acordo com o genoma de referência (Blattner et al., 1997).

[041] Define-se por gene araA a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0062, entre os desoxinucleotídeos 66.835 a 68.337, de acordo com o genoma de referência (Blattner et al., 1997). [042] Define-se por gene araB a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG 1655 como Ò0064, entre os desoxinucleotídeos 68.348 a 70.048, de acordo com o genoma de referência (Blattner et al., 1997).

[043] Define-se por gene araD a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b0061 , entre os desoxinucleotídeos 65.855 a 66.550, de acordo com o genoma de referência (Blattner et al., 1997).

[044] Define-se por gene araE a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b2841 , entre os desoxinucleotídeos 2.980.674 a 2.982.182, de acordo com o genoma de referência (Blattner et al., 1997).

[045] Define-se como gene glpK a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b3926 e localizada entre os nucleotídeos 4.1 15.714 a 4.1 17.222 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).

[046] Define-se como gene glpF a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG1655 como b3927 e localizada entre os nucleotídeos 4.1 17.245 a 4.1 18.090 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).

[047] Define-se como gene glpD a sequência de deoxinucleotídeos identificada no genoma da estirpe E. coli K12 MG 1655 como b3426 e localizada entre os nucleotídeos 3.562.013 a 3.563.518 no genoma de referência (Blattner et al., 1997).

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[048] A presente invenção tem por objetivo descrever de forma detalhada o processo de modificação genética para a produção de estirpes de bactérias da espécia C. glutamicum com capacidade de produzir o ácido 5-aminolevulínico. Além disso, a presente invenção traz como inovação a uso do caldo fermentado de qualquer uma das referidas estirpes de C. glutamicum como uma mistura rica em nutrientes sendo assim o componente principal de diferentes formulações cosméticas. Essas formulações possuem a capacidade de hidratação, nutrição, proteção e reparação das células da pele.

[049] Visando tornar a presente invenção viável, a estirpe de C. glutamicum ATCC 13032 foi utilizada como estirpe chassi para as modificações genéticas aqui descritas, pelo fato de ser uma estirpe selvagem e o seu genoma estar completamente sequenciado e anotado em bases de dados públicas (Ikeda, 2003).

[050] Ainda, qualquer estirpe de bactérias do gênero Corynebacterium, desde que não apresentem patogeneicidade, podem ser utilizadas como estirpes chassi para o desenvolvimento de organismos capazes de produzirem moléculas de interesse comercial, como o ácido 5-aminolevulínico, e serem utilizadas em processos fermentativos a fim de gerar um caldo fermentado para ser utilizado como mistura rica em nutrientes para a formulação de cosméticos.

[051] Originalmente estirpes de C. glutamicum excelentes plataformas para a produção natural de aminoácidos, como o ácido glutâmico, por exemplo. Além disso, comercialmente existem estirpes modificadas geneticamente para a produção aminoácidos como L-lisina e L-treonina em larga escala. O mesmo se dá para a produção do ácido aminolevulínico, o qual, atualmente, possui sua produção em escala industrial proveniente de síntese quimica ou quimio- enzimática. Para que a C. glutamicum seja capaz de produzir o referido aminoácido é necessário que a estirpe chassi seja modificada geneticamente alterando, de modo a alterar o fluxo metabólico do microrganismo a fim de produzir esse aminoácido.

[052] Visando aumentar o fluxo metabólico para a produção de uma determinada molécula, diversas estratégias envolvendo engenharia metabólica de microrganismos podem ser empregadas. Pode-se, por exemplo, modular a expressão de determinado gene por meio de: aumento do número de cópias do gene de interesse no cromossomo da estirpe desejada; uso de promotor regulado ou constitutivo, a fim de induzir, aumentar ou diminuir a expressão do gene desejado; alteração do códon de iniciação; ou uso do gene em um plasmídeo que possua estabilidade quando inserido na estirpe de interesse. Para o especialista na arte, existem outras inúmeras formas de realizar a modulação da expressão gênica em microrganismos como a C. glutamicum.

[053] Como mencionado anteriormente, a expressão de um determinado gene pode se dar a partir do DNA cromossomal ou de um plasmídeo. No caso da inserção, deleção ou modificação de um fragmento de DNA no cromossomo, comumente é utilizada a técnica de recombinação homóloga baseada em recombinases virais. Associada a esta, pode-se aplicar a técnica de modificação gênica utilizando o sistema CRISPR por meio do uso de enzimas como a Cas9, Cpf1 , ou similares.

[054] No caso da presente invenção, é utilizada a técnica de recombinação homóloga associada a enzima Cpf1 para a inserção de genes no cromossomo da estirpe chassi, de maneira adaptada do sistema empregado por Jiang e colaboradores, 2017.

[055] As sequências nucleotídicas correspondentes as regiões promotoras, genes e regiões terminadoras, bem como outros elementos, como sítios para enzimas de restrição, sequências codificadoras para o RNA guia, entre outros, foram obtidas a partir da síntese nucleotídica realizada por empresas especializadas na arte.

[056] A montagem dos cassetes gênicos descritos na presente invenção foi realizada por meio de sistema de clonagem utilizando enzimas de restrição. Neste caso, a montagem dos cassetes se deu pelo uso das enzimas Xbal e BamHI, e a inserção dos cassetes no vetor de integração ao cromossomo se deu pelo uso das enzimas Apal e Hindlll. [057] A integração dos cassetes gênicos no cromossomo da estirpe chassi é realizada após eletroporação das células com o plasmídeo pNBCg_Cpf1 (e suas variantes) contendo o RNA guia apropriado para o alvo de interesse, bem como o gene que codifica para a nuclease Cpf1 de Francisella tularensis novicida.

[058] A confirmação da integração do cassete gênico no cromossomo da estirpe chassi é verificada por PCR utilizando primers específicos para as regiões de interesse. Desta forma, clones positivos são selecionados, subcultivados e preparados para novas etapas de edição gênica. As modificações genéticas executadas são descritas a seguir.

[059] A estirpe chassi ou qualquer outra estirpe do gênero Corynebacterium não é capaz de produzir ácido 5-aminolevulínico naturalmente. Desta forma, é necessária a expressão do gene hemA que codifica para a enzima 5- aminolevulinato sintase (ALAS), a qual produz ácido 5-aminolevulínico a partir de L-glicina e succinil-CoA. No caso da presente patente, a sequência nucleotídica utilizada é proveniente da bactéria da espécie Rhodobacter capsulatus, otimizado para a expressão em C. glutamicum.

[060] Ainda, se faz necessária a superexpressão do gene glyA da própria estirpe chassi, uma vez que esse gene codifica para a enzima serina hidroximetiltransferase, a qual é responsável por produzir glicina a partir do aminoácido L-serina e tetrahidrofolato. Desta forma, o cassete de expressão hemA-glyA, o qual possui a expressão controlada pelo promotor sintético constitutivo pTac, gera a estirpe NB_CgALA01. É importante ressaltar que a inserção deste cassete é realizada utilizando como alvo o gene sucD, de modo que a expressão desse é suprimida a fim de redirecionar o fluxo metabólico para a produção do 5-ALA.

[061] A fim de gerar uma estirpe com o fluxo metabólico aumentado para a produção do aminoácido L-serina, que é precursor da L-glicina, é realizada a inserção de um cassete gênico composto pelos genes serA, serB e serC, que codificam para as enzimas fosfoglicerato sintase, fosfoserina aminotransferase e fosfoserina fosfatase, respectivamente. É importante ressaltar que o gene serA contem a região carboxi-terminal deletada, de modo que os último 591 nucleotídeos da sequência são eliminados, a fim de gerar uma variante da proteína fosfoglicerato sintase que não sofre auto-regulação pela L-serina. O cassete gênico é controlado pelo promotor constitutivo pTac, e incorporado na estirpe NB_CgALA01 , gerando assim a estirpe NB_CgALA02. É importante ressaltar que a inserção deste cassete é realizada utilizando como alvo o gene sucC, de modo que a expressão desse é suprimida a fim de redirecionar o fluxo metabólico para a produção do 5-ALA.

[062] Visando a obtenção de uma estirpe capaz de metabolizar glucose e xilose como fontes de carbono, os genes xylA e xylB de Escherichia coli, segundo descrição de Kawaguchi et al., AEM 72:3418-3428 (2006), e de modo similar ao realizado na patente US939984E2, são superexpressados em forma de operon na estirpe NB_CgALA02. Os genes xylA e xylB codificam para as enzimas xilose isomerase e xiluloquinase, respectivamente. A expressão deste cassete gênico é realizada pelo promotor constitutivo pTac, gerando a estirpe NB_CgALA03. É importante ressaltar que a inserção desse cassete é realizada utilizando como alvo o gene Idh.

[063] Visando a obtenção de uma estirpe capaz de metabolizar glucose, xilose e arabinose como fontes de carbono, os genes araA, araB, araD e araE de E. coli, de modo similar ao realizado na patente EP2513302A1 , são superexpressados em forma de operon na estirpe NB_CgALA03. Os genes araA, araB, araD e araE codificam para as enzimas arabinose isomerase, ribuloquinase, ribulose-5-fosfato-4-epimerase, e para o transportador de arabinose, respectivamente. A expressão deste cassete gênico é realizada pelo promotor constitutivo pTac, gerando a estirpe NB_CgALA04. É importante ressaltar que a inserção desse cassete é realizada utilizando como alvo o gene pta. [064] Visando a obtenção de uma estirpe capaz de metabolizar glucose, xilose, arabinose e também glicerol como fontes de carbono, os genes glpF, glpK e glpD de Corynebacterium diphteriae, de modo similar ao realizado na patente US8426165B2, são superexpressados em forma de operon na estirpe NB_CgALA04. Os genes glpF, glpK e glpD codificam para a proteína transportadora de glicerol e para as enzimas glicerol quinase e glicerol-3- fosfodihidrogenase, respectivamente. A expressão deste cassete gênico é realizada pelo promotor constitutivo pTac, gerando a estirpe NB_CgALA05. É importante ressaltar que a inserção desse cassete é realizada utilizando como alvo o gene ackA.

[065] A tabela 1 representa as estirpes construídas com suas respectivas modificações.

Tabela 1 - Estirpes modificadas geneticamente para produção de 5-ALA.

[066] Processos fermentativos utilizando diferentes tipos de microrganismos apresentam uma diversidade de aplicações industriais. Em linhas gerais, o crescimento de uma estirpe geneticamente modificada, ou não, possui a capacidade de gerar uma mistura nutritiva que pode ser constituída da biomassa e do caldo fermentado em conjunto ou de forma separada, desde que, no caso da biomassa, essa seja preparada de forma adequada a não conter nenhum traço do microrganismo vivo. [067] Um processo para a geração de um produto desta sorte é descrito na patente de número US5840358A, a qual se refere ao processo fermentativo utilizando microrganismos como E. coli ou C. glutamicum modificados geneticamente para a produção de L-lisina, de modo que o produto final é constituído da biomassa rica em nutrientes e do caldo fermentado, além da L- lisina produzida pelos microrganismos em conjunto com a própria biomassa.

[068] No caso da presente invenção, descreve-se o uso de um microrganismo da espécie C. glutamicum geneticamente modificado capaz de produzir ácido 5-aminolevulínico onde, ao ser submetido a um processo fermentativo, o produto final, podendo ser composto de biomassa mais caldo fermentado, ou cada componente individual, é utilizado como uma mistura rica em nutrientes, utilizada como composição principal para a formulação de cosméticos.

[069] O processo fermentativo para a produção da mistura rica em nutrientes contendo diferentes compostos, como sacarídeos, ácidos nucleicos, lipídeos e aminoácidos, dentre eles o ácido 5-aminolevulínico, deve conter:

[070] a) pelo menos uma fonte de carbono, como por exemplo glucose, xilose, arabinose, entre outras, desde que o microrganismo seja capaz de metabolizar a fonte de carbono em questão;

[071 ] b) pelo menos uma fonte de nitrogénio, como por exemplo extrato de levedura, peptona ou sais inorgânicos que sejam utilizados como fonte de nitrogénio pelo referido microrganismo;

[072] c) pelo menos uma fonte de fósforo, como fosfato de sódio monobásico, fosfato de sódio dibásico, fosfato de potássio monobásico, fosfato de potássio dibásico, ou outro sal inorgânico composto por fósforo que seja assimilado pelo referido microrganismo;

[073] d) sais inorgânicos derivados de minerais ou vitaminas, como cloreto de sódio, carbonato de cálcio, sulfato de amónio, entre outros, desde que sejam assimilados pelo referido organismo. [074] e) pelo menos um ácido orgânico como ácido cítrico, ácido succnínico, ácido acético, entre outros.

[075] O processo fermentativo deve ser realizado preferencialmente em bioreatores com condições de temperatura, pH, alimentação, agitação e aeração controlados. No entanto, o processo fermentativo não se limita apenas as condições descritas anteriormente, podendo ser realizado em frascos como erlenmeyes, por exemplo, desde que as condições para crescimento da biomassa sejam fornecidas.

[076] Em relação a temperatura, o processo fermentativo pode ser realizado em faixas de temperatura ambiente a 37°C, preferencialmente de 25°C a 34°C, mais preferencialmente de 28°C a 32°C.

[077] Em relação ao pH, o processo fermentativo pode ser realizado em faixa de pH de 5,0 a 7,5, preferencialmente de 5,5 a 7,0, mais preferencialmente de 6,0 a 6,5.

[078] Em relação a alimentação, o processo fermentativo pode ser iniciado com concentrações de fonte de carbono variando de 10g/L a 60g/L, preferencialmente de 20g/L a 50g/L, mais preferencialmente de 30g/L a 40g/L. Ainda, a alimentação pode ser realizada de forma constante ou em pulsos, desde que a concentração da fonte de carbono seja mantida em um limiar de 2g/L a 8g/L, preferencialmente de 4g/L a 6g/L, mais preferencialmente de 5g/L.

[079] Em relação a agitação e aeração, o processo fermentativo pode ser realizado com uma faixa de agitação que varia de 150 a 250 rpm e aeração entre 1 a 3 vvm, preferencialmente agitação de 180 a 230 rpm e aeração entre 1 ,5 a 2 vvm. Eventualmente, quando em casos de alta densidade celular, a agitação pode ser aumentada para uma faixa de 300 a 600 rpm e aeração de 2 a 2,5 vvm.

[080] Em relação a biomassa, o processo fermentativo pode ser iniciado com um inoculo onde a concentração de células seja correspondente a D.0 ₆ oo de valor entre 1 a 10, preferencialmente 5 a 15, mais preferencialmente 10 a 20. [081 ] Após o processo fermentativo, a biomassa resultante e o caldo fermentado, sejam ambos em conjunto ou separados, podem ser submetidos a um processo de secagem completa ou parcial, a vácuo ou não, sob temperaturas de 40 a 80°C, preferencialmente de 50 a 70°C, mais preferencialmente de 55 a 65°C. Ainda, no caso do caldo fermentado ser utilizado separado da biomassa, este pode ser submetido a filtração ou ultrafiltração antes do processo de secagem.

[082] O produto final, constituído de uma mistura rica em nutrientes, composta da biomassa e do caldo fermentado, sejam ambos em conjunto ou separados, após o processo de secagem, pode ser utilizado no estágio de pó ou ser reconstituído por meio da adição de água, visando a formulação de cosméticos.

[083] O produto final pode ainda ser misturado a outras moléculas aditivas que atuem como princípio ativo. Estas moléculas podem ser outros sacarídeos, aminoácidos ou peptídeos, ácidos nucleicos e outros ácidos orgânicos, lipídeos e ainda enzimas ou fatores de crescimento, podendo essas moléculas já estarem presentes no caldo fermentado aqui descrito e adicionadas em maiores quantidades, ou simplesmente serem outras moléculas de outra origem que não do processo fermentativo, sendo adicionadas ao produto final, formando uma composição cosmética com outras propriedades além das conferidas pelo caldo fermentado contendo ácido 5-aminolevulínico.

[084] Ainda, o produto final, a fim de compor um produto cosmético que seja utilizado em pomadas, cremes, loções, maquiagem, ou outras aplicações cosméticas, pode ser constituído de elementos comumente aceitos na formulação de cosméticos, como emulsificantes, emolientes, solventes, excipientes, antioxidantes, entre outros.

[085] O exemplo descrito na presente invenção trata apenas de uma representação do processo fermentativo e posterior formulação de um creme cosmético a fim de ilustrar uma das várias aplicações da mistura nutritiva, de modo que não limite as aplicações possíveis do produto aqui descrito a apenas este caso.

[086] Exemplo 1 :

[087] Preparo de uma mistura nutritiva por processo fermentativo utilizando uma estirpe de C. glutamicum produtora de ácido 5-aminolevulínico para formulações cosméticas

[088] Primeiramente, a partir de uma colónia isolada da estirpe NB_CgALA05, é realizado um pré-inóculo em 10mL de meio contendo 10g/L de triptona, 5g/L de extrato de levedura, 10g/L de cloreto de sódio. Este é incubado a 30°C por 16 horas sob agitação de 200rpm. Em seguida, o conteúdo do pré-inóculo é diluído em 400mL do mesmo meio anterior, e incubado sob as mesmas condições, também por 16 horas, contituindo assim um inóculo. Por fim, o conteúdo do inóculo, com DOeoo de aproximadamente 5,0, é diluído em 1 L do meio para o processo fermentativo bioreator de 5L. O meio de cultura para o processo fermentativo é composto inicialmente de 40g/L de glucose, 10g/L de triptona, 5g/L de extrato de levedura, 10g/L de cloreto de sódio e 10g/L de L- glicina.

[089] Ao logo do processo, é realizada adição de glicose de modo a manter um mínimo de 3g/L e máximo de 30g/L de glicose disponível no meio. O pH da fermentação é mantido em torno de 6,5 por meio da adição de hidróxido de sódio quando necessário. A fermentação se dá por 48 horas a 30°C sob agitação de 300rpm e adição constante de 2 v.v.m. de oxigénio.

[090] Ao fim do processo fermentativo, a biomassa e o caldo fermentado são submetidos a secagem em rotaevaporador sob 60°C até que a solução seque completamente. [091 ] Um exemplo de preparação cosmética, mas não se limitando a essa, pode ser realizada utilizando a seguinte composição: 77,5% de água deionizada, 0,1 % de EDTA, 1 % de propilenoglicol, 0,3% de metilparabeno, 2% de álcool cetoestearílico, 0,10% de ciclometicona DC 245, 0,5% de silicone 9040, 0,5% de ácido hialuronico, 13% de glicerina e 5% da mistura nutritiva proveniente da fermentação anterior.

[092] Todos os componentes da mistura, com exceção do álcool cetoestearílico e silicone 9040, são misturados a 45°C até formar uma solução homogénea. O álcool cetoestearílico é aquecido a 80°C e então adicionado a mistura anterior. A mistura é homogeneizada por cerca de 10 minutos. Em seguida, acidiona-se o silicone 9040 e a mistura é novamente homogeneizada por 10 minutos. Após a estabilização da mistura completa e ajuste do pH para 6,5, tem-se o produto final formado.

REFERÊNCIAS

- YU, X. et al. Engineering Corynebacterium glutamicum to produce 5- aminolevulinic acid from glucose. Microbial Cell Factories, 14:183 (2015).

- KAWAGUCHI, H. et al., Engineering of a xylose metabolic pathway in Corynebacterium glutamicum. Applied and Environmental Microbiology, 72:5 (2006).

Patentes referenciadas: CN 104450812; KR 101 180266; KR 101320045; KR 101325553; KR 101814888; KR 20080090741 ; US 5520905; US 9333156; WO 20171 13263; US939984E2; EP2513302A1 ; US8426165B2; US5840358A.