CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se ao campo da oncologia e da biotecnologia. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a formulações lipossomais compreendendo enzimas com atividade asparaginase ligadas covalentemente às extremidades de moléculas de polietileno glicol expostas na superfície de lipossomos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] A leucemia linfoblástica aguda é o câncer infantil mais frequente e afeta de três a cinco crianças a cada 100 mil. E uma doença progressiva, que necessita de urgência no tratamento, cujo objetivo é destruir o maior número de células afetadas. Com isso, a medula óssea recupera sua produção de células normais.

[0003] A enzima asparaginase é o principal medicamento para tratar a leucemia linfoblástica aguda, sendo considerada a "peça-chave" nas primeiras quatro semanas de tratamento. Pode também ser utilizada para tratar leucemia mieloide aguda (AML) em crianças e linfomas não Hodgkin (NHL) em crianças e adultos. Esta enzima catalisa a conversão da asparagina em ácido aspártico e amónio depletando-a da corrente sanguínea quando administrada. Sendo as células tumorais destes tipos de câncer deficientes em asparagina sintetase, necessitam de suprimento externo deste aminoácido e, como não o conseguem exogenamente, acabam por morrer.

[0004] Todos os medicamentos presentes no mercado são formulados a partir de asparaginase de origem bacteriana, obtida a partir de Escherichia coli e de Erwinia chrisanthemi. Esta última é empregada alternativamente à enzima de E. coli devido às diferenças nas especificidades imunológicas, para minimizar os efeitos colaterais em pacientes hipersensíveis. Entretanto, enzimas bacterianas provocam sérias reações imunológicas, assim como a característica de o paciente desenvolver sensibilidade ao medicamento. Apesar de seu efeito terapêutico, os medicamentos à base de asparaginase bacteriana provocam reações adversas como anafilaxia, trombose, hemorragia, hepatoxicidade, nefrotoxicidade, entre outras. Em alguns casos, estes efeitos são tão severos que impossibilitam o uso prolongado do medicamento, tendo sido observados, até, casos de óbito durante o tratamento (Míiller e Boos, 1998).

[0005] A asparaginase II da levedura Saccharomyces cerevisiae, codificada pelo gene ASP3, sendo originada de um eucarioto, apresentaria potencial imunogênico inferior ao das enzimas bacterianas. Adicionalmente, essa enzima apresenta potencial para uso terapêutico devido a sua elevada estabilidade e pH e temperatura ótimos próximos às condições fisiológicas.

[0006] No pedido de patente PI0406168-3, o gene ASP3 de S. cerevisiae foi clonado com sucesso na levedura metilotrófica Pichia pastoris. Um estudo preliminar de citotoxicidade in vitro contra células de leucemia mieloide crónica confirmou a atividade antileucêmica da asparaginase II de S. cerevisiae expressa em P. pastoris (Girão et al., 2016).

[0007] Outro fator considerado limitante ao uso terapêutico da asparaginase bacteriana é a curta meia-vida da enzima no sangue, que é em tomo de 30 horas para a de E. coli e de 17 horas para a de E. chrisanthemi. Essa curta meia-vida faz com que aplicações sucessivas sejam necessárias.

[0008] No sentido de melhorar as propriedades farmacológicas e imunológicas da asparaginase, uma formulação modificando a asparaginase com polietileno glicol (PEG), na qual unidades de monometoxi PEG são ligadas covalentemente à enzima, foi aprovada pela Food and Drug Administration (FDA) em 1994, estando sob o nome comercial de Oncaspar. Esta modificação aumenta a meia-vida da asparaginase no sangue para seis dias, além de reduzir significativamente os efeitos imunogênicos (Graham, 2003). Seu custo (por unidade enzimática), entretanto, é cerca de 60 vezes mais alto em relação à preparação convencional da enzima.

[0009] Altemativamente, formulações lipossomais podem ser usadas para aumentar a meia- vida plasmática de enzimas e diminuir os efeitos adversos associados à sua administração. Corvo et al., 2015 construíram formulações lipossomais pela ligação da enzima superóxido dismutase à superfície de lipossomos.

[00010] As vantagens da invenção serão evidentes na descrição da invenção fornecida neste documento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00011] A presente invenção tem por objetivo prover uma formulação lipossomal que solucione os principais problemas do estado da técnica listados anteriormente.

[00012] Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma formulação lipossomal, aqui também denominada enzimossomo, compreendendo a enzima com atividade asparaginase ligadas às extremidades de moléculas de polietileno glicol expostas na superfície de lipossomos.

[00013] Em um segundo aspecto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo a formulação lipossomal como acima definida.

[00014] Em um terceiro aspecto, a presente invenção provê o uso da formulação lipossomal como acima definida na preparação de um medicamento para tratamento de câncer.

[00015] Em um quarto aspecto, a presente invenção provê um método para tratamento de câncer, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação lipossomal como acima definida a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[00016] Em um quinto aspecto, a presente invenção provê um processo para preparação da formulação lipossomal como acima definida compreendendo as etapas de:

• introdução de grupos reativos na enzima com atividade asparaginase por ligação a cadeia lateral das lisinas expostas a superfície da asparaginase, deixando as extremidades tioladas;

• ativação da enzima com atividade asparaginase tiolada; e

• ligação da enzima com atividade asparaginase ativada ao lipossomo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00017] A Figura 1 mostra o perfil obtido na purificação da ASP-ATA por cromatografia de exclusão molecular em uma coluna ECONO 10DG utilizando tampão citrato de sódio 10 mM + NaCl 140 mM, pH 6.

[00018] A Figura 2 mostra o perfil cromatográfico em Sephadex G-200 da Asparaginase- AT+lipossomos. A linha em vermelho representa a detecção de lipídeos mensurada pela turbidez a 450 nm e a verde a dosagem de proteínas das frações.

[00019] A Figura 3 mostra o perfil antiproliferativo dos enzimossomos contra células Jurkat por 48 horas.

[00020] A Figura 4 mostra o perfil antiproliferativo dos enzimossomos contra células Jurkat por 72 horas.

[00021] A Figura 5 mostra o perfil antiproliferativo dos enzimossomos contra células K562 por 48 horas.

[00022] A Figura 6 mostra o perfil antiproliferativo dos enzimossomos contra células K562 por 72 horas.

[00023] A Figura 7 mostra a manutenção da atividade enzimática dos enzimossomos a 4°C.

[00024] A Figura 8 mostra a manutenção da atividade enzimática dos lipossomos com asparaginase encapsulada no espaço interno aquoso a 4°C. DESCRIÇÃO DETAFHADA DA INVENÇÃO [00025] A não ser que sejam definidos de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a invenção pertence. A terminologia utilizada na descrição da invenção tem finalidade de descrever concretizações particulares somente e não tem a intenção de limitar o escopo dos ensinamentos. A não ser que seja indicado de forma diferente, todos os números expressando quantidades, porcentagens e proporções, e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo“cerca de”. Assim, a não ser que seja indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar, dependendo das propriedades a serem obtidas.

[00026] Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê uma formulação lipossomal, aqui também denominada enzimossomo, compreendendo enzima com atividade asparaginase ligada às extremidades de moléculas de polietileno glicol expostas na superfície de lipossomos.

[00027] Os lipossomos aqui descritos podem ser qualquer lipossomo conhecido na técnica. De forma geral, os lipossomos são vesículas formadas por bicamadas lipídicas concêntricas, formando uma cavidade em seu interior.

[00028] De forma geral, a bicamada lipídica é formada por qualquer molécula anfifílica conhecida na técnica, de origem natural ou sintética. A molécula anfifílica tipicamente possui uma porção hidrofílica (cabeça hidrofílica) e uma porção hidrofóbica (cauda hidrofóbica). As referidas moléculas anfifílicas são comumente dispostas em duas camadas de modo que suas porções hidrofóbicas são orientadas para dentro da bicamada (fase hidrofóbica) e suas porções hidrofílicas são orientadas para fora da bicamada (fase hidrofílica).

[00029] A porção hidrofílica pode compreender grupos polares ou carregados tais como carboidratos, fosfato, carboxílico, sulfato, amino, sulfidrila, nitro, hidróxi e outros grupos semelhantes. A porção hidrofóbica pode compreender grupos apoiares que incluem, mas não são limitados a, grupos hidrocarbonetos alifáticos insaturados e saturados de cadeia longa e grupos substituídos por um ou mais grupo(s) aromático(s), ciclo-alifático(s) ou heterocíclico(s).

[00030] Os lipossomos podem ser formados por uma variedade de moléculas lipídicas, as quais podem ser catiônicas, aniônicas ou neutras. Os lipossomos podem ser ainda compostos por misturas de moléculas lipídicas catiônicas, aniônicas e neutras. Misturas de lipídeos neutros e aniônicos, por exemplo, resultam na formação de lipossomos aniônicos.

[00031] Moléculas lipídicas neutras existem em uma forma zwiteriônica não carregada ou neutra em um pH selecionado. Exemplos não limitativos de moléculas lipídicas neutras em pH fisiológico são diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidiletanolamina, ceramida, esfingomielina, cefalina, colesterol, cerebrosídeos e diacilgliceróis. Exemplos não limitativos de moléculas lipídicas zwiteriônicas incluem dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), e dioleoilfosfatidilserina (DOPS).

[00032] Uma molécula lipídica é aniônica quando a mesma é carregada negativamente em pH fisiológico. Exemplos não limitativos de moléculas lipídicas aniônicas são fosfatidilglicerol, diacilfosfatidilserina, ácido diacilfosfatídico, N-dode-canoilfosfatidiletanolaminas, N-succinil fosfatidiletanolaminas, N-glutarilfosfatidiletanolaminas, dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), palmitoiloleiolfosfatidilglicerol (POPG), e outros grupos de modificação aniônicos ligados a lipídeos neutros.

[00033] Em uma forma de realização, os lipossomos da presente invenção são lipossomos neutros/aniônicos. A determinação da carga de um lipossomo pode ser medida por meio de seu potencial zeta. Em uma concretização exemplar, o potencial zeta do lipossomo antes da conjugação com a enzima com atividade asparaginase é próximo a zero, por exemplo, na faixa de -6 a -2 mV.

[00034] Exemplos de moléculas lipídicas anfifáticas que compõem os lipossomos da presente invenção incluem, mas não são limitados a, fosfolipídeos, aminolipídeos e esfingolipídeos.

[00035] Em uma forma de realização, os lipossomos são formados por fosfolipídeos como, por exemplo, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina e semelhantes. Entretanto, outros componentes lipídicos, como por exemplo, colesterol e esfingomielinatambém podem fazer parte dos lipossomos da presente invenção.

[00036] Em uma forma de realização, os lipossomos podem incluir a ligação de estabilizadores estéricos e/ou grupos funcionais. Grupos funcionais são aqueles que podem ser usados para ligar um componente do lipossomo a uma outra porção, tal como uma proteína.

[00037] Os referidos grupos funcionais podem incluir, de forma não limitativa, maleimida. Os referidos estabilizadores estéricos incluem, por exemplo, um do grupo que consiste em polietileno glicol (PEG); poli-L-lisina (PLL); monosialogangliosídeo (GM1); poli( vinil pirrolidona) (PVP); poli(acrilamida) (PAA); poli(2-metil-2-oxazolina); poli(2-etil-2-oxazolina); fosfatidilpoliglicerol; poli[N-(2-hidroxipropil) metacrilamida] ; poli-N- vinilpirrolidonas anfifílicas; Polímero à base de L-aminoácido; e álcool poli vindico.

[00038] Em uma forma de realização, pelo menos um componente do lipossomo é funcionalizado (ou reativo). Um componente funcionalizado é um componente que compreende um grupo reativo que pode ser usado para reticular reagentes e porções. O grupo reativo pode estar localizado em qualquer lugar na molécula lipídica. Um exemplo de grupo reativo é um grupo maleimida. Outros exemplos incluem, de forma não limitativa grupos reativos tiol, grupos amino tais como aminas primária e secundária, grupos carboxila, grupos hidroxila, grupos aldeído, grupos alcino, grupos azida, carbonilas, grupos haloacetila (por exemplo, iodoacetila), grupos imidoéster, ésteres N- hidroxissuccinimida, grupos sulfidrila, grupos dis sulfeto de piridila, e semelhantes.

[00039] Em uma forma de realização, o lipossomo é composto de fosfatidilcolina de ovo (Egg-PC), colesterol (Chol), maleimido-polietileno glicol-l,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (Maleimido-PEG-DSPE) e polietileno glicol-l,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (PEG-DSPE).

[00040] Em uma concretização exemplar, a proporção entre Egg-PC : Chol : Maleimido-PEG-DSPE : PEG-DSPE é de 68,25 : 30,5 : 0,75 : 0,50.

[00041] Em uma forma de realização, a concentração lipídica inicial do lipossomo está na faixa de 5 a 35 pmol/mL. Em uma concretização exemplar, a concentração lipídica inicial do lipossomo é de aproximadamente 20 pmol/mL.

[00042] Devido ao mecanismo de ação da asparaginase, é necessário que os enzimossomos tenham livre circulação na corrente sanguínea e partículas maiores que 200 nm poderiam ficar presas e serem degradadas no fígado, diminuindo o tempo de meia- vida da formulação.

[00043] Em uma forma de realização, os lipossomos da presente invenção têm um tamanho de partícula de 80 a 200 nm. Em uma concretização exemplar, os lipossomos da presente invenção têm um tamanho de partícula de aproximadamente 140 nm.

[00044] Em uma forma de realização, as formulações lipossomais têm um tamanho de partícula de aproximadamente 80 a 200 nm. Em uma concretização exemplar, as formulações lipossomais da presente invenção têm um tamanho de partícula de aproximadamente 140 a 160 nm.

[00045] Os lipossomos usados para preparação das formulações lipossomais podem ser obtidos por qualquer metodologia conhecida no estado da técnica. Um exemplo não limitativo de preparação é fornecido no documento Corvo et al, 2015, o qual é aqui incorporado por referência.

[00046] Em Corvo et al, 2015, as formulações lipossomais são preparadas para uso com a enzima superóxido dismutase. Os inventores da presente invenção observaram que as formulações lipossomais para uso com asparaginase tiveram que ser otimizados para obtenção de uma preparação estável e biologicamente ativa.

[00047] Mais precisamente, foram modificados, por exemplo, a razão molar reagente SATA : Enzima, o tamanho da partícula e razão molar Maleimido-PEG-PE : Enzima. Todos esses fatores influem significativamente na atividade farmacológica e na estabilidade da formulação.

[00048] As condições operacionais devem ser determinadas para cada enzima, pois não existe correlação direta entre as características estruturais, físico-químicas e bioquímicas da enzima a ser formulada e essas variáveis. Também não estão disponíveis estudos no estado da técnica com outros modelos de doença que não a artrite reumatoide (doença alvo da enzima Superóxido Dismutase) que pudessem permitir a extrapolação dessas variáveis.

[00049] A Asparaginase difere da Superóxido Dismutase em sequência de aminoácidos, parâmetros físico-químicos e aplicação terapêutica e, portanto, os parâmetros de reação para a produção dos enzimossomos precisaram ser modificados. Como exemplo, o tamanho de partícula para os enzimossomos da Superóxido Dismutase precisam ser em tomo de 50 nm, uma vez que para o tratamento de artrite, estes enzimossomos precisam estar próximos do alvo terapêutico uma vez que partículas menores enfrentam menos barreiras mecânicas no organismo; já para a Asparaginase, isso não se faz necessário, já que esta atua na depleção da asparagina na corrente sanguínea e partículas de tamanho entre 100 e 200 nm são suficientes para este fim. Assim, a metodologia para o preparo dos enzimossomas de asparaginase foi desenhada com o objetivo de minimizar alterações na estmtura da enzima que poderiam levar a perda da sua atividade catalítica e, ao mesmo tempo, maximizar a eficiência da conjugação e manter o longo tempo de meia-vida dos lipossomas. Controlando a proporção de PEG funcionalizado e não funcionalizado na superfície dos enzimassomas, foi alcançada uma carga enzimática suficiente na superfície dos enzimossomas de longo tempo de circulação, adequada para a atividade biológica esperada. Além disso, a integridade estrutural das vesículas foi mantida, assim como a atividade enzimática indicando uma estrutura enzimática preservada.

[00050] As formulações lipossomais podem ser desenhadas de modo a possuir tempo de meia-vida plasmática aumentada e uma diminuição dos efeitos adversos atribuídos à administração da enzima associada à formulação.

[00051] Em uma forma de realização, as formulações lipossomais, ou enzimossomos, consistem em uma preparação obtida por ligação covalente entre enzimas com atividade asparaginase e a extremidade de moléculas de polietileno glicol funcionalizadas expostas na superfície de lipossomos.

[00052] Em uma concretização exemplar, a molécula de polietileno glicol funcionalizada é Maleimido-PEG-DSPE.

[00053] Em uma concretização exemplar, a razão molar Maleimido- PEG-DSPE : enzima com atividade asparaginase é de 20: 1 a 60: 1. Em uma concretização exemplar particular, a razão molar é de aproximadamente 40: 1.

[00054] As formulações lipossomais aqui descritas apresentam longo tempo de circulação e apresentam atividade enzimática por si, sem a necessidade prévia de liberação de seu conteúdo. Além disso, o fato de a partícula ser peguilada faz com que a enzima fique“mascarada”, o que diminui a probabilidade de haver reações imunológicas.

[00055] Conforme aqui referida,“enzima com atividade asparaginase” relaciona-se a qualquer enzima que promova a conversão de asparagina a ácido aspártico.“Enzima com atividade asparaginase” e“asparaginase” são usados aqui de forma intercambiável.

[00056] Em uma forma de realização, a enzima com atividade asparaginase é de origem microbiana. Em uma concretização exemplar, a enzima com atividade asparaginase é de uma bactéria. Exemplos não limitativos de asparaginase bacterianas são asparaginases de bactérias do gênero Escherichia ou Erwinia. Em outra concretização exemplar, a enzima com atividade asparaginase é de uma levedura. Exemplos não limitativos de asparaginase de leveduras são asparaginases de leveduras do gênero Saccharomyces.

[00057] Em uma concretização exemplar preferencial, a enzima com atividade asparaginase é a enzima asparaginase da levedura Saccharomyces cerevisiae.

[00058] A levedura S. cerevisiae produz dois tipos de asparaginase, sendo que uma delas é uma enzima intracelular (asparaginase I, codificada pelo gene ASP 1) e a outra uma enzima periplasmática (asparaginase II, codificada pelo gene ASP 3).

[00059] A produção da enzima asparaginase II de S. cerevisiae não é reprimida por carbono, não responde à indução pelo aminoácido asparagina e é estimulada em condições de limitação por nitrogénio. As fontes preferenciais de nitrogénio, como, por exemplo, o íon amónio, a glutamina e a asparagina, reprimem a produção da enzima, enquanto as fontes não preferenciais de nitrogénio, como, por exemplo, a prolina e ureia ou ainda a estarvação por nitrogénio permitem a obtenção de níveis mais elevados de enzima.

[00060] A asparaginase II de S. cerevisiae (precursor não processado) apresenta 362 aminoácidos e sua massa molecular é de 38686 Da. Essa enzima apresenta uma sequência sinal de 25 aminoácidos em seu N-terminal, onde é clivada para sofrer posterior glicosilação. Seu sítio ativo, assim como nas enzimas asparaginases de E. coli e E. chrysanthemi, é composto por resíduos de treonina, aspartato e lisina.

[00061] Em uma forma de realização, a enzima com atividade asparaginase é a asparaginase II de S. cerevisiae codificada pelo gene ASP 3 com sequência de polinucleotídeos pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 1.

[00062] Em uma forma de realização, a enzima com atividade asparaginase é a asparaginase II de S. cerevisiae codificada pelo gene ASP3 de SEQ ID NO: 1.

[00063] Em uma forma de realização, a enzima com atividade asparaginase é a asparaginase II de S. cerevisiae compreendendo a sequência de aminoácidos codificada pelo gene de SEQ ID NO: 1.

[00064] Em uma forma de realização, a enzima com atividade asparaginase é a asparaginase II de S. cerevisiae compreendendo a sequência de aminoácidos pelo menos 90%, pelo menos 91 %, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de SEQ ID NO: 2.

[00065] Em uma forma de realização, a enzima com atividade asparaginase é a asparaginase II de S. cerevisiae compreendendo a sequência de aminoácidos como definida na SEQ ID NO: 2.

[00066] As enzimas com atividade asparaginase aqui referidas podem ser obtidas por qualquer metodologia disponível na técnica, as quais são de amplo conhecimento de um técnico no assunto.

[00067] Em uma forma de realização, a enzima com atividade asparaginase é obtida por expressão heteróloga em uma levedura metilotrófica, conforme descrito no documento PI 0406168-3, o qual é aqui incorporado por referência.

[00068] Os parâmetros reacionais de enzimossomos devem ser determinados dependendo da enzima a ser ligada ao lipossomo, de modo a obter uma preparação estável e biologicamente ativa. Os referidos parâmetros variam de acordo com as características da proteína a ser formulada, por exemplo, sua sequência primária, hidrofobicidade, estrutura quaternária, estabilidade a pH e temperatura, bem como sua ação terapêutica. Ademais, até onde é sabido na técnica, não existe correlação direta entre as características estruturais, físico- químicas e bioquímicas da enzima a ser formulada e as variáveis do processo.

[00069] Portanto, parâmetros de formulação que são adequadas para um tipo enzimático e usadas para o tratamento de uma doença específica podem não ser aplicados a uma formulação diferente que utiliza outro tipo enzimático.

[00070] Modelos de formulações lipossomais com ligação de enzimas com atividade asparaginase à superfície de lipossomos peguilados, ou para uso em tratamento de leucemia ou qualquer tipo de câncer, não estavam disponíveis na técnica à época do desenvolvimento da presente invenção.

[00071] Assim, os inventores da presente invenção desenvolveram a metodologia de preparo dos enzimossomos de asparaginase com o objetivo de minimizar alterações na estrutura da enzima que poderiam levar a perda da atividade catalítica e, ao mesmo tempo, maximizar a eficiência da conjugação e manter o longo tempo de meia-vida dos lipossomos.

[00072] Controlando a proporção de PEG funcionalizado e não funcionalizado na superfície dos enzimossomos, foi alcançada uma carga enzimática suficiente para a atividade biológica esperada. Além disso, a integridade estrutural das vesículas foi mantida, assim como a atividade enzimática, o que indica uma estrutura enzimática preservada.

[00073] Em uma forma de realização, a formulação lipossomal de acordo com a presente invenção é útil no tratamento de câncer. Em uma concretização exemplar particular, o câncer é leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide crónica ou linfomas não Hodgkin. Em uma concretização exemplar mais particular, a leucemia é leucemia linfoblástica aguda.

[00074] Em um outro aspecto, a presente invenção provê uma composição farmacêutica que compreende a formulação lipossomal de acordo com a presente invenção e pelo menos um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00075] Conforme aqui definido, o termo“carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis” refere-se a ingredientes compatíveis com outros ingredientes contidos em preparações farmacêuticas e que não apresentam efeito terapêutico e não são prejudiciais a seres humanos ou animais.

[00076] Os carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são selecionados em função da apresentação final da composição da presente invenção que pode ser na forma de solução injetável para administração intramuscular e/ou intravenosa.

[00077] Excipientes, carreadores ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis não apresentam toxicidade ao organismo receptor nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes como ácido ascórbico e metionina; conservantes como cloreto de octadecildimetilbenzil amónio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, álcool butílico, álcool benzílico, alquil parabenos como metil- e propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol; proteínas como albumina, gelatina ou imunoglobulinas; aminoácidos, monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos como glicose, manose, sucrose, manitol ou sorbitol; excipientes poliméricos como polivinilpirrolidonas, Ficoll®, dextrinas e polietileno glicóis; agentes de sabor; adoçantes; agentes anti-estáticos; agentes quelantes como EDTA ou EGTA; sais liberadores de íons como sódio; complexos metálicos; surfactantes não-iônicos como polissorbatos 20 e 80; lipídeos como fosfolipídeos, ácidos graxos e esteroides como colesterol. Métodos para preparação de várias composições farmacêuticas são bem conhecidos, ou serão aparentes à luz da presente invenção, pelo especialista da arte em tecnologia farmacêutica.

[00078] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção compreende a formulação lipos somai da presente invenção e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00079] Em um outro aspecto, a presente invenção provê o uso da formulação lipos somai da invenção na manufatura de um medicamento para tratamento de câncer. Em uma concretização exemplar, o câncer é selecionado a partir de leucemia linfoide aguda, leucemia mieloide crónica e linfomas não Hodgkin. Em uma concretização exemplar particular, a leucemia é leucemia linfoide aguda.

[00080] Em um outro aspecto, a invenção provê um método para tratamento de câncer que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz da formulação lipos somai da presente invenção a um indivíduo em necessidade do mesmo.

[00081] Conforme aqui definido, o termo“quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade da formulação lipossomal que fornece atividade contra câncer, quando administrada de acordo com a dose e via de administração apropriada.

[00082] Conforme aqui definido, o termo“indivíduo” refere-se a seres humanos e animais. Preferencialmente, o indivíduo é um ser humano.

[00083] A quantidade efetiva precisa para um indivíduo humano dependerá da gravidade do estado de doença, da saúde geral do indivíduo, da idade, do peso, e do sexo do sujeito, da dieta, do tempo e da frequência de administração, da combinação/combinações de drogas, das sensibilidades de reação, e da tolerância/resposta à terapia. Assim, doses a serem fornecidas dependem de um número de fatores que não podem ser mensuradas antes que os estudos de testes clínicos sejam feitos. O técnico no assunto, no entanto, sabe como chegar a doses adequadas para diferentes tratamentos.

[00084] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um processo para a preparação da formulação lipossomal. O processo aqui descrito foi desenvolvido pelos inventores com o objetivo de minimizar alterações na estrutura da enzima, o que poderia levar à perda da atividade catalítica e, ao mesmo tempo, maximizar a eficiência da conjugação e manter o longo tempo de meia-vida dos lipossomos.

[00085] O processo de preparação compreende as etapas de:

• introdução de grupos reativos na enzima com atividade asparaginase por ligação a cadeia lateral das lisinas expostas a superfície da asparaginase, deixando as extremidades tioladas;

• ativação da enzima com atividade asparaginase tiolada; e

• ligação da enzima com atividade asparaginase ativada ao lipossomo.

[00086] Em uma forma de realização, a enzima com atividade asparaginase é ativada por tiolação utilizando o reagente bifuncional N- succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA). Em uma concretização, a razão molar SATA : enzima é de 18: 1 a 24: 1. Em uma concretização exemplar, a razão molar SATA : enzima é de aproximadamente 22: 1.

[00087] Em uma forma de realização, a enzima tiolada é purificada para separá-la do excesso de SATA restante da reação. O processo de purificação pode ser realizado por qualquer técnica amplamente conhecida na técnica. Em uma concretização exemplar, a purificação é realizada por cromatografia de exclusão molecular.

[00088] Em uma forma de realização, para a ligação da enzima com atividade asparaginase ao lipossomo, a enzima tiolada é ativada (desprotegida), deixando os grupamentos SH reativos expostos. Em uma concretização exemplar, a ativação da enzima tiolada é feita por desacetilação na presença de uma solução de hidroxilamina.

[00089] Em uma forma de realização, a enzima tiolada ativada é ligada à extremidade da molécula de polietileno glicol funcionalizada exposta na superfície do lipossomo por ligação covalente. Em uma concretização exemplar, a enzima tiolada ativada se liga ao grupamento maleimido presente no lipídeo DSPE-PEG-Maleimido.

[00090] Em uma forma de realização, o processo compreende a etapa adicional de separação da enzima com atividade asparaginase ligada ao lipossomo da enzima com atividade asparaginase não ligada. Em uma concretização exemplar, a separação é feita por ultracentrifugação.

[00091] Os exemplos citados a seguir são meramente ilustrativos, devendo ser empregados somente para uma melhor compreensão dos desenvolvimentos constantes na presente invenção, não devendo, contudo, serem utilizados com o intuito de limitar os objetos descritos.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Produção da asparaginase

[00092] Foi utilizada uma linhagem de P. pastoris recombinante contendo o gene ASP3, que codifica a asparaginase II de S. cerevisiae (INCQS 50002), desenvolvida por Ferrara et al. (2006). A levedura foi cultivada em frascos de Erlenmeyer de 1000 mL contendo 100 mL de meio BMG (tampão fosfato de potássio 100 mM pH 6,0; YNB sem aminoácidos e sem sulfato de amónio 3,4 g/L; (NH4) ₂ S0 ₄ 10 g/L; glicerol 10 g/L; biotina 0,4 mg/L) a temperatura de 28 °C e agitação de 250 rpm, até o esgotamento do glicerol (cerca de 24 h). Em seguida, o pH do meio de cultura foi ajustado a 6,0 com solução de KOH e o metanol foi adicionado na proporção de 5 mL/L para induzir a produção da enzima. As células contendo a asparaginase periplásmica foram separadas do sobrenadante por centrifugação a 3000 x g por 15 min.

[00093] Para a obtenção do extrato bruto enzimático, foi utilizado um protocolo de extração alcalina (Ferrara et al., 2010), empregando-se solução de fosfato de sódio/potássio 500 mM, pH 11,5 com cisteína 10 mM. As células íntegras foram ressuspensas nesta solução, na proporção de 10 mL/g (pellet úmido), por 2 horas a temperatura ambiente. A seguir, o extrato bruto contendo a asparaginase foi separado dos debris celulares por centrifugação a 3000 x g por 15 min e armazenado em freezer para posterior utilização.

[00094] O extrato bruto foi purificado em quatro etapas: (i) ultrafiltração em membranas de celulose de corte definido em 50 kDa (Millipore) (7 ciclos, a 4,500 x g por 7 minutos a 4°C); (ii) cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl Sepharose CL-4B (GE Healthcare) acoplada a um equipamento de purificação Akta purifier 10 (GE Healthcare) (volume aplicado: 4 mL; volume da coluna: 12 mL; eluente A: tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7, contendo (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 1,2 M; eluente B: tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7; gradiente: linear de 0 - 100% de B; velocidade do fluxo: 1 mL/min; volume coletado: 1,2 mL por tubo; detecção: 215 e 280 nm); (iii) ultrafiltração em sistema Amicon 10 kDa utilizando tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,5 a 4°C; (iv) cromatografia de troca aniônica Hitrap Capto-Q (GE Healthcare) acoplada a um equipamento de purificação Akta purifier 10 (GE Healthcare) (volume aplicado: 1 mL; volume da coluna: 1 mL; eluente A: tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,5; eluente B: acetato de sódio 50 mM, pH 5,5 + NaCl 1M; gradiente: linear de 0 - 100% de B; velocidade do fluxo: 1 mL/min; volume coletado: 1,0 mL por tubo; detecção: 215 e 280 nm).

EXEMPLO 2: Preparação dos enzimossomos

[00095] Os enzimossomos de asparaginase foram preparados por ligação covalente entre a enzima e a extremidade de moléculas de polietilenoglicol funcionalizadas (Maleimido-PEG-DSPE) expostas na superfície dos lipossomos.

[00096] Para se conseguir obter uma ligação da enzima ao lipossomo resultando na formulação enzimossomal, grupos reativos na enzima foram introduzidos de modo a que a reação com a extremidade do PEG ativado seja possível através de uma ligação covalente. Para tal, a enzima foi ativada previamente por tiolação utilizando o reagente bifuncional N-succinimidil-S- acetil-tioacetato (SATA) na razão molar SATA:ASP de aproximadamente

22: 1.

[00097] A composição lipídica da formulação lipossomal foi: fosfatidilcolina de ovo (Egg-PC) : colesterol (Chol) : maleimido-polietileno glicol-1 ,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (Maleimido-PEG-DSPE) : polietileno glicol-l,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (PEG-DSPE) na proporção de (68,25: 30,5: 0,75:0,50), sendo a concentração lipídica inicial de 20 pmol/mL. O dimensionamento das formulações dos enzimossomos foi realizado por extrusão num extrusor (LipexThermobarrelExtruder), com filtros com diâmetro de poro decrescente de 0,6, 0,4, 0,2 e 0,1 pm (Nucleopore® Track-EtchedMembranes, Whatman®, EUA), resultando em partículas lipossomais.

[00098] Para se proceder à ligação da asparaginase ao lipossomo, o ASP-ATA foi ativado (desproteção) por uma solução de citrato 10 mM + hidroxilamina 500 mM + EDTA 1 mM, pH 6, resultando em ASP-AT. A enzima não ligada foi separada da ligada por ultracentrifigação e coluna Sephadex G-200 (1 cm de diâmetro x 18 cm de altura).

[00099] Procedeu-se à purificação da ASP-ATA a fim de separá-la do excesso de SATA restante da reação. Este processo foi realizado por cromatografia de exclusão molecular em uma coluna ECONO 10DG (biorad). O perfil obtido na purificação é apresentado na Figura 1.

EXEMPLO 3: Caracterização dos enzimossomos

[000100] As formulações obtidas foram caracterizadas em termos de quantidade de enzima incorporada ou ligada dosada pelo método de Lowry, quantidade de lipídeo na forma lipossomal pelo método de Rouser, atividade enzimática mensurada pelo método de hidroxiláminolise (Ferrara et al, 2006), tamanho e polidispersão das partículas obtidas por Dynamic Light Scattering (DLS) e carga superficial das partículas (potencial zeta). [000101] Observou-se que a ligação do SATA à asparaginase ocorreu, uma vez que houve um aumento da relação de absorbância a 280nm/238nm quando comparada a enzima sem modificação, sendo este último o comprimento de onda no qual o reagente N-succinimidil-S-acetil-tioacetato tem uma maior absorbância, servindo como parâmetro qualitativo de monitoramento da reação.

[000102] Posteriormente, a AS P- ATA foi desacetilada, deixando os grupamentos SH reativos expostos para que se ligassem ao grupamento maleimido presente no lipídeo DSPE-PEG-Maleimido. Para a desproteção, incubou-se a ASP-ATA com uma solução de citrato 10 mM + hidroxilamina 0,5 M + EDTA lmM, pH 6. A seguir, incubou-se a ASP-AT com os lipossomos.

[000103] A enzima não ligada foi separada por diluição com o tampão citrato 10 mM + NaCl 140 mM, pH 6 e ultracentrifugação a 49000 x g. Atendendo aos elevados valores de rendimento obtidos, aproximadamente 100%, e comparado com os valores obtidos para a ligação da superoxido dismutase em formulação semelhante (Corvo et al, 2015), procedeu-se a uma purificação extra por cromatografia no sentido de se apurar se toda a enzima estava efetivamente ligada ou só adsorvida à superfície dos lipossomos. Os ASP-enzimossomos foram recolhidos no volume morto da coluna facilmente visualizados pela turbidez apresentada.

[000104] Os dados referentes à caracterização dos ASP-enzimossomos são apresentados na Tabela 1. O percentual de ligação da ASP-AT à extremidade PEG dos lipossomos, de aproximadamente 93%, é bastante alto, indicando uma grande eficiência no procedimento de ligação.

[000105] A retenção de atividade enzimática situou-se por volta de 48%, o que indica que uma parte da enzima ligada ao enzimossomo foi inativada durante o processo ou que o procedimento de modificação da asparaginase pelo reagente SATA modificou a superfície da enzima a ponto de alterar a atividade enzimática.

Tabela 1. Sumário da caracterização dos ASP-enzimossomos. Os valores representam a média e desvio padrão de experimentos independentes.

* Lipossomos antes da conjugação com a L-asparaginase.

** Calculado em relação ao teórico no momento anterior à incubação da asparaginase com os lipossomos.

[000106] Dado ao valor de 93% de ligação da asparaginase aos lipossomos e no intuito de se estudar possíveis variáveis na purificação pela coluna Sephadex G-200, realizou-se uma incubação da asparaginase modificada pelo SATA e dos lipossomos sem a presença do DSPE-maleimido- PEG para avaliar se a proteína adsorvida, ou seja, não ligada co valentemente, era separada pelo processo cromatográfico. O perfil de purificação está apresentado na Figura 2.

[000107] Através do perfil cromatográfico, conclui-se que a massa de enzima que não está fortemente ligada a porção lipídica é eluída após a fração correspondente a 7mL (Figura 2), para a qual a concentração de lipídeos é muito baixa (medida pela turbidez a 450nm), indicando que a purificação por este método é eficiente no que tange a separar a massa de asparaginase não ligada covalentemente aos enzimossomos.

[000108] Com relação ao tamanho das partículas, observa-se um pequeno aumento, de 0, 143 para 0,165pm, após a conjugação dos lipossomos com a asparaginase, com índice de polidispersão na faixa de 0,122. Observa-se ainda que a enzima conferiu carga negativa à partícula (potencial zeta de -8,8); porém, sendo esta uma formulação que contém PEG em sua superfície, é esperado que estes grupamentos mascarem a carga negativa por promover a presença de uma esfera de hidratação, que é justamente o que dificulta o reconhecimento deste tipo de construção pelo sistema imune.

EXEMPLO 4: Preparação dos lipossomos com asparaginases incorporadas no interior.

[000109] Essa construção foi preparada por encapsulação da asparaginase

(na sua forma nativa) no espaço interno aquoso do lipossomo. A composição lipídica foi Egg-PC: Chol: DSPE-PEG na razão molar de (68,25: 30,5: 1,25) e a concentração lipídica inicial de 32 pmol/mL. Os lipossomos foram preparados pelo método de desidratação-reidratação (sDRV) seguido de extrusão para o seu dimensionamento tal como descrito por Corvo et al (2002; 2015). Desta forma, os sDRV obtidos foram dimensionadas através do processo de extrusão (Lipex Thermobarrel Extruder), por filtros com diâmetro de poro decrescente de 0,6, 0,4, 0,2 e 0,1 pm (Nucleopore ® Track-Etched Membranes, Whatman®, EUA). A proteína não encapsulada foi separada por ultracentrifugação e coluna de exclusão molecular Sephadex G-200. A caracterização dos lipossomos incorpordas no espaço interno aquoso é mostrada na Tabela 2.

Tabela 2: Sumário da caracterização dos lipossomas incorpordas no espaço interno aquoso (ASP-lipossomos).

* Calculado em relação ao teórico no momento anterior à incubação da asparaginase com os lipossomos.

EXEMPLO 5: Ensaios de atividade antiproliferativa em células leucêmicas.

[000110] Testou-se a capacidade antiproliferativa das formulações lipossomais contra as linhagens celulares: K562 (leucemia mielóide crónica), Jurkat (leucemia linfocítica aguda), MCF-7 (tumor de mama pouco invasivo) e H69 (metastática de pulmão). Usou-se como comparador a asparaginase de S. cerevisiae clonada e expressa em P. pastoris livre (não formulada) e a asparaginase de E. coli comercial (Aginasa®).

[000111] Os ensaios foram realizados segundo o protocolo do MTS da seguinte forma: as células foram mantidas em fase exponencial de crescimento e então foram semeadas em placas de 96 poços, na proporção aproximada de 2,5 X 10 ³ células por poço. Em seguida, as células foram tratadas com as duas formulações desenvolvidas de asparaginase, assim como pela asparaginase livre e pela asparaginase de E. coli comercial (0,08 a 10 UI/mL) , incubadas em estufa a 37 °C e 5% de CO2. Após o tempo de 48 ou 72 horas, adicionou-se o reagente de MTS e as placas foram incubadas a 37°C por 2 horas, lendo-se em seguida a absorbância nos comprimentos de onda de 490 e 630 nm.

5.1. Células H69 ( metastática de pulmão )

[000112] Para as células H69, não foram observadas diferenças de crescimento entre o controle negativo (salina) e as células tratadas com asparaginase, indicando que esta linhagem não é sensível a esta enzima (dados não apresentados).

5.2. Células Jurkat ( leucemia linfocítica aguda)

[000113] Com relação à linhagem Jurkat, sensível a asparaginase, os perfis obtidos com 48 e 72h de tratamento estão apresentados nas Figuras 3 e 4. O ensaio feito por 72h apresentou valores maiores de inibição, indicando que as células necessitam de um tempo maior de privação de asparagina para morrer. Observa-se também que os ASP-enzimossomos apresentaram uma resposta similar à da asparaginase livre em 48h e superior em 72h; o que é um bom indicativo da capacidade terapêutica desta formulação. Outro ponto a se ressaltar é que a resposta antiproliferativa do ASP-enzimossomo, apesar de inferior à da asparaginase de E. coli em 48h, foi similar em 72h, indicando uma equivalência em termos de propriedades terapêuticas para tempos prolongados.

5.3. Células K562 ( leucemia mielóide crónica )

[000114] Com relação à linhagem K562 (Figura 5 e 6), similarmente à resposta antiproliferativa obtida com a linhagem Jurkat, os resultados de 72h de ensaio são mais expressivos do que os obtidos com 48h e os valores de inibição para os ASP-enzimossomos e a asparaginase livre são similares. Entretanto, a resposta antiproliferativa da asparaginase comercial (medicamento Aginasa) foi consideravelmente superior à obtida para a asparaginase de levedura livre e para o ASP-enzimossomo. Este fato pode ser atribuído à capacidade da enzima comercial de hidrolisar também a L- glutamina, o que para algumas linhagens menos sensíveis somente à depleção da L-asparagina, como é o caso da K562, é consideravelmente significativo. De acordo com Pinheiro (2015) a asparaginase II de S. cerevisiae clonada e expressa em P. Pastoris apresenta baixa especificidade para glutamina.

EXEMPLO 6: Ensaios de estabilidade das formulações

[000115] O estudo de estabilidade das formulações em suspensão a 4°C foi feito pela avaliação dos seguintes parâmetros: quantidade de enzima e lipídeo e retenção de atividade enzimática.

[000116] O estudo da estabilidade foi feito pela comparação dos enzimossomos com construções nas quais a enzima com atividade asparaginase foi incorporada no interior de lipossomos, conforme descrito no EXEMPLO 4.

6.1. Ensaio de estabilidade

[000117] A estabilidade dos ASP-enzimossomas e dos ASP-lipossomos a 4°C por 37 dias e 42 dias, respectivamente, foi avaliada segundo a manutenção da razão proteína/lipídio. Este parâmetro foi ligeiramente alterado, mantendo 79 e 80% do valor inicial para os ASP-enzimossomas e ASP-lipossomos, respectivamente, indicando que as construções apresentam estabilidade relativamente elevada.

6.2. Ensaio de manutenção da atividade enzimática

[000118] Com relação à manutenção da atividade enzimática, verifica-se por meio das Figuras 8 e 9 que a construção do tipo enzimossomo apresentou estabilidade muito maior do que uma do tipo lipossomo com asparaginase encapsulada no espaço interno aquoso, à 4°C. O ASP-enzimossomo manteve- se estável, sem perda significativa de atividade por 4 dias e manteve aproximadamente 82% da atividade após 37 dias em geladeira. Estes resultados indicam que esta formulação é suficientemente estável, fator preponderante para um biofármaco.

EXEMPLO 7: Comparação entre o enzimossomo da presente invenção e o estado da técnica

[000119] Na tabela 3 são demonstrados os parâmetros diferenciados entre o enzimossomo do estado da técnica, relacionado à enzima superóxido dismutase, e o enzimossomo da presente invenção.

Tabela 3: Comparação entre parâmetros do enzimossomo da presente invenção e o estado da técnica

[000120] Na etapa de ativação da enzima por tiolação utilizando o reagente SATA, foi utilizada, para a asparaginase, a razão molar SATA:enzima de aproximadamente 22: 1, enquanto que para a Superóxido Dismutase, este valor foi de 4: 1. Verifica-se então que a razão molar reagente SATA:Enzima é muito maior para a asparaginase.

[000121] O tamanho da partícula, definido pelo tamanho do diâmetro do poro do filtro utilizado na etapa de extrusão, também foi muito diferente para as duas enzimas: 0,140 nm para a asparaginase e de até 50 nm para a Superóxido Dismutase.

[000122] A razão molar Maleimido-PEG-PE: Enzima foi muito maior para a asparaginase (40: 1) quando comparado à razão empregada para a Superóxido Dismutase (10: 1).

REFERÊNCIAS

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FERRARA, M.A.; SEVERINO, N. M. B.; MANSURE, J.J.; MARTINS, A. S.; OLIVEIRA, E. M. M.; SIANI, A.C.; PEREIRA JR, N, TORRES, F.A.G.; BON, E.P.S. Asparaginase production by a recombinant Pichia pastoris strain harbouring Saccharomyces cerevisiae ASP3 gene. Enzyme and Microbial Technology, 39, 1457-1463. 2006.

FERRARA, M.A; SEVERINO, N.M.B; VALENTE, R.H; PERALES, J; BON, E.P.S. High-yield extraction of periplasmic asparaginase produced by recombinant Pichia pastoris harbouring the Saccharomyces cerevisiae ASP3 gene. Enzyme and Microbial Technology, 47, 71-76, 2010.

GIRÃO, L.F.C.; ROCHA, S.L.G.; TEIXEIRA, R.S.S.; BOM, A.P.A.; SAMPAIO, A.L.F.; SILVA, J.G.; FERRARA, M.A.; BON, E.P.S. ; PERALES, J. Saccharomyces cerevisiae asparaginase II, a potential antileukaemic drug: purification and characterization of the enzyme expressed in Pichia pastoris. Protein Expression and Purification, v. 120, p. 118-125, 2016.

M1JLLER H.J, BOOS J. Use of L-asparaginase in childhood ALL. Crit Rev Oncol Hemat., 28, 97-113. 1998.

PINHEIRO, A.M.S. Avaliação das propriedades bioquímicas, físico-químicas e antileucêmica da enzima asparaginase produzida por Pichia pastoris recombinante. Dissertação de mestrado. Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica, Farmanguinhos, FIOCRUZ. 2015.

VALE, CA, CORVO, ML, MARTINS, LCD, MARQUES C, CRUZ, MEM, MARTINS, MB. Construction of enzymosomes: Optimization of coupling parameters. Technical Proceedings of the 2006 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show, Vol. 2, Chapter 5, 396-397. 2006.