以下、この発明の実施例及び比較例を示� ��。なお、本発明は下記の実施例に限定され� ��ものではない。

<実施例1 凍結保存溶液の調整>
 ε-ポリ-L-リジン(チッソ社製、分子量4000)は2 5%水溶液のものを、ポリアリルアミン(日東紡 、分子量5000(PAA-05L)、15000(PAA-L)、60000(PAA-H))は2 0%水溶液のものを用い、分子中のアミノ基に� ��し、モル%で0-100%の無水コハク酸(和光純薬� �業製)を添加することでアミノ基のブロック� ��の異なるポリアミンを作成した。それぞれ� ��ポリアミン溶液をダルベッコ改変培地(DMEM� �シグマアルドリッチ製)に0-10w/w%となるよう� �添加した。この際、pHが7.0-8.0の範囲内にな� �ように1Nの塩酸もしくは水酸化ナトリウム水 溶液で中和した。また、溶液の浸透圧はWescor 社製5520型蒸気圧法オズモメーターにて測定� �、浸透圧の調整には10%塩化ナトリウム水溶� �を用いた。

<実施例2 培養細胞の凍結保存>
 1×10 ⁶ 個のL929, MG63, Caco-2細胞(大日本住友製薬), co lon26, HT1080, B16F1, KB細胞(ATCC)をクライオバイ アル(Simport Plastics)中で各凍結保存液1mLに懸� �し、-80℃のフリーザー中で凍結保存を行っ� �。1週間後、37℃の温浴中で速やかに融解し� �DMEMで洗浄したのち、トリパンブルー染色に� ��り生死判定を行った。また、解凍した細胞� ��6wellカルチャーディッシュに1×10 ⁵ 個ずつ播種し、6時間後、24時間後のそれぞれ の生存率をトリパンブルー染色により評価し た。比較例としては一般的によく用いられて いる保存液である10%DMSO/ウシ胎児血清(FBS)を� �いた。

 図1に示すように、L929細胞を凍結保存す� �にあたり、アミノ基のモル数に対して50%以� �のモル数の無水コハク酸を添加したポリリ� �ン(PLL)の7.5%溶液を用いた場合、比較例のDMSO� ��液を用いた場合に比べて播種後24時間にお� �てほぼ同じか、より良好な生存率を示した� �なお、100モル%の無水コハク酸を添加したカ� ��ボキシル化ポリリジンについて、残留アミ� ��基含量をニンヒドリン法およびTNBS法で定量 することにより、アミノ基のブロック率を求 めたところ93%であった。また、ポリリジンの アミノ基に対して10モル%、27モル%、45モル%、 52モル%、63モル%、及び、79モル%の無水コハク 酸を添加した場合に、ブロック率は、それぞ れ、10%、25%、43%、50%、60%、76%であった。した がって、図1から知られるように、50~93%のブ� �ック率について凍結保存効果が確認された� �、ブロック率が60%のもの(63モル%の無水コハ� ��酸添加)、及び76%のもの(79モル%の無水コハ� �酸添加)で、特に優れた凍結保存効果が見ら� ��た。アミノ基を部分的にブロックしたポリ� ��リルアミン(分子量5000のアリルアミン重合� �について、アミノ基の45~90モル%に相当する� �水コハク酸を反応させたもの)の水溶液を用� ��た場合にも、ほぼ同様に、無水コハク酸に� ��るアミノ基ブロック率が増大するにつれて� ��より良好な生存率が得られた。

 図2では、同じくL929細胞を凍結保存する� �あたり、アミノ基のモル数に対して63%のモ� �数の無水コハク酸を添加したε-ポリ-L-リジ� �(図表中にPLL(0.63)と表示し、以下本文中にPLL� ��水コハク酸63%と表記)を用い、この部分ブロ ック化ポリリジンの濃度と細胞生存率との関 係を示す。図2から知られるように、部分ブ� �ック化ポリリジン(PLL無水コハク酸63%)の濃度 が7.0%以上である場合に、DMSO溶液を用いた場� ��とほぼ同等か、より高い細胞生存率が得ら� ��た。アミノ基を部分的にブロックしたポリ� ��リルアミン(分子量5000のアリルアミン重合� �について、アミノ基の63~85モル%に相当する� �水コハク酸を反応させたもの)を用いた場合� ��も、同様の傾向を示した。

 図1~2にて最も良好な結果を示す領域は、� ��結保存液の浸透圧を求めた場合に、400~600mOs m/kgである。すなわち、浸透圧が400~600mOsm/kgで 最も高い保存効果が得られた。

 一方、表1には、7.5%PLL無水コハク酸63%で保� �したときのその他の細胞の保存効果を示す� �表1の結果から知られるように、すべての細� ��種においてDMSO系(10%DMSO/ウシ胎児血清)とほ� �同じかそれ以上の生存率を示した。なお、� �体的なデータは示さないが、アミノ基を部� �的にブロックしたポリアリルアミンを用い� �場合にも同様であった。

<実施例3 毒性試験>
 L929細胞を用いた毒性試験を行った。10%ウシ 胎児血清を含有したダルベッコ改変イーグル MEM培地(DMEM)に懸濁させたL929細胞を、96wellマ� �クロプレートに1.0×10 ³ cell/well播種し、37℃で72時間培養後、ε-ポリ-L -リジン、及び、種々の濃度の無水コハク酸� �添加したポリリジンを、最終濃度0-10%となる ように添加し、48時間後、未添加系をコント� ��ールとして細胞の増殖が50%阻害される濃度� ��IC ₅₀ とし、MTT法で求めた。その結果を表2に示す� �比較例はDMSO系(10%DMSO/ウシ胎児血清)とした。 表2の結果から知られるように、PLL無水コハ� �酸58%、63%、79%のIC ₅₀ は、DMSO系の場合の2~3倍であった。すなわち� �上記実施例で用いた部分ブロック化ポリリ� �ンの毒性は、従来一般的な凍結保存液の1/2~1 /3と判断された。特には、図1のデータにて細 胞生存率が高かったPLL無水コハク酸63%と、PLL 無水コハク酸58%とにおいて、IC ₅₀ の値が特に大きかった。

 一方、L929細胞を含む凍結保存液を解凍後に 、そのまま12wellプレートに播種し、37℃で24� �間培養後に観察した。すなわち、PLL無水コ� �ク酸63%の7.5%溶液、及び、10%DMSO/ウシ胎児血� �の各凍結保存液にて、実施例2と同様にして� ��結保存し解凍を行ったが、解凍後に希釈や� ��浄をせずに、そのままプレート上に移して� ��養を行った。その結果、図3-1に示すようにD MSO系(10%DMSO/ウシ胎児血清)では明らかに細胞� �丸くなり死んでいるのに対して、図3-2に示� �ように本発明の保存液ではディッシュに付� �し、良好に生着していることが確認された� �アミノ基を部分的にブロックしたポリアリ� �アミン(分子量5000のアリルアミン重合体につ いて、アミノ基の63~85モル%に相当する無水コ ハク酸を反応させたもの)でも同様の低毒性� �結果を得た。

<実施例4 間葉系幹細胞の保存>
 ラット間葉系幹細胞(RMSC)の凍結保存を行っ� ��。比較例の保存液は10%DMSO/ウシ胎児血清で� �り、実施例の保存液はPLL無水コハク酸63%の7. 5%溶液(図4中に7.5%PLL(0.63)と表示)である。

 表3にラット間葉系幹細胞(RMSC)の解凍後の生 存率を示すが、本発明の凍結保存液でDMSO系� �ほぼ同じ生存率を示した。部分ブロック化� �リアリルアミンを用いた凍結保存液(分子量5 000のアリルアミン重合体について、アミノ基 の63~85モル%に相当する無水コハク酸を反応さ せ、DMEM倍地に7.5%濃度となるように添加した� ��の)でも同様の高い生存率であった。

 次に、実施例2と同様にして凍結保存後に 解凍した後、分化誘導をかけることにより骨 細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化能を評価 したところ、図4に示すように未凍結系、DMSO� ��とほぼ同様に多分化能を維持していること� ��以下のように確認された。図4は、カラーの 顕微鏡写真の画像データについて、光の3原� �(RGB)への色分解を行い、赤色(R)の色要素のみ を示したものである。したがって、赤色部分 が白色に表現され、青色部分が黒色に表現さ れている。骨分化能はカルシウムの沈着をア リザリンレッドS染色により評価した結果、� �ずれの場合も同じく赤く染色された。図4中� ��上段の写真を見た場合、非分化誘導系に比� ��て、分化誘導系がいずれも同様に淡いモノ� ��ロパターンに表現されているが、この淡い� ��ノクロパターンいはカラー写真にて全体に� ��味がかかっていることを示す。また、アル� ��リ性ホスファターゼ活性は非分化誘導系に� ��べ、いずれの保存液で凍結した場合でも未� ��結系と同じく高い値を示した。脂肪分化能� ��、細胞中の脂肪滴をオイルレッドOを用いて 染色したところ、いずれの保存液で凍結した 場合でも未凍結系と同じく赤く染色された脂 肪滴(図4中段にて、径が数十μmの淡色の円形� ��いし楕円形パターンとして表された部分)が 確認された。軟骨分化能に関しては、細胞塊 中のプロテオグリカンをアルシアンブルーで 染色したところ、いずれの保存液で凍結した 系でも未凍結と同じく青く染まるプロテオグ リカン(図4の下段にて濃い黒色部分として表� ��れた部分)が確認された。ポリアリルアミン から作成した凍結保存剤(分子量5000のアリル� ��ミン重合体について、アミノ基の63~85モル%� ��相当する無水コハク酸を反応させ、DMEM倍地 に7.5%濃度となるように添加したもの)で凍結� ��た場合でも同様に多分化能を維持していた� ��

<実施例5 臍帯血の保存>
 臍帯血は、血液抗凝固剤(EDTA2Na)を10.5mg充填� ��れた7mLプラスチック製真空採血管(テルモ株 式会社製、ベノジェクト2真空採血管)を使用� ��てヒト臍帯より採取した。次いで、このよ� ��に抗凝固剤を添加したヒト臍帯血中に、7.5% となるようにPLL無水コハク酸63%(7.5%PLL(0.63))を 添加し、-80℃のフリーザー中で3ヶ月間凍結� �存した。37℃の温浴中で速やかに融解し、希 釈等を行わないままのヒト臍帯血を一部採取 して、造血幹細胞の表面マーカーであるCD34� �発現率をフローサイトメトリー法を用いて� �定した。CD34造血幹細胞数をフローサイトメ� ��リーを用いて、文献(A. Higuchi et al., J. Bio med. Mater. Res., 68A, 34-42 (2004))記載の常法に� ��り測定した。すなわち、CD34造血幹細胞数は 、Stem-Kit(ベックマン・コールター社製)を用� �て、そのマニュアル(国際血液療法・移植学� �� ISHAGEガイドライン)に従って行った。3ヶ月 後においても、CD34造血幹細胞数は、初日に� �測された70%前後の細胞数が観察された。一� �、10%DMSO溶液で凍結保存したヒト臍帯血中のC D34造血幹細胞数は、初日に計測された20%前後 の細胞数であった。このように、ε-ポリ-L-リ ジンを添加した保存液でヒト臍帯血を保存す ると、CD34造血幹細胞を未分化の状態で長期� �保存できることが明らかとなった。

 このように、本発明の実施例の凍結保存� ��は、臍帯血の保存の効果においても際立っ� ��優れていることが知られた。

<実施例6 不凍タンパク活性>
 PLL(ε-ポリ-L-リジン)および無水コハク酸処� �PLLの不凍タンパク質活性を調べた。すなわ� �、氷の再結晶を阻害する効果について調べ� �。不凍タンパクには種々の特殊な活性が知� �れており、氷の表面に吸着することなどに� �り、熱ヒステリシス、氷の再結晶成長抑制� �氷晶の六方晶もしくはバイピラミッド状へ� �形態変化を引き起こすことが知られている(� ��許文献3~4)。

 まず、スクロース30%の水溶液に無処理のP LL、PLL無水コハク酸20%, PLL無水コハク酸46%, P LL無水コハク酸50%, PLL無水コハク酸65%, PLL無� ��コハク酸76%, 及びPLL無水コハク酸84%を0.1-15% で添加した。これら無水コハク酸処理PLLにお ける実際のアミノ基ブロック率を前述の方法 で測定したところ、約0.20, 0.43, 0.48, 0.62, 0. 73及び0.80であった。その溶液をガラスプレー トに4μLのせ、さらにガラスプレートでカバ� �してからリンカム社製10002L温度制御顕微鏡� �テージにて-30℃まで急冷し氷結晶を作成し� �。その後ゆっくりと温度を上げていき-9℃で 30分放置することにより氷結晶の成長を顕微� ��で観察した。その結果、図5の一連の顕微鏡 写真が知られるように、PLL(ε-ポリ-L-リジン)� ��アミノ基に対しその50モル%以上のカルボキ� ��ル基を導入することによりPLLに氷再結晶抑� ��効果を付与できることが確認された。図5に は、重量濃度が5%となるように添加した場合� ��示すが、PLL無水コハク酸50%(PLL(0.50))~PLL無水� ��ハク酸84%(PLL(0.84))は、1%~15%までの濃度で氷� �結晶抑制に有効であった。

 次に同じ急冷プレートにてPLLの5%溶液の� �の結晶の形態、および無水コハク酸処理PLL(P LL無水コハク酸65%)の5%溶液の氷の結晶の形態� ��しらべた。すなわち、一旦-30℃まで急冷し� ��氷結晶を多数作成した後、視野に1つの直径 10μm程度の氷結晶が存在する温度まで0.02℃/mi nで温度を上昇させる。その状態で安定して� �ら今度は0.02℃/minで温度を降下させることで 氷の成長時の形態を観察した。形態は図6の� �微鏡写真に示すように無水コハク酸で処理� �ることにより六方晶を示すことがわかった� �なお、このような六方晶の氷結晶は、無水� �ハク酸処理PLL(PLL(0.50)~PLL(0.84))の濃度が1%~15%� �範囲であるならば見られた。熱ヒステリシ� �とは、融点と氷晶成長開始温度の差のこと� �、不凍タンパク質の特徴として挙げられる� �無水コハク酸処理PLLで最大0.1度の熱ヒステ� �シス効果が得られた。これらのことから、PL Lのアミノ基に対しにカルボキシル基を50モル %以上導入することで不凍タンパク質の活性� �得られることが確認された。

<実施例7 食品の保存>
 凍結濃縮防止(凍結融解寒天ゲル);寒天末(1� �試薬 ナカライテスク(株)社製)にPLL無水コハ ク酸63%を添加して5%溶液を調整し、この溶液� ��赤色インクを添加しプラスチック容器に入� ��-20℃にて凍結した後、常温で解凍した。結� ��を図7の写真に示す。左が無添加のもの、右 がPLL琥珀酸誘導体5%添加のものである。無添� ��のものは赤色の部分(不透明な上半部)と、� �明な部分(ゲルを載せた箇所の右上に影を生� ��させているが、ゲルの下方のペーパータオ� ��のメッシュ模様が透けて見えている部分)と に、明らかに分離しているのが解かる。一方 、PLL琥珀酸誘導体5%添加物は解凍ゲル全体が� ��一に赤色を呈し、凍結濃縮が防止できてい� ��のが知られた。

 凍結乾燥寒天ゲル;寒天末(1級試薬 ナカ� �イテック(株)社製)にPLL無水コハク酸63%(実際� ��ブロック率0.60)を0%、1%、3%添加してプラス� �ック容器に入れ-20℃にて凍結した後、真空� �1torrで2~3日間凍結乾燥を行い、凍結乾燥寒天 を得た。得られた凍結乾燥物を図8の写真に� �す。PLL琥珀酸誘導体の添加量が0%のもの(左)� ��凍結乾燥により体積が1/3程度に収縮してい� ��。しかし、PLL琥珀酸誘導体の添加量が1%の� �の(中)と3%のもの(右)の凍結乾燥物は体積の� �縮があまり生じていない。このことから、� �発明の不凍ポリアミノ酸を含有し凍結乾燥� �ることにより、効率よく、かつ品質を安定� �保ち、被乾燥物を乾燥できた。