ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Bajo la denominación de metales pesados se incluyen una serie de metales y metaloides de la Tabla Periódica de elementos con propiedades metálicas y potencialmente tóxicos.

Entre ellos, Ag, As, Bi, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb, Pd, Pt, Te, Tl, Sb, Se, Sn y Zn son considerados elementos de carácter toxin.

El desarrollo de actividades humanas directas o indirectas está incrementando significativamente los contenidos de metales pesados en los suelos. La contaminación del suelo con metales pesados puede aparecer como resultado de actividades de todo tipo : industriales, agrícolas o de servicios. El vertido incontrolado de residuos, las fugas accidentales de depósitos y tuberas enterradas, la práctica de operaciones industriales sobre suelos mal protegidos, la aplicación de fertilizantes y pesticidas, la incorporación de residuos urbanos e industriales, los riegos con efluentes de bajo nivel de calidad, constituyen el origen de un elevado porcentaje de los suelos contaminados.

Diversas vías de migración de los contaminantes presentes en el suelo (infiltración, escorrentía, etc.), pueden provocar la extensión del problema a otros medios, por ejemplo, aguas subterráneas y superficiales, con el consiguiente riesgo para la salud (humana y animal), la producción agrícola y los ecosistemas.

Por consiguiente, es necesario, por una parte, prevenir la aparición de nuevos focos de contaminación de aguas y suelos con metales pesados y, por otra parte, recuperar las aguas y suelos ya contaminados. Dentro de esta segunda vertiente de actuación, la recuperación de suelos contaminados utilizando un agente biológico [biorrecuperación] es una de las tecnologías más prometedoras.

COMPENDIO DE LA INVENTION La invención se enfrenta con el problema de recuperar un medio, sólido o liquid, contaminado con uno o más metales pesados mediante el empleo de agentes biológicos.

La solución proporcionada por esta invención se basa en que los inventores han observado que mediante el anclaje de proteins o secuencias peptídicas con la capacidad de unir metales pesados sobre la superficie de unas bacterias adaptadas al suelo y resistentes a metales pesados se puede recuperar eficientemente un medio contaminado con metales pesados. E1 Ejemplo 2 ilustra la adsorción de cadmio a partir de un medio líquido por la bacteria Ralstonia eutropha MTB proporcionada por esta invención, mientras que el Ejemplo 3 ilustra la capacidad de dicha bacteria para contrarrestar el efecto tóxico del cadmio en suelo.

Por tanto, un objeto de esta invención lo constituyen unas bacterias adaptadas al suelo y resistentes a metales pesados que contienen en su superficie una protein, o una secuencia peptídica, con la capacidad de unir uno o más

metales pesados. El empleo de dichas bacterias en la recuperación de un medio, sólido o liquid, contaminado con metales pesados constituye un objeto adicional de esta invención.

Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para recuperar un suelo contaminado por metales pesados que comprende poner en contacto dichas bacterias con el suelo a recuperar.

Otro objeto adicional de esta invención lo constituye un método para tratar un efluente cargado con metales pesados, con el fin de reducir el contenido en metales pesados en dicho efluente, que comprende poner en contacto el efluente a tratar con dichas bacterias o, alternativamente, con biomasa no viable procedente de dichas bacterias, muertas, estando dicha biomasa unida a un soporte sólido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la estructura genética de pMT (3-1 y la producción de MT (3 en E, coli. La Figura 1A muestra el esquema del plásmido pMTß-1 que contiene la fusión del gen mtb. Se indican el gen lacl y el promotor lac (plac). También está esbozada la estructura del dominio y la topología básica de la proteína Moto. Se muestran las localizaciones del péptido señal pelB (ss, no presentes en la proteína madura), el dominio MT, el péptido E-tag y el dominio ß de la proteasa IgA de Neisseria gonorrhoeae. La Figura 1B muestra los resultados de la inmunodetección de proteins procedentes de las fracciones solubles, de la membrana interna (MI) y membrana externa (ME) de las células de E. coli JCB570 (wt) y E. coli JCB571 (dsbA) que llevan el pMT (3-1 e inducidas con IPTG. Se usó el anticuerpo monoclonal anti-E-tag para probar la presencia del híbrido MTß-1 (57 kDa) en los extractos de proteins transferidas tras electroforesis SDS-PAGE. La

Figura 1C muestra la presentación de MT) sobre la superficie de E. coli. La accesibilidad de la proteína MT ? en células intactas (I), sometidas a choque osmótico (S) y lisadas (L) se probó utilizando un anticuerpo monoclonal anti-E-tag en un ELISA [véase el Ejemplo 1.5]. El control negativo incluyó las células isogénicas de E. coli desprovistas del plásmido pMTp- 1.

La Figura 2 muestra la acumulación de Cd2+ por E. coli y R. eutropha. La cantidad de Cd2+ unido por las células bacterianas se determinó por espectroscopia de absorción atómica y está indicada en nmoles de Cd2+ por mg de masa celular seca. Los valores mostrados son el promedio de dos experimentos independientes usando muestras duplicadas en cada determinación de Cd. La Figura 2A muestra los resultados de las células de E. coli JCB570 (wt) y E. coli JCB571 (dsbA) transformadas con pMTß-1 (+), o no transformadas (-), inducidas con IPTG en medio MJS que contenía CdCl2 30 zM. La Figura 2B recoge los resultados de la acumulación de Cd2+ por las cepas de R. eutropha. Los cultivos celulares de R. eutropha MTB y su cepa parental R. eutropha CH34 se indujeron con 3-metilbenzoato (3-MB) en medio MJS que contiene CdCl2 30 tM (izquierda) o 300 uM (derecha).

La Figura 3 muestra la estructura del transposón TnMTß-1 y la producción de MT (3 en R. eutropha. En la Figura 3A se indican los elementos genéticos dentro del TnMT, 8-1 : el gen mtb, el gen de resistencia a kanamicina (Km), el gen xylS (que codifica para el activador transcripcional XylS del promotor Pm), el promotor Pm y los extremos I y O del mini- Tn5. La secuencia señal (ss) pelf del gen mtb también aparece señalada. La Figura 3B muestra los resultados de la inmunotransferencia de los extractos de proteins de células enteras de R. eutropha MTB y su cepa control parental (CH34)

ensayadas con el anticuerpo monoclonal anti-E-tag para detectar la presencia de la proteína MTß. E1 inductor del promotor Pm, 3-metil-benzoato (3-MB), se añadió (+) o no (-) al cultivo bacteriano. La Figura 3C muestra los resultados de la inmunodetección de proteins, tras electroforesis SDS-PAGE y transferir, procedentes de las fracciones solubles, de la membrana interna (MI) y membrana externa (ME) de las células de R. eutropha MTB inducidas con 3-MB y ensayadas con el anticuerpo monoclonal anti-E-tag.

La Figura 4 muestra los resultados de la reparación de la toxicidad por Cd2+ sobre el crecimiento de las plantas con R. eutropha MTB. Se hicieron crecer plantas de semillero de 15 días de N. bentamiana durante 40 días en tierra control estéril (1), o en tierra inoculada con 108 células de R. eutropha CH34/g (2), o 108 células de R. eutropha MTB/g (3), crecidas previamente en medio MS que contenía citrato y 3-MB; la tierra control también se mezcló con el mismo medio [Figura 4A]. Figura 4B : se realizó el mismo procedimiento que el descrito para la Figura 4A pero en tierra que contenía 150 ) J. moles de Cd 2+/kg. Se puede observar la toxicidad del Cd (compárense las Figuras 4A y 4B) y el efecto protector de R. eutropha MTB sobre el crecimiento de la planta (compárense las macetas 1 a 3).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona una bacteria con capacidad de unir metales pesados, en adelante bacteria de la invención, caracterizada porque es una bacteria adaptada al suelo y resistente a metales pesados y que contiene en su superficie una protein, o una secuencia peptídica, con la capacidad de unir metales pesados.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión"bacteria adaptada al suelo y resistente a metales pesados"significa que la bacteria puede vivir en el suelo y

que su crecimiento no se ve afectado por la presencia de metales pesados en las concentraciones tóxicas para la mayoría de organismos y otras bacterias, e incluye tanto a bacterias adaptadas al suelo y resistentes, de forma natural, a metales pesados, es decir, cuyo habitat natural es el suelo, como a bacterias adaptadas al suelo que han adquirido la resistencia a metales pesados por técnicas de ingeniería genética, por ejemplo, mediante transformación de una bacteria que naturalmente no es resistente a metales pesados con un sistema capaz de inducir resistencia a metales pesados. La resistencia a los metales pesados es debida principalmente a la presencia de sistemas de bombeo de metales pesados desde el citoplasma al medio externo. Gracias a estos mecanismos el metal pesado no se acumula en el interior de la bacteria. Entre las bacterias adaptadas al suelo y resistentes, de forma natural, a metales pesados se incluyen bacterias pertenecientes a los géneros de gram negativos Ralstonia y Pseudomonas, y Bacillus en gram positivos. En una realización particular, la bacteria de la invención procede de Ralstonia eutropha (anteriormente llamada Alcaligenes eutrophus) CH34, una cepa bacteriana que esta adaptada para desarrollarse en suelos altamente contaminados con iones metálicos.

E1 término"metales pesados"tal como se utiliza en esta descripción incluye una serie de metales y metaloides de la Tabla Periódica de elementos con propiedades metálicas y potencialmente tóxicos. Entre los metales pesados de carácter tóxico se encuentran Ag, As, Bi, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb, Pd, Pt, Te, T1, Sb, Se, Sn y Zn. En general, los metales pesados más significativos son Cd, Co, Cu, Hg, Ni, Pb y Zn.

E1 término Ametal pesado_ incluye a cualquier forma química de dicho metal que puede estar presente en un medio sólido o liquid.

La proteína o secuencia péptidica debe unir al menos un

metal pesado, incluyendo, pero no limitando, a Ag, As, Bi, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb, Pd, Pt, Te, Tl, Sb, Se, Sn y Zn, y sus formas químicas correspondientes. Ejemplos ilustrativos de proteins con capacidad de unir uno o más metales pesados incluyen a las metalotioneínas y a las fitoquelatinas de las plantas. Las metalotioneínas (MT) son un grupo de proteins de pequeño tamaño (aproximadamente 60 aminoácidos) ricas en cisteína, que están especializadas en la unión de metales pesados, por ejemplo, Zn2+, Cd2+, Hg2+ [Nordberg, M., (1998)].

Pueden encontrarse genes que codifican para MT en diferentes especies animales (por ejemplo, en ratón y en humanos), vegetales, y de hongos.

La secuencia de nucleótidos que codifica para dicha proteína o secuencia peptídica con capacidad de unir uno o más metales pesados puede ser obtenida de cualquier fuente disponible, tanto natural como artificial. La secuencia de nucleótidos que codifica para dichas proteins, o secuencia peptídicas, puede ser aislada de su fuente natural mediante el empleo de las enzimas de restricción adecuadas o bien puede ser obtenida por técnicas de ADN recombinante o bien puede ser obtenida por técnicas sintéticas. También puede ser una forma polimérica de una secuencia de ADN que codifique para una proteina o secuencia peptídica con la capacidad de unir uno o más metales pesados, así como una variante en la que se han reemplazado unos codones por otros con el fin de codificar para aminoácidos que aumentan la afinidad de unión de metales pesados y/o para obtener proteins o secuencias peptídicas que tienen afinidad por otros metales pesados distintos a los metales pesados por los que tiene afinidad la proteína o secuencia peptídica nativa.

Adicionalmente, el término"proteína o secuencia peptídica con capacidad de unir uno o más metales pesados" incluye no solo a las formas nativas y sintéticas sino, además, a derivados de las mismas, por ejemplo, productos de fusión de dichas proteína o secuencia peptídica y otra

proteína o péptido que pueden proporcionar distintas funciones, por ejemplo, mejorar la estabilidad y/o actividad del agente bioadsorbente de metales pesados. En la patentes norteamericanas US 5. 824. 512 y US 5. 965.796 se describen unas MT naturales, sintéticas y derivadas de las mismas, así como unas secuencias de unión. a metales, respectivamente, que podrían ser utilizadas en la presente invención. Otras proteins y secuencias de unión a metales que pueden ser utilizadas en la presente invención han sido descritas por Klemba et al. (1995), Brown, (1997), y Bae & Mehra, (1997).

En una realización particular, la proteína con capacidad para unir uno o más metales pesados presente en la superficie de la bacteria es una MT de ratón, concretamente la MT-I de ratón.

La bacteria adaptada al suelo y resistente a metales pesados que sirve de base para el desarrollo de la bacteria de la invención puede ser Gram positiva o Gram negativa.

Cuando es Gram positiva, la proteína o secuencia peptídica con capacidad de unir uno o más metales pesados esta unida sobre el peptidoglicano bien directamente o bien mediante elementos acopladores adecuados, tipo dominios de unión a peptidoglicano como los obtenidos de la proteína A de Staphylococcus aureus [Stahl et al., (1997)]. Cuando la bacteria es Gram negativa, el anclaje de dicha proteína o secuencia peptídica con capacidad de unir uno o más metales pesados sobre la membrana externa puede realizarse mediante un sistema autotransportador o mediante cualquier otro sistema de anclaje a membrana externa, como por ejemplo la maltoporina o el híbrido lpp-ompA [Valls et al., (1998)]. Los sistemas de anclaje deben permitir que la proteína o secuencia peptídica con capacidad de unión de uno o más metales pesados se manifieste sobre la superficie de la bacteria.

Los autotransportadores son una familia muy extendida de

proteins secretadas que se encuentran en bacterias Gram negativas y que son capaces de translocarse a través de la membrana externa sin ninguna maquinaria proteica auxiliar [Henderson et al., (1998)]. Su mecanismo de exportación, ejemplificado por primera vez por la proteasa IgA de Neisseria gonorrhoeae [Pohlner et al., (1987)], implica la producción de un precursor proteico grande que contiene un péptido señal N-terminal que dirige el transporte a través de la membrana interna (MI) en el periplasma. A esto le sigue la inserción en la membrana externa (ME) del dominio C-terminal de la proteína (el colaborador o dominio ß) que, formando un barril 0 anfipático, permite al dominio N pasajero acompañante cruzar la ME [Klauser et al., (1993); Veiga et al., (1999)]. Mediante el uso de esta estrategia de secreción, y un vector mini-transposón para la integración cromosómica estable del ADN [de Lorenzo et al., (1994)] se ha construido una cepa recombinante de R. eutropha dotada de una mayor capacidad de adsorber Cd del medio y que produce una reducción de la toxicidad biológica del metal en suelos contaminados.

Las bacterias proporcionadas por esta invención pueden obtenerse mediante el empleo de técnicas convencionales de ADN recombinante. Para ello, la secuencia que codifica para la proteína o secuencia peptídica con capacidad de unir uno o más metales pesados se clona en un vector de expresión tal como un plásmido. En una realización particular, se clona dicha secuencia codificante para la proteína o secuencia peptídica con capacidad de unir uno o más metales pesados en el vector de expresión de manera que se expresen como un producto de fusión con una proteína de la membrana celular o bien con un sistema de anclaje, tal como un autotransportador. El vector de expresión recombinante así obtenido se introduce, mediante métodos convencionales, en una bacteria adaptada al suelo y resistente a metales

pesados, cuya resistencia a los metales pesados la ha adquirido bien de forma natural o bien mediante manipulación genética, capaz de expresar el producto de la secuencia de ADN codificante para la proteína o secuencia peptídica con capacidad de unir uno o más metales pesados. En una realización particular, se pueden insertar múltiples copias de distintos vectores de expresión proporcionados por esta invención en una única célula bacteriana. Las bacterias transformadas se someten a un proceso de inducción mediante el empleo de los inductores apropiados de manera que expresen dicha proteína o secuencia peptídica con capacidad para unir uno o más metales pesados en la superficie de la bacteria.

Las bacterias de la invención pueden ser utilizadas en la recuperación de un medio, sólido o liquid, contaminado con metales pesados.

La invención proporciona, por tanto, un método para recuperar un suelo contaminado por metales pesados que comprende poner en contacto una cantidad eficaz para recuperar dicho suelo contaminado de, al menos, un cultivo de bacterias proporcionadas por esta invención con el suelo a recuperar. En una realización particular, se aplican entre 105 y 1011 bacterias/g de suelo, preferentemente 108 bacterias/g suelo. Las bacterias de la invención se aplican sobre el suelo a tratar por cualquier método convencional.

Las bacterias pueden ponerse en contacto con el suelo a tratar bien en fase sólida o liquida, por ejemplo, introduciendo o inyectando una suspensión de bacterias de la invención sobre el suelo a tratar, o bien regando el suelo a tratar con una formulación que contiene una suspensión de las bacterias de la invención ; alternativamente, el suelo a tratar se puede mezclar físicamente con las bacterias de la invención. Aunque resulta difícil cuantificar lo que debe entenderse por suelo contaminado con un metal pesado, ya que ello dependerá de numerosos factores, entre los que se encuentra el metal pesado y la forma en que se encuentra, el

método proporcionado por esta invención resulta adecuado para recuperar suelos contaminados con metales pesados que contienen entre 0,1 emoles de metal pesado/kg de suelo y 100 milimoles de metal pesado/kg de suelo.

La invención también proporciona un método para tratar un efluente cargado con metales pesados, con el fin de reducir el contenido en metales pesados en dicho efluente, que comprende poner en contacto una cantidad efectiva de, al menos, un cultivo de bacterias proporcionadas por esta invención con el efluente a tratar. La reducción del contenido en metales pesados en dicho efluente tiene por finalidad alcanzar un nivel de metales pesados contaminantes en el efluente que no sea tóxico para el medio ambiente, con lo que dicho efluente, descargado sustancialmente de metales pesados contaminantes, puede ser vertido de forma controlada.

Con carácter previo a poner en contacto las bacterias de la invención con el efluente a tratar, se analiza el efluente y se determina el pH y la existencia de los nutrientes adecuados para el crecimiento de las bacterias de la invención, de manera que, en caso de que no tenga el pH no los nutrientes necesarios en las cantidades adecuadas para garantizar la viabilidad de las bacterias se tomen las medidas oportunas consistentes, por ejemplo, en la corrección del pH y en suplementar el efluente con los nutrientes necesarios.

En una realización particular del método para tratar un efluente cargado con metales pesados, para reducir su contenido en metales pesados, proporcionado por esta invención, se contempla la posibilidad de utilizar biomasa no viable procedente de bacterias, muertas, proporcionadas por esta invención, estando dicha biomasa unida a un soporte sólido. En este caso, la retirada de metales pesados del efluente comprende (i) matar, por métodos convencionales, por ejemplo, modificando las condiciones de viabilidad de las

bacterias en cuestión, unas bacterias proporcionadas por esta invención, que expresan en su superficie una proteina o secuencia peptídica capaz de unir uno o más metales pesados, para obtener una biomasa no viable capaz de unir uno o muas metales pesados, (ii) unir dicha biomasa a la superficie de un soporte sólido, (iii) poner en contacto dicha superficie que tiene unida a la biomasa, con un efluente que contiene al menos un metal pesado de manera que dicho metal pesado se una a dicha proteína o secuencia peptídica capaz de unir a dicho metal pesado, y (iv) retirar de dicho efluente el soporte que contiene unida a dicha biomasa. La biomasa puede estar unida al soporte sólido bien por una unión covalente o no covalente, por ejemplo, por adsorción, etc. La patente norteamericana US 5.824.512 describe un método para retirar metales pesados de un medio acuoso mediante el empleo de biomasa no viable obtenida a partir de bacterias muertas capaces de unir al menos un metal pesado, estando dicha biomasa unida a un soporte sólido. Las enseñanzas de dicha patente norteamericana se incluyen en esta descripción como referencia.

La invención se ilustra más adelante mediante un ejemplo que muestra la expresión de la MT-I de ratón sobre la superficie celular de R. eutropha CH34, cepa bacteriana Gram negativa adaptada para desarrollarse en suelos altamente contaminados con iones de metales pesados. Para ello, la secuencia de ADN que codifica para la MT-I de ratón se fusionó al dominio P del autotransportador de la proteasa IgA de N. gonorrhoeae, que sitúa la proteína híbrida (Mtß) hacia la membrana bacteriana externa. La translocación, presentación en la superficie bacteriana, y funcionalidad de la proteína quimérica MITA fue inicialmente demostrada en E. coli antes de la transferencia de su gen codificante (mtb) a R. eutropha, observándose que la cepa bacteriana resultante, denominada R. eutropha MTB, tenía una mayor capacidad para

inmovilizar los iones de cadmio (Cd2+) procedentes del medio externo [Ejemplo 2]. Asimismo, la inoculación en suelo contaminado con Cd2+ de R. eutropha MTB disminuyó significativamente los efectos tóxicos del metal pesado sobre el crecimiento de las plantas de tabaco (Nicotiana bentamiana) [Ejemplo 3]. Aunque en el Ejemplo 3 se utiliza un inductor (3-MB) para la expresión de la MT-I de ratón en R. eutropha MTB, debido a que el promotor utilizado en la construcción es un promotor inducible, para su empleo en el tratamiento de suelos es más conveniente utilizar una construcción en la que el promotor del gen que codifica para la proteína o secuencia peptídica con capacidad para unir uno o más metales pesados sea un promotor constitutivo de manera que la expresión de dicha proteína o secuencia peptídica se realice de forma continua y no dependa de la disponibilidad de un inductor. Cualquier promotor constitutivo podría ser utilizado en dichas construcciones.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo del alcance de la misma.

EJEMPLO 1 Producción de MTß en E. coli y en R. eutropha I. Protocolo experimental 1.1 Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento Las cepas bacterianas utilizadas fueron : E. coli JCB570 (MC1000 phoR zihl : : TnlO) [Bardwell et al., (1991)] ; E. coli JCB571 (MC1000 phoR zihl2 : : Tn10 dsbA : : kanl) [Bardwell et al., (1991)] ; E. coli DHS (XF= (F= A (lacZYA-argF) U169 deoR endAl hsdRl7 supE44 thi-l recAl gyrA96 relA1 (+80dlacZ AM15) [Laboratorios Gibco BRL, Bethesda, USA] E. coli CC118 Spir (Aara leu araD Alac X74 galE gall phoA20 thi-1 rpsE rpoB argE (Am) recAl) [de Lorenzo et al., (1994)]; y E. coli S17-1 Xpi-r

(Tpr S2r recA thi pro hsdR M"RP4-2-Tc : : Mu : Km Tn7) [de Lorenzo et al., (1994)]. Ralstonia eutropha (denominada anteriormente Alcaligenes eutrophus) CH34 fue donada por Max Mergeay [Mergeay et al., (1985)].

Salvo que se indique lo contrario, las bacterias se crecieron a 301C en medio LB [Miller et al., (1992)] líquido o en placas de agar LB 1,5% p/v suplementadas con los antibióticos apropiados [Miller et al., (1992)]. Se incluyó glucosa (2% p/v) en el medio de crecimiento para la represión total del promotor lac de pMTß-1 en E. coli. La expresión de MTO se indujo en E. coli (pMT (3-l) por transferencia de células de cultivos en crecimiento exponencial (D0600 nm = 0,5 aproximadamente) a un medio LB fresco sin glucosa y que contenía isopropil-1-tio-P-D-galactósido (IPTG) 0,1 mM, e incubación posterior durante tres horas a 301C. Se utilizó ampicilina y cloranfenicol en unas concentraciones finales de 100 ug/ml y 40 u. g/ml respectivamente.

La producción de MTO en R. eutropha se indujo en cultivos líquidos LB y MJS mediante la adición de 3-metil- benzoato (3-MB) 3 mM y posterior incubación a 301C durante 3 horas.

1.2 Construcciones génicas Las manipulaciones del ADN se realizaron utilizando los métodos estándar [Ausubel et al., (1994)]. El gen MT-I de ratón se amplificó a partir del plasmid pMTP [Valls et al., (1998)] por PCR usando los oligonucleótidos Smtl (SEC. ID.

Nl : 1) y Smt2 (SEC. ID. Ni : 2).

Smtl : 5'-CGGGCCCAGCCGGCCATGGCGGACCCCAACTGCTCCTGC-3', y Smt2 : 5'-GCGGCCCCCGACGCCGCGGCACAGACAGTGCACTTGTC-3' El fragmento de ADN amplificado de 200 pb que contenía el gen MT-I flanqueado por los sitios 5'fjl, fue digerido con SfiI y ligado al fragmento de 5,2 kb obtenido con la

digestión SfiI de pPvHp [Veiga et al., (1999)]. En el plásmido resultante, pMTß-0, los sitios XbaI y HindIII que contenía flanqueando al gen mtb fueron convertidos en sitios NotI en pMTß-1 [véase la Figura 1] por ligación de los acopladores XbaI-NotI y HindIII-NotI. El acoplador XbaI-NotI fue construido por hibridación de los oligonucleótidos : 5'- CTAGGCGGCCGC-3' (SEC. ID. Nl : 3) y 5'-CTAGGCGGCCGC-3' (SEC.

ID. NI : 4). De forma similar, el acoplador HindIII-NotI fue construido por hibridación de los oligonucleótidos : 5'- AGCTGCGGCCGC-3' (SEC. ID. N1 : 5) y 5'-AGCTGCGGCCGC-3' (SEC.

ID. N1 : 6).

Para la construcción de pTnMTß-1, el fragmento de ADN de 1,7 kb que contenía el gen mtb fue aislado por digestión NotI de pMT (3-1 y se ligó en el único sitio Notl de pCNB1 [de Lorenzo et al., (1993)] en la orientación que coloca a mtb bajo el control del promotor Pm [véase la Figura 3].

1.3 Transferencia de TnMT/ ?-JZ a Ralstonia eutropha CH34 El elemento mini-Tn5 TnMTß-1 fue transferido al cromosoma de R. eutropha CH34 por conjugación con E. coli S17-1 kpir transformado con el plasmid pTnMT, li-1 utilizando el protocolo descrito previamente [de Lorenzo et al., (1994)]. La selección de los transconjugantes de R. eutropha CH34 se realizó en placas con medio mínimo M9 [Miller et al., (1992)] que contenían citrato 0,2% p/v y suplementadas con kanamicina (1 mg/ml). Se aislaron varios clones y se buscó el fenotipo sensible a piperacilina (100 ug/ml), que indicaba que se correspondía a acontecimientos auténticos de transposición, más que a la integración del pTnMTß-1 total en el genoma.

1.4 Métodos para determinar las proteins expresadas El fraccionamiento de las células de E. coli y R. eutropha se llevó a cabo utilizando un método basado en la solubilización diferencial de los compartimentos celulares con Triton X-100 1,5%, así como un procedimiento estándar de centrifugación en gradiente de sacarosa [Nikaido, H., (1994)]. La concentración de proteins en las diferentes fracciones se cuantificó mediante el método de Bradford [Ausubel et al. (1994)]. Se separaron cantidades idénticas de proteína de diferentes muestras mediante electroforesis en geles de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico 10% (SDS-PAGE) y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF, Millipore). Para la inmunodetección de la proteína Moto, la membrana PVDF se incubó con el anticuerpo monoclonal anti-E-tag (1 pg/ml ; Pharmacia) en tampón B (PBS; leche desnatada 3% p/v) que contenía Tween 20 0,1% v/v. Como anticuerpo secundario se utilizó un conjugado IgG anti ratón- peroxidasa (0,03 U/ml; Boehringer Mannheim). La membrana se reveló mediante una reacción de quimioluminiscencia [Veiga et al., (1999)] y se expuso a una película de rayos X (X-OMAT; Kodak).

1.5 Ensayo de inmunoabsorción unido a enzima (ELISA) Para determinar el nivel de MT) 3 desplegada sobre la superficie de E. coli, las células inducidas se lavaron en PBS y se resuspendieron hasta una D0600 nm = 1,5 en PBS para obtener la muestra de células intactas. Como alternativa, las células lavadas se resuspendieron a la misma densidad en PBS con sacarosa 20% p/v y EDTA 10 mM para obtener una muestra de células sometidas a choque. Para generar una muestra de células lisadas, se resuspendieron las bacterias (D0600 nm = 1,5) en PBS que contenía EDTA 10 mM y se sonicaron utilizando 6 pulsos de 30 segundos en un aparato Labsonic U (B. Branun).

Todas las muestras, las células intactas, las células

sometidas a choque osmótico o las lisadas (50 jj. l) se adsorbieron a las placas ELISA (Maxisorb, Nunc) durante 1 hora a temperatura ambiente, se bloquearon con tampón B (PBS; con leche desnatada 3% p/v) durante 2 horas y se incubaron durante 1 hora en el tampón B con el anticuerpo monoclonal anti-E-tag (1 ug/ml ; Pharmacia). Las placas se lavaron a continuación 3 veces en PBS y como anticuerpo secundario se usó un conjugado IgG anti ratón-peroxidasa (0,3 U/ml; Boehringer Mannheim). Se desarrollaron los ELISA utilizando o-fenilendiamina (OPD; Sigma) y se determinaron sus valores de D0492 nm.

II. Resultados Producción de MOTO en E. coli Para explotar el potencial de un dominio autotransportador para situar la MT de ratón sobre la superficie de una bacteria Gram negativa, se ha construido una fusión génica denominada mtb y expresada en E. coli. Esta fusión codifica para una proteína modular (MTß) constituida por el péptido señal pelB ensamblado en fase con la MT de ratón (7 kDa aproximadamente) y el dominio ß (50 kDa aproximadamente) de la proteasa IgA de N. gonorrhoeae.

Adicionalmente, a la proteína MT (3 se le añadió un epítopo peptídico corto (E-tag) para permitir su inmunodetección mediante el anticuerpo monoclonal anti-E-tag. El plásmido pMTß-1 (Figura 1A) lleva la fusión del gen mtb bajo el control del promotor lac de E. coli.

En primer lugar, se trató la localización subcelular del híbrido Moto. Asimismo, también se investigó la influencia de DsbA, el principal catalizador periplasmático formador de puentes disulfuro [Bardwell, (1994)]. Esto es debido a que en estudios previos, se ha establecido que la oxidación de los residuos de cisteína en el periplasma puede evitar la

exposición de las proteins pasajeras que contienen cisteinas fusionadas al dominio P [Jose et al., (1996)]. Para ello, la cepa mutante dsbA de E. coli JCB571 [Bardwell et al., (1991)] y su cepa isogénica de tipo silvestre E. coli JCB570 se transformaron con el plásmido pMTp-1 y se indujo la expresión de mtb por la adición de IPTG. Después de la inducción, se recogieron las células de E. coli y las proteins de las fracciones solubles, MI y ME se analizaron por SDS-PAGE, se transfirieron y se ensayaron con el anticuerpo monoclonal anti-E-tag. Tal como se observa en la Figura 1B, se localizó una proteína principal del tamaño esperado para MTO (57 kDa aproximadamente) en la fracción ME de las células de E. coli de tipo silvestre y dsbA (pMTß-1). Es interesante señalar que la presencia o ausencia de DbsA no supuso una diferencia significativa en la estabilidad de MT) o en su direccionamiento hacia la ME.

Para valorar si el resto MT del híbrido MOTO estaba expuesto al medio externo, se llevó a cabo un ELISA con células de E. coli intactas, utilizando el anticuerpo monoclonal anti-E-tag para detectar la presencia del híbrido MOTO sobre su superficie. Asimismo, células de E. coli sometidas a choque osmótico y lisadas que producen MOTO se adsorbieron sobre las placas ELISA como controles positivos para inmunodetección, mientras que las células no transformadas se usaron como controles negativos. Los valores de D0492 nm obtenidos con las células intactas frente a aquellos obtenidos con las células lisadas son una medida de la cantidad del resto MT translocado hacia el lado externo de la ME por el dominio ß de la IgA. Utilizando este método, se observó el reconocimiento específico del anticuerpo monoclonal anti-E-tag frente a las células intactas de E. coli que producen MT (Figura 1C), lo que indica que el resto

MT estaba expuesto al medio externo. Siguiendo este criterio, las células de E. coli de tipo silvestre translocaron en su totalidad aproximadamente el 20% de los restos de MT de las fusiones MTO hacia el medio externo. El nivel del resto de MT desplegado sobre la superficie celular fue 3 veces superior (60% aproximadamente) en la cepa mutante de E. coli dsbA (Figura 1C), una característica que parece estar relacionada con el mecanismo de secreción de los autotransportadores [Veiga et al., (1999)].

Con el fin de determinar si la expresión de MTO aumentaba la capacidad de las células de E. coli para adsorber los metales pesados in vivo, se hicieron crecer cultivos de E. coli JCB750 y E. coli JCB571, transformados con pMTß-1, en presencia de CdCl2 30 1M. A continuación, las bacterias se recogieron y se midió el contenido de Cd2+ acumulado por la biomasa mediante espectrometría de adsorción atómica. Tal como puede verse en la Figura 2A, la producción de MTO aumentó el contenido de Cd2+ de las células de E. coli en 10 veces, lo que indica que el. resto MT de MOTO retuvo su capacidad de unión a los metales. La producción de MTO en un hospedador mutante E. coli dsbA (Figura 2A) no aumentó adicionalmente esta acumulación de metales, a pesar del aumento de translocación superficial del dominio MT.

Producción de MTß en Ralstonia eutropha CH34 Las limitaciones de E. coli para sobrevivir en ambientes contaminados con metales pesados indujo a introducir el gen mtb en la cepa R. eutropha CH34 tolerante a los metales [Mergeay, M. (1985); Tibazarwa et al., (2000)]. Para ello, el gen mtb se colocó en un transposón mini-Tn5 (Kmr) en dirección del promotor Pm del plasmid pWWO de Pseudomonas putida, junto con el gen que codifica para su activador transcripcional xyls [Ramos et al., (1997)]. El plásmido

obtenido, pTnMT/-J, posibilita la integración estable del mini-transposón TnMTß-1 en el cromosoma de una amplia variedad de bacterias Gram negativas y permite la inducción de la expresión de mtb por adición de 3-metil-benzoato (3-MB) en el medio de crecimiento (Figura 3A).

Se insertó el mini-transposón TnMTß-1 en el cromosoma de R. eutropha CH34 y la producción de MTO se ensayó por inmunotransferencia después de la inducción con 3-MB. Tal como se puede observar en la Figura 3B, la producción de MTB era estrictamente dependiente de la presencia de 3-MB en el medio de crecimiento, lo que demuestra el estricto control del promotor Pm en R. eutropha CH34. La cepa bacteriana de R. eutropha CH34 que lleva el mini-transposón TnMTß-1 integrado de manera estable en su cromosoma ha sido denominada R. eutropha MTB y ha sido depositada en la CECT con el número de depósito CECT5323. De manera similar al caso de E. coli, el híbrido MT se localizó enteramente en la fracción ME de R. eutropha MTB (Figura 3C), lo que demuestra que la proteína híbrida había sido correctamente dirigida a la ME por el dominio autotransportador. Asimismo, la fusión MTp se produjo como una banda de polipéptido individual, sin indicación de inestabilidad o degradación proteolítica.

EJEMPLO 2 Adsorción de Cd2+ a partir del medio por R. eutropha MTB Para investigar si la expresión de MT (3 aumentaba la capacidad de las células de R. eutropha para adsorber metales pesados, se hicieron crecer cultivos de R. eutropha MTB y su cepa parental control (R. eutropha CH34) en presencia de CdCl2. Para estos ensayos, se utilizaron concentraciones bajas y altas de metal pesado. En primer lugar, se usó CdCl2 30 uM para comparar el comportamiento de R. eutropha MTB con

el de E. coli que expresa MTß. Además, se investigó la adsorción del metal de las células de R. eutropha MTB después del crecimiento en presencia de CdCl2 300 I1M, una concentración que es inhibitoria del crecimiento de muchas otras bacterias tales como E. coli.

Para ello, se hicieron crecer las células de E. coli y R. eutropha, que contienen el gen mtb o sus correspondientes controles, en medio LB a 301C hasta una D0600 nm de 0,3 aproximadamente. A continuación, se recogieron las células y se resuspendieron en medio de fosfato mínimo MJS [HEPES 12,5 mM (pH 7,1), con NaCl 50 mM, NH4Cl 20 mM, KC1 1 mM, MgCl 2 mM, MnCl 2 0, 05 mM, casaminoácidos 0,8% p/v (Gibco BRL), glicerol 4% v/v y tiamina 0,005% p/v] suplementado con la concentración apropiada de CdCl2 e inductor (IPTG o 3-MB) y se incubaron adicionalmente hasta una D0600 nm de 1,5 aproximadamente. A continuación, las células se recogieron, se lavaron con NaCl 0,8% en HEPES 5 mM (pH 7,1) y se secaron durante 20 horas a 651C. El material seco se digirió durante la noche con ácido nítrico 70% y se midieron las concentraciones de Cd2+ de la solución resultante con un espectrofotómetro Hitachi Z-2800 [Romeyer et al., (1988)].

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 2B, en donde la medición del contenido de Cd2+ reveló que R. eutropha MTB aumentaba en 3 veces la ya significativa capacidad natural de adsorción de metales pesados de R. eutropha CH34 [Diels et al., (1995); Diels et al. (1999)]. Este aumento relativo de 3 veces en la acumulación de Cd2+ de la cepa MTB recombinante, se produjo en presencia tanto de CdCl2 30 uM como de 300 uM, aunque los niveles de adsorción absoluta variaban en cada caso proporcionalmente a los niveles basales. El nivel de adsorción medio obtenido por R. eutropha MTB fue de 42 nmol de Cd 2+/mg de células secas (Figura 2B) cuando crecía en presencia de CdCl2 300 uM. Este fenómeno se

produjo sin ninguna variación significativa en la velocidad de crecimiento de los cultivos de Ralstonia (no mostrada) lo que indica que ni la producción dela proteína híbrida MTß ni el aumento en la adsorción de metales tuvo efectos apreciables sobre la bacteria.

EJEMPLO 3 Recuperación del suelo de la toxicidad por Cd2+ Para determinar la capacidad de R. eutropha MTB para contrarrestar el efecto tóxico del Cd en el suelo, se estableció un ensayo biológico en el cual la inmovilización de los metales pesados en una forma no bioactiva estaba reflejada por un efecto positivo sobre el crecimiento de la planta.

Para la inoculación del suelo con R. eutropha, se hicieron crecer los cultivos bacterianos a 301C en medio líquido de Murashige y Skoog (MS) (Sigma) que contiene tampón MES 1,25 mM pH 5,8 y citrato 0, 1% p/v como fuente de carbono.

Los cultivos crecidos durante la noche se diluyeron 1 : 10 en el mismo medio, suplementado con CdCl2 300, uM en caso necesario y se indujeron con 3-MB 100, uM. Los cultivos se hicieron crecer adicionalmente durante 18 horas a 301C.

Para el crecimiento de las plantas, se usó tierra de turba estándar (Gebr. Brill Substrate GmbH), esterilizada en el autoclave y que contenía 1/3 de vermiculita. La tierra se mezcló 1 : 1 (v/p) con cultivos inducidos de R. eutropha (108 bacterias/g) [R. eutropha MTB y R. eutropha CH34], o con un medio MS estéril que contenía el inductor, suplementado con CdCl2 300 uM, si así se requería. La concentración final del metal en la tierra fue de 150 emoles de Cd/kg. El suelo tratado se distribuyó en macetas (400 g/maceta) y a continuación se transfirieron a plantas de semillero de 15 días de Nicotiana bentamiana. Se hicieron crecer las plantas

en un invernadero y se regaron dos veces a la semana con 0,1 x medio MS, MES 0,12 mM pH 5,8, citrato 0,01% (p/v).

La toxicidad del cadmio se ensayó inicialmente en plantas de N. bentamiana crecidas en suelos que presentaban un aumento creciente del contenido de CdCl2 (no mostrado).

Estos experimentos revelaron que 150 umoles de la sal Cd/kg de suelo disminuyeron considerablemente el crecimiento de la planta y provocaban una clorosis severa, dos rasgos típicos de la toxicidad con Cd2+ [Ouzounidou et al., (1997)]. Este contenido de metal se usó para otros experimentos ya que todavía permitia un crecimiento lento de la planta.

Para investigar el efecto de las diferentes cepas de R. eutropha sobre el crecimiento de la planta, se transfirieron las plantas de semillero de N. bentamiana a suelos stériles estándar o contaminados con cadmio, inoculados por separado con 108 bacterias/g de R. eutropha MTB inducida, la cepa CH34 o una solución salina estéril que contenía el inductor.

Después de 40 días de crecimiento en un invernadero, se observó una reducción de los efectos tóxicos del metal pesado en las plantas en presencia de R. eutropha MTB en el suelo (Figura 4B). Los experimentos control en suelos a los que no se les había añadido Cd2+ indicaron que la presencia de bacterias no alteraba el crecimiento de la planta (Figura 4A). Además, se observó un efecto significativamente protector de la cepa de tipo silvestre R. eutropha CH34.

Probablemente, esto se debió a la capacidad inherente de acumulación de metales pesados de la cepa CH34 [Diels et al., (1995); Diels et al., (1999) ; Van Roy et al., (1997)]. Estas observaciones fueron cuantificadas y confirmadas midiendo la biomasa de las plantas y el contenido de clorofila de las hojas, para lo cual se homogeneizaron las hojas en acetona : agua (9 : 1) y se determinó la D0600 nm. El coeficiente de extinción usado para la clorofila fue 34,5. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1. Tomados en su conjunto,

estos datos indican que la producción de MOTO sobre la superficie celular de R. eutropha MTB aumentó la capacidad ya existente de inmovilización de metales pesados de esta cepa bacteriana, a lo que siguió un mayor efecto protector sobre el crecimiento de N. bentamiana en suelos contaminados.

Tabla 1 Efecto del CdCl2 y de R. eutropha sobre el crecimiento de N. bentamiana Tratamiento del suelo Biomasa planta (g) Clorofila (mg/g) Bacteria Cd Ninguno Sí 0,53 + 0,36 0,40 + 0, 25 R. eutropha CH34 Sí 1,29 + 0,39 0,81 + 0, 31 R. eutropha MTB Sí 2,37 + 0,37 1,41 + 0,25 Ninguno No 17,65 + 2,05 2,22 + 0, 10 R. eutropha CH34 No 15,52 + 1, 69 2,50 + 0,08 R. eutropha MTB No 14,55 + 2,37 2,38 + 0, 05 En la Tabla 1 se recogen los valores medios de 4 experimentos independientes en el dia 55 posterior a la germinación de la planta. La biomasa indica el peso húmedo de la parte aérea de la planta, en gramos. El contenido en clorofila se indica como mg de pigmento por g de planta (peso húmedo). En donde se especifica, el suelo fue inoculado con 108 bacterias/g y suplementado o no con 150 moles de CdCl2/kg.

Discusión El aumento del potencial de acumulación de metales pesados de las bacterias que residen en sitios contaminados o en los residuos, es una estrategia atractiva para contrarrestar el efecto tóxico de los iones presentes en bajas concentraciones y que no se pueden controlar con

tratamientos fisico-quimicos [Gadd et al., (1993)]. Esto es especialmente atractivo para la contaminación residual a largo plazo que permanece después de la limpieza mecánica del suelo afectado por los vertidos de residuos mineros [Grimalt et al., (1999); Summers, A. O., (1992)]. En los ejemplos descritos previamente se han combinado dos sistemas que se han desarrollado independientemente para manejar los metales pesados con el fin de obtener un eficaz bioabsorbente de metales pesados para aplicaciones in situ. Se produjo MT de ratón, una proteína quelante de metales, sobre la superficie celular de R. eutropha CH34, una cepa Gram negativa que reside en el suelo y que esta adaptada a ambientes contaminados con metales pesados [Mergeay, M. (1985); Tibazarwa et al., (2000); Diels et al. (1995)]. Aunque las metalotioneínas (MT) se han expresado de varias formas en E. coli [Sousa et al., (1998); Valls et al., (1998); Romeyer et al. (1988); Shi et al. (1992); Jacobs et al., (1989)], los ejemplos previamente descritos constituyen el primer intento exitoso de transferencia de MT de animales en especies bacterianas que residen de forma natural en suelos contaminados con metales pesados, y de validación de su eficacia para disminuir la toxicidad del metal in situ.

El despliegue superficial de polipéptidos en bacterias ha suscitado mucho interés en relación con su potencial para el desarrollo de vacunas vivas, biodegradación de compuestos tóxicos o bioabsorción de metales pesados [Ståhl et al., (1997); Georgiou et al., (1997); Richins et al., (1997)]. En este contexto, la producción de MT sobre la superficie celular de R. eutropha, en vez de intracelularmente, constituye un camino muy eficaz para aumentar la capacidad de unión a metales pesados de esta cepa bacteriana sin inducir alteraciones en su fisiología. E1 hecho de que los mecanismos de resistencia, conocidos para varios metales en R. eutropha CH34, implican el eflujo activo de iones de metal pesado,

desde el citoplasma hasta el medio extracelular [Tibazarwa et al., (2000); Diels et al. (1995); Nies et al., (1989); Mergeay, M., (1991)], provoca que estas células pueden resultar excelentes agentes destoxificantes cuando están dotadas de propiedades superiores de adsorción de metales pesados sobre la superficie celular.

Se utilizó el sistema autotransportador de la proteasa IgA de N. gonorrhoeae para la presentación de MT-I de ratón, ya que este no requiere una maquinaria especial (distinta de la ruta reguladora sec) para la secreción de las fusiones N terminales heterólogas [Klauser et al., (1990)]. El dominio de la proteasa IgA dirigió muy eficazmente el híbrido MTB a la ME de E. coli, independientemente de la presencia de DsbA (Figura 1B). Sin embargo, el nivel del resto MT translocado a la superficie celular se redujo en tres veces en las cepas DsbA+ (Figura 1C). Se ha informado que los puentes disulfuro intramoleculares dentro del dominio N- pasajero de los autotransportadores disminuye su translocación a través de la ME [Veiga et al., (1999) ; Klauser et al., (1992)]. Ya que la MT-I de ratón es una proteína de 61 aminoácidos que contiene 20 residuos de cisteína esparcidos a través de su secuencia [Romero-Isart et al., (1999)], es posible que DsbA catalice fortuitamente la formación de puentes disulfuro intra/intermoleculares durante el paso del módulo MT a través del periplasma, disminuyendo así la eficacia global del proceso de translocación mediado por el autotransportador ß.

La evidencia de un resto MT funcional de MT se obtuvo inicialmente por la unión de metales pesados de las células de E. coli que producen MTß sobre su superficie. Estas células unieron una cantidad de iones Cd2+ 10 veces mayor que las células control (Figura 2A). Es interesante señalar que las células de E. coli (pMTß-1) que tienen una enzima DsbA

activa, unieron una cantidad idéntica de iones Cd2+ que sus células mutantes isogénicas dsbA. Este resultado sugiere que el módulo MT podría unir metales pesados con eficacia similar tanto cuando se localiza en el lado periplasmático de la ME como cuando se transloca a la superficie celular.

El gen mtb se insertó posteriormente en el cromosoma de R. eutropha CH34 y su expresión se indujo por la adición de 3-MB (Figura 3). De forma similar a E. coli, las células de R. eutropha MTB inducidas produjeron la proteína MTO y la dirigieron hacia la ME. La producción de la proteína MT ? produjo un aumento de 3 veces la capacidad intrínseca de células de R. eutropha CH34 para unir metales pesados (Figura 2B). Se determinó una acumulación de 42 nmoles de átomos de Cd/mg de peso seco bacteriano, que corresponde a un total de aproximadamente 13 emoles de átomos de Cd adsorbidos/litro, en células de R. eutropha MTB crecidas en presencia de CdCl2 300 uM. Aunque la bioacumulación en este ensayo in vitro es una de las más altas observadas hasta el momento, la cantidad de Cd eliminada representa sólo aproximadamente el 5% del metal total presente en el medio de cultivo. Sin embargo, los experimentos de reparación de la toxicidad debida al Cd (Figura 4), sugieren que la inmovilización de los iones de Cd en una forma biológicamente inactiva, podría ser mucho más elevada en el suelo que in vitro. Un resultado sorprendente de estos experimentos fue que R. eutropha MTB tenía un efecto protector mucho más elevado sobre el crecimiento de N. bentamiana que su cepa parental (Figura 4).

La presencia de la cepa MTB manipulada en suelos contaminados con Cd aumentó en 4 veces la producción de biomasa y el contenido de clorofila de las plantas de N. bentamiana (Tabla 1). La morfología macroscópica y el tamaño de las plantas crecidas en suelos que contienen R. eutropha MTB y 150 moles de Cd/kg fue comparable a los de las plantas crecidas sin

bacterias con 40 emoles de Cd/kg (no mostrados). Así, estos ensayos in situ implican una inmovilización de aproximadamente el 70% del metal accesible a las plantas en el suelo. E1 mecanismo responsable de la diferencia en los valores de la adsorción de metales in itro y en el suelo todavía no está claro.

Un cálculo del número de proteins MTO producidas por la célula R. eutropha MTB sugirió que la inmovilización de Cd era un fenómeno más complejo que la simple unión del metal a la MT. La comparación de las señales obtenidas en inmunotransferencias con el anticuerpo monoclonal anti-E-tag, utilizando extractos de células enteras de R. eutropha MTB y una protein E marcada de concentración conocida, dio una estimación de un máximo de 15.000 moléculas de MTß/célula (datos no mostrados). Ya que cada módulo MT puede unir 7 iones metálicos divalentes, el número predicho de esferas de coordinación disponibles es de aproximadamente 105/célula. A partir de los valores obtenidos en los experimentos de unión de Cd mostrados en la Figura 2B, se puede inferir que el contenido de cadmio es de aproximadamente 1,5 x 106 átomos de Cd/célula. Por tanto, el número real de iones de Cd2+ unidos a la superficie de R. eutropha MTB excede en al menos 10 veces las predicciones de un aumento de la acumulación basada sólo en el aumento del número de centros de unión del metal sobre la superficie celular. También se ha informado de conclusiones similares para otros esquemas artificiales de unión a metales [Sousa et al., (1998); Sousa et al., (1996)].

Estos resultados sugieren que los canales de fusión MT (3 de iones metálicos están dirigidos hacia otras estructuras celulares que no pueden interactuar con los metales en solución. Dicho efecto embudo produce la multiplicación de la capacidad nativa de las bacterias para acumular iones metálicos en vez de la simple adición de esferas de coordinación sobre la superficie celular. Sin embargo, esto

todavía parece insuficiente para explicar la gran reducción de la toxicidad metálica en el suelo.

Además de la afinidad intrínseca de la MT por iones divalentes, la reactividad global de la cepa R. eutropha CH34 (la cual precipita de forma natural los metales pesados sobre la superficie bacteriana) [Diels et al., (1995); Diels et al., (1999); Van Roy et al., (1997); Gilis et al., (1998)] y el proceso físico-químico que la acompaña, podría contribuir sinérgicamente al resultado final de la inmovilización del metal en el suelo. Por consiguiente, la diferencia observada entre los ensayos in vitro e in situ podría explicarse si las moléculas MT presentes sobre la superficie de las bacterias manipuladas no sólo coordinan los iones metálicos, sino que también catalizan un proceso de precipitación abiótica de fosfatos y carbonatos metálicos [Gilis et al., (1998)].

Concluyendo, estos resultados apoyan el potencial biotecnológico de las MT expresadas en R. eutropha y, además, proporciona la evidencia directa de que el uso de bacterias resistentes a metales pesados, como hospedadores para el despliegue superficial de proteins de unión a iones de alta afinidad, es un método prometedor para la generación de correcciones biológicas en los suelos contaminados con esta clase de contaminantes, difíciles de erradicar.

DEPOSIT DE MICROORGANISMOS Un cultivo de la cepa Ralstonia eutropha MTB ha sido depositado en la Colección Española de Cultivos Tipos [CECT], con sede en Burjasot (Valencia), el dia 23 de Mayo de 2000, correspondiéndole el número de depósito CECT5323.

BIBLIOGRAFÍA Ausubel et al., (1994). Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York).

Bae, W. & Mehra, R. K. (1997). Metal-binding characteristics of a phytochelatin analog (Glu-Cys)-2Gly.

Journal of Inorganic Biochemistry 68,201-210 (1997).

Bardwell et al., (1991). Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo. Cell 67,581- 589.

Bardwell, J. C. A. (1994). Building bridges : disulfide bond formation in the cell. Mol. Microbiol. 14,199-205.

Brown, S. (1997). Metal-recognition by repeating polypeptides. Nat. Biotechnol. 15,269-272. de Lorenzo et al., (1993). Engineering of alkyl-and haloaromatic-responsive gene expression with minitransposons containing regulated promoters of biodegradative pathways of Pseudomonas. Gene 130, 41-46. de Lorenzo et al., (1994). Analysis and construction of stable phenotypes in Gram-negative bacteria with Tn5-and TnlO-derived minitransposons. Methods Enzymol. 235,386-405.

Diels et al., (1995). The czc operon of Alcaligenes eutrophus CH34 : from resistance mechanisms to the removal of heavy metals. Journal of Industrial Microbiology 14,142-153.

Diels et al., (1999). Heavy metals bioremediation of soil. Mol. Biotechnol. 12, 149-158.

Gadd et al., (1993). Microbial treatment of metal pollution--a working biotechnology ?. Trends Biotechnol. 11, 353-359.

Georgiou et al., (1997). Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms : From the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines.

Nature Biotechnology 15,29-34.

Gilis et al., (1998). Effect of the siderophore alcaligin E on the bioavailability of Cd to Alcaligenes

eutrophus CH34. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 20,61-68.

Grimalt et al., (1999). The mine tailing accident in Aznalcollar. The Science of the Total Environment 242,3-11.

Henderson et al., (1998). The great escape : structure and function of the autotransporter proteins. Trends Microbiol. 6,370-378.

Jacobs et al., (1989). Human metallothionein-II is synthesized as a stable membrane-localized fusion protein in Escherichia coli. Gene 83,95-103.

Jose et al., (1996). Absence of periplasmic DsbA oxidoreductase facilitates export of cysteine-containing passenger proteins to the Escherichia coli cell surface via the Igap autotransporter pathway. Gene 178,107-110.

Klauser et al., (1990). Extracellular transport of cholera toxin B subunit using Neisseria IgA protease- domain : conformation-dependent outer membrane translocation.

EMBO J. 9,1991-1999.

Klauser et al., (1992). Selective extracellular release of cholera toxin B subunit by Escherichia coli : dissection of Neisseria Igap-mediated outer membrane transport. EMBO J. 11, 2327-2335.

Klauser et al., (1993). The essential unit for outer membrane targeting and extracellular protein secretion. J.

Mol. Biol. 234,579-593 (1993).

Klemba et al., (1995). Novel metal-binding proteins by design. Nat. Struct. Biol. 2, 368-373.

Mergeay et al., (1985). Alcaligenes eutrophus CH34 is a facultative chemolitotroph with plasmid-bound resistance to heavy metals. J. Bacteriol. 162,328-334.

Mergeay, M. (1991). Towards an understanding of the genetics of bacterial metal resistance. Trends Biotechnol. 9, 17-24.

Miller et al., (1992). A short course in bacterial

genetics : a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Nies, et al., (1989). Plasmid-determined inducible efflux is responsible for resistance to cadmium, zinc, and cobalt in Alcaligenes eutrophus. J. Bacteriol. 171,896-900.

Nikaido, H. (1994). Isolation of outer membranes.

Methods Enzymol. 235,225-234.

Nordberg, M. (1998). Metallothioneins : Historical review and state of knowledge. Talanta 46,243-254.

Ouzounidou et al., (1997). Physiological and ultrastructural effects of cadmium on Wheat (Triticum aestivum L.) leaves. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 32,154- 160.

Pohlner et al., (1987). Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoea IgA protease. Nature 325, 458-462.

Ramos et al., (1997). Transcriptional control of the Pseudomonas TOL plasmid catabolic operons is achieved through an interplay of host factors and plasmid-encoded regulators.

Ann. Rev. Microbiol. 51, 341-373.

Richins et al., (1997). Biodegradation or organophosphorus pesticides by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nature Biotechnology 15,984-987.

Romero-Isart et al., (1999). Replacement of terminal cysteine with histidine in metallothionein alfa and beta domains maintains its binding capacity. Eur. J. Biochem. 259, 519-527.

Romeyer et al., (1988). Bioaccumulation of heavy metals in Escherichia coli expressing an inducible synthetic human metallothionein gene. J. Biotechnol. 8,207-220.

Shi et al., (1992). Cyanobacterial metallothionein gene expressed in Escherichia coli. Metal-binding properties of the expressed protein. FEBS Lett. 303,159-163.

Sousa et al., (1996). Enhanced metalloadsorption of bacterial cells displaying poly-His peptides. Nature Biotechnology 14,1017-1020.

Sousa et al., (1998). Metalloadsorption by Escherichia coli cells displaying yeast and mammalian metallothioneins anchored to the outer membrane protein LamB. J. Bacteriol.

180,2280-2284.

Stahl et al., (1997). Bacterial surface display : trends and progress. Trends in Biotechnology 15,185-192 (1997).

Summers A. O., (1992). The hard stuff : metals in biorremediation. Cur. Opin. Biotechnol. 3,271-276.

Tibazarwa et al., (2000). Regulation of the cnr cobalt and nickel resistance determinant of Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) CH34. J. Bacteriol. 182,1399-1409.

Valls et al., (1998). Bioaccumulation of heavy metals with proteins fusions of metallothionein to bacterial OMPs.

Biochemie 80,855-861.

Van Roy et al., (1997). The use of Alcaligenes eutrophus biofilm in a membrane bioreactor for heavy metal recovery.

Res. Microbiol. 148,526-528.

Veiga et al., (1999). Probing secretion and translocation of a beta-autotransporter using a reporter single-chain Fv as a cognate passenger domain. Mol.

Microbiol. 33,1232-1243.