Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur automatischen Ermittlung von Positionen auf einer Probenanordnung im Objektraum eines Mikroskops sowie ein entsprechendes Mikroskop. Insbesondere betrifft die Erfindung die automatische Erkennung der räumlichen Position eines Probenträgers bei insbesondere verstellbaren Halteeinrichtungen in der Mikroskopie.

Stand der Technik

Zur Untersuchung insbesondere biologischer Proben sind aufrechte sowie inverse Mikroskope aus dem Stand der Technik bekannt. Diese weisen in der Regel einen in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse des Mikroskops, wie sie durch das Mikroskopobjektiv definiert ist, verfahrbaren x-y-Mikroskoptisch auf. Dieser verfügt über ein Koordinatensystem, über das jede beliebige Position angefahren werden kann. Auf diese Weise ist es möglich, bestimmte Punkte anzufahren, an denen eine Probenuntersuchung erfolgen soll, und/oder bestimmte Bereiche zu definieren, innerhalb derer die Probe abgefahren bzw. gescannt werden soll. Die entsprechenden Punkte bzw. Bereiche werden in der Regel von einem Benutzer eingegeben, wobei hierzu meist eine visuelle Kontrolle durch Sichtung von mikroskopischen Bildern erfolgt. Bei der Verwendung von bekannten

Halteeinrichtungen (Haltern), bei denen der Objektträger (Englisch "slide") bzw. allgemeiner der Probenträger eine feste Position einnimmt, kann das Anfahren einer Position und/oder das Scannen eines Bereichs auch automatisch erfolgen.

Bei der Verwendung von Universal-Haltern als Halteeinrichtung mit einem verstellbaren Rahmen zur Aufnahme verschiedener Probenträger, speziell eines Slides, einer Petrischale oder Multiwell-Platte o.ä., kann eine definierte Position auf dem Probenträger nicht angefahren werden, da aufgrund der Verstellbarkeit des Halters kein fester Bezug mehr zwischen dem Mikroskoptisch-Koordinatensystem und der Position des Probenträgers besteht. Aufgrund des fehlenden Bezugs muss der Benutzer visuell den Probenträger an die gewünschte Position verfahren. Ein solcher manueller Eingriff des Benutzers ist meist zeitraubend und kann sich umständlich gestalten. Bei geschlossenen Systemen, bei denen kein oder nur ein eingeschränkter visueller Kontakt des Benutzers zum Probenträger besteht, ist eine solche manuelle Positionierung noch umständlicher und fehleranfällig, wenn nicht gar unmöglich.

Vor diesem Hintergrund ist es wünschenswert, Positionen auf einer

Probenanordnung, beispielsweise einer Halteeinrichtung und/oder einem

Probenträger, automatisch zu ermitteln, um ausgehend von den ermittelten Positionen eine Positionierung vornehmen und/oder Probenbereiche für die nachfolgende mikroskopische Untersuchung festlegen zu können.

Offenbarung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung schlägt ein Verfahren zur automatischen Ermittlung mehrerer Positionen auf einer Probenanordnung im Objektraum eines Mikroskops sowie ein entsprechendes Mikroskop gemäß den unabhängigen Patentansprüchen vor. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den jeweiligen

Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung. Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur automatischen Ermittlung von

Positionen auf und/oder in einer Probenanordnung im Objektraum eines

Mikroskops, wobei das Mikroskop ein Mikroskopobjektiv, das eine optische Achse definiert, umfasst. Bei den zu ermittelnden Positionen handelt es sich

insbesondere um Begrenzungspunkte von die Probenanordnung bildenden Elementen, also beispielsweise Randpunkte, Anfangs- bzw. Endpunkte eines Elements bezogen auf eine bestimmte Richtung. Zur Ermittlung solcher Positionen wird ein Messstrahl von einer Messstrahleinrichtung des Mikroskops erzeugt und auf die Probenanordnung gerichtet, und ein von der Probenanordnung

reflektierter Messstrahl wird von einem Detektor, der ein Ausgangssignal erzeugt, erfasst. Die Probenanordnung wird in zumindest einer Richtung senkrecht zur optischen Achse verschoben ln Abhängigkeit von dieser Verschiebung werden die Positionen auf der Probenanordnung mittels während der Verschiebung in die zumindest eine Richtung erzeugten Ausgangssignalen des Detektors ermittelt.

Das von dem Detektor erzeugte Ausgangssignal ist insbesondere zumindest auch hinsichtlich einer Höhenänderung in der Probenanordnung sensitiv (im Folgenden auch "höhensensitives Detektorsignal" genannt). Weisen folglich bestimmte Elemente der Probenanordnung unterschiedliche Höhe, also Ausdehnungen in z- Richtung parallel zur optischen Achse, auf, so ändert sich das Detektorsignal, wenn während der Verschiebung der Probenanordnung der Messstrahl an diesen Elementen unterschiedlicher Höhe reflektiert wird. Alternativ oder zusätzlich kann das Detektorsignal hinsichtlich einer Materialänderung in der Probenanordnung sensitiv sein (im Folgenden auch "materialsensitives Detektorsignal" genannt) ln diesem Fall ändert sich das Detektorsignal, wenn während der Verschiebung der Probenanordnung der Messstrahl an Elementen unterschiedlichen Materials reflektiert wird. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn sich innerhalb der Probenanordnung zwar nicht die Ausdehnung in z-Richtung, aber der

Brechungsindex ändert, beispielsweise auch bei Industrieproben, die in Silikon o.ä. eingebettet sind ln solchen Fällen ist es möglich, Probenbereiche mit gleichem Brechungsindex bzw. gleicher Reflektivität zu detektieren. Häufig ist das Detektorsignal sowohl höhen- als auch materialsensitiv, so dass Änderungen hinsichtlich der Ausdehnung in z-Richtung als auch hinsichtlich des

Brechungsindex detektiert werden können.

Mit Vorteil werden die von dem Detektor erzeugten Ausgangssignale hinsichtlich vorhandener Signalflanken ausgewertet, um die mehreren Positionen auf der Probenanordnung zu bestimmen. Signalflanken treten beispielsweise bei den erwähnten höhen- und/oder materialsensitiven Detektorsignalen in der Regel immer dann auf, wenn sich eine Eingangsgröße, wie Höhe bzw. Material auf der Probenanordnung in Verschieberichtung ändert. Einem bestimmten Punkt auf einer solchen Signalflanke kann dann ein entsprechender Ort in

Verschieberichtung und somit eine entsprechende Position auf der

Probenanordnung zugeordnet werden.

Es ist vorteilhaft, wenn die Messstrahleinrichtung einen gerichteten Messstrahl erzeugt und diesen über ein Umlenkelement in das Mikroskop parallel zur optischen Achse derart einkoppelt, dass der Messstrahl über das

Mikroskopobjektiv auf die Probenanordnung fällt. Nach Reflexion an der

Probenanordnung fällt vorzugsweise ein reflektierter Messstrahl durch das Mikroskopobjektiv auf ein Umlenkelement und von dort auf den Detektor, wobei es sich vorzugsweise um ein und dasselbe Umlenkelement handelt.

Die erfindungsgemäß untersuchte Probenanordnung umfasst zweckmäßigerweise eines oder mehrere der folgenden Elemente: Eine Halteeinrichtung für einen Probenträger, wobei eine solche Halteeinrichtung üblicherweise als Halter oder Halterahmen bezeichnet wird, und/oder einen Probenträger, wobei es sich hierbei um einen Objektträger (Englisch "slide"), einen Glasträger, eine Petrischale (Englisch "Petri dish"), ein Zellkultiviersystem (Englisch "cell cultivation System"), ein Kammer-Objektträgersystem (Englisch "chambered coverglass System"), eine Multiwell-Platte (Englisch "multiwell plate") handeln kann, und/oder ein Deckglas, einschließlich ein Kammer-Deckglassystem (Englisch "chambered coverglass system"), und/oder eine Probe. Bei der Probenanordnung kann es sich also beispielsweise um einen Halter bzw. Halterahmen mit eingesetztem Objektträger (Slide) handeln, wobei auf dem Objektträger eine dünne biologische Probe aufgebracht ist, die ihrerseits unter einem Deckglas liegt. Selbstverständlich können auch einzelne der genannten Elemente fehlen. Bei einer solchen

Probenanordnung können mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens bei

Verschieben der Probenanordnung in eine Richtung insbesondere die jeweiligen Begrenzungspunkte dieser Elemente, also die Anfangs- und Endpunkte des Halters und/oder des Objektträgers und/oder des Deckglases und/oder gegebenenfalls der Probe in dieser Richtung bestimmt werden ln weiter unten erläuterten optionalen Ausgestaltungen ist es auch möglich, die Begrenzungspunkte einer Probe und/oder Probenbereiche auf zuverlässige Weise zu ermitteln.

Mit Vorteil wird die Erfindung unter Verwendung einer triangulierenden

Autofokuseinrichtung eingesetzt. Eine solche triangulierende

Autofokuseinrichtung erzeugt einen Autofokus-Messstrahl, der üblicherweise über das Mikroskopobjektiv auf einen Probenbereich gerichtet wird, wobei ein dort reflektierter Messstrahl wiederum über das Mikroskopobjektiv einem Autofokus- Detektor zugeführt wird. Dieser Detektor erzeugt ein Ausgangssignal, das sich bei Veränderung des Abstands zwischen Mikroskopobjektiv und Probenbereich ändert, somit also höhensensitiv im oben definierten Sinne ist. Eine solche

Autofokuseinrichtung wird üblicherweise zum Einstellen und/oder Halten des Fokus vor bzw. während einer Probenuntersuchung mit einem Mikroskop verwendet.

Zur besseren Verständlichkeit soll die Erfindung nachfolgend ohne Beschränkung der Allgemeinheit im Zusammenhang mit einer solchen triangulierenden

Autofokuseinrichtung näher erläutert werden. Eine solche triangulierende

Autofokuseinrichtung ist an sich beispielsweise aus der US 5 136 149 Bl bekannt und soll anhand der beigefügten Figur 1 näher erläutert werden. Es sei angemerkt, dass Figur 1 lediglich das Grundprinzip einer solchen Autofokuseinrichtung 2 beschreibt. Eine vorteilhafte Weiterentwicklung ist beispielsweise aus der deutschen Patentschrift, DE 10 2010 030 430 B4, der Anmelderin bekannt.

Bezüglich Einzelheiten, Funktionsweisen und Aufbau sei ausdrücklich auf die genannten Druckschriften verwiesen. Wie in Figur 1 gezeigt, ist eine

Autofokussierungslichtquelle 19 derart angeordnet, dass nach Umlenkung des Autofokus-Messstrahls 30 und Durchtritt des selbigen durch das

Mikroskopobjektiv 10 die Objekteebene 16 schräg bzw. schief getroffen wird. Ein positionssensitiver Autofokus-Detektor 28 detektiert die seitliche Versetzung eines einfallenden Strahls 32, wie weiter unten beschrieben wird. Die

Autofokuseinrichtung umfasst weiterhin einen Motor 27 zum Bewegen des Objektivs 10 in Richtung optischer Achse 8 (z-Richtung). Alternativ oder zusätzlich kann die Objektebene 16 auch in Richtung der optischen Achse 8 verschoben werden.

Bei der Autofokuseinrichtung 2 gemäß Figur 1 wird der Messstrahl 30 durch den Strahlteiler 20 an einem Punkt A in Richtung Objektiv gelenkt, durch das der abgelenkte Strahl 30 unter einem Winkel et schräg bzw. schief im Punkt C auf die Objektebene 16 trifft. Der reflektierte Messstrahl 32 gelangt über das Objektiv 10 wiederum zu dem Strahlteiler 20 und wird dort in einem Punkt B in den Detektor 28 gelenkt. Dessen Ausgangssignal hängt von dem Ort, an welchem der Strahl 32 auftrifft, ab, sodass der Ort dadurch bestimmt ist.

Im Falle einer Defokussierung, das heißt im vorliegenden Beispiel gemäß Figur 1 einer Verschiebung der Objektebene 16 in die Ebene 16' (oder einer Verlagerung eines abzubildenden Punktes aus der Ebene 16 in die Ebene 16'), wird der Messstrahl 30 erst am Reflexionspunkt D reflektiert, der gegenüber dem Punkt C nicht nur in Richtung der optischen Achse 8, sondern auch lateral bzw. seitlich hierzu verschoben ist. Wie aus Figur 1 ersichtlich, erreicht der entsprechende reflektierte Strahl 32', der im Strahlteiler 20 auf den Punkt B' trifft, den Detektor 28 an einem unterschiedlichen Ort und liefert somit ein verändertes Signal gegenüber der Fokuslage. Auf diese Weise kann der Grad der Defokussierung gemessen und durch den von der Autofokuseinrichtung 2 angesteuerten Motor 27, der die Objektivlinse 10 bewegt, wieder kompensiert werden. Figur 1 zeigt weiterhin eine Tubuslinse 12 sowie die Bildebene 14 des Mikroskops 1. Weitere Ausführungen zu Figur 1 befinden sich weiter unten in der Figurenbeschreibung.

Das von dem Detektor 28 der Autofokuseinrichtung erzeugte Ausgangssignal ist somit mit dem Abstand zwischen Mikroskopobjektiv 10 und Objektebene 16 korreliert und somit "höhensensitiv" im oben definierten Sinn. Dies macht sich die vorliegende vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung zur Ermittlung von Positionen auf einer Probenanordnung zu Nutze. Befindet sich an Stelle der in Figur 1 gezeigten Objektebene 16 im Objektraum eine Probenanordnung mit Elementen, die in z-Richtung unterschiedliche Ausdehnung/Höhe besitzen, so liefert je nach Ausdehnung/Höhe eines Elements in z-Richtung der Detektor 28 der Autofokuseinrichtung unterschiedliche Ausgangssignale. Gleichzeitig ist das Detektorsignal in der Regel auch materialsensitiv im oben definierten Sinn. Beim Verschieben der Probenanordnung in eine Richtung senkrecht zur optischen Achse 8 ergeben die erzeugten Ausgangssignale somit ein höhensensitives und in der Regel auch materialsensitives Profil, wie es durch die Autofokuseinrichtung gesehen wird. Hieraus lassen sich dann insbesondere Begrenzungs- bzw. Anfangs und Endpunkte eines Elements der Probenanordnung in der Verschieberichtung bestimmen. Es sei betont, dass die vorliegende Erfindung eine etwaige vorhandene Autofokuseinrichtung somit nicht zu ihrem eigentlichen Zwecke einsetzt, den Fokus einzustellen oder zu halten, sondern für den gänzlich anderen Zweck, interessierende Positionen auf einer Probenanordnung zu bestimmen.

Mit anderen Worten kann eine triangulierende Autofokuseinrichtung, die im normalen Betrieb eines Mikroskops zur Einstellung und/oder zum Halten des Fokus auf eine gewünschte Objektebene verwendet wird, zur Ermittlung von Positionen auf einer Probenanordnung eingesetzt werden, indem die von dem Detektor der Autofokuseinrichtung erzeugten Ausgangssignale entsprechend ausgewertet werden. Im normalen Betrieb eines Mikroskops zeigen diese Ausgangssignale eine Abstandsänderung zwischen Mikroskopobjektiv und der gewählten Referenz-Objektebene an, sodass die Autofokuseinrichtung zur Kompensation einer solchen Abstandsänderung das Mikroskopobjektiv und/oder die Objektebene entsprechend verschiebt. Bei vorliegender Ausführungsform der Erfindung werden hingegen die erzeugten höhen- und/oder materialsensitiven Ausgangssignale des Detektors vor dem eigentlichen Mikroskopbetrieb dazu verwendet, bestimmte Positionen auf der in einer bestimmten Richtung verschobenen Probenanordnung zu ermitteln. Hierzu kann beispielsweise das erzeugte Ausgangssignal während der Verschiebung der Probenanordnung aufgenommen und ein daraus resultierendes Profil ausgewertet werden. Wie weiter unten erläutert, kann dieses Profil mit dem Höhenverlauf und/oder dem Materialverlauf der Probenanordnung in der Verschieberichtung korreliert sein.

Zur Verschiebung der Probenanordnung in zumindest eine Richtung wird vorteilhafterweise ein x-y-Mikroskoptisch des Mikroskops verwendet, der in x- und/oder y-Richtung bewegt wird. Beispielsweise kann die Probenanordnung an verschiedenen y-Koordinaten jeweils in x- Richtung verschoben werden. Auf diese Weise können mehrere in x- Richtung verlaufende Profile erzeugt werden, die zu einer zweidimensionalen Profilkarte zusammengesetzt werden können.

Den ermittelten Positionen auf der Probenanordnung können bei Verwendung eines x-y-Mikroskoptisches bestimmte x-y-Koordinaten dieses Mikroskoptisches zugeordnet werden. Auf diese Weise ist es möglich, die ermittelten Positionen zu einem späteren Zeitpunkt, insbesondere während der mikroskopischen

Untersuchung, wieder anzufahren. Weiterhin ist es sinnvoll, anhand der ermittelten Positionen auf der Probenanordnung einen Probenbereich zur Probenuntersuchung mit dem Mikroskop (auch "Arbeitsbereich" genannt) festzulegen. Bei einer eingangs geschilderten Probenanordnung umfassend einen Halter, einen Objektträger, eine Probe und ein Deckglas, kann als sinnvoller Arbeitsbereich zur Probenuntersuchung der Bereich des Deckglases definiert werden. Somit können in sinnvoller Weise außerhalb des Deckglases liegende Bereiche zur Probenuntersuchung ausgeklammert werden. Eine weitere

Möglichkeit, den Arbeitsbereich auf die unter dem Deckglas befindliche Probe einzuschränken, wird weiter unten erläutert.

Es ist vorteilhaft, bereits die Anzahl von zur Festlegung des Probenbereichs bzw. Arbeitsbereichs zu ermittelnden Positionen bei einer bekannten Probenanordnung dadurch zu reduzieren, dass vorab gespeicherte Abmessungen bzw. Geometrien dieser bekannten Probenanordnung berücksichtigt werden. In einer Datenbank, allgemein aus einem Speicher, kann ein Benutzer beispielsweise auswählen, welche Art von Halterahmen er für die Aufnahme des Probenträgers (Glas-Slide, Petrischale oder Wellplatte) verwendet. Die Datenbank liefert die Abmessungen des Halterahmens mit den festen Achsen der Probenaufnahme. Durch diese Angaben kann die mögliche Position des Probenträgers sinnvoll eingeschränkt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann dann zweckmäßigerweise nur innerhalb des bereits eingeschränkten Bereichs zur Ermittlung der

Begrenzungspunkte des verwendeten Probenträgers eingesetzt werden.

In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung werden mittels einer optischen Auswerteeinrichtung des Mikroskops während der Verschiebung der

Probenanordnung in eine Richtung Helligkeits- und/oder Kontrastsignale erzeugt und ausgewertet. Insbesondere können hierzu mittels einer

Bilderzeugungseinrichtung des Mikroskops während der Verschiebung der Probenanordnung in eine Richtung mikroskopische Bilder aufgenommen und die aufgenommenen Bilder hinsichtlich Helligkeits- und/oder Kontraständerungen ausgewertet werden. Während der Erzeugung des genannten Profils bzw. der genannten Profilkarte können parallel Helligkeits- und/oder Kontrastwerte anhand entsprechender Signale der optischen Auswerteeinrichtung oder aber insbesondere Bilder mittels einer Bilderzeugungseinrichtung des Mikroskops, also in der Regel einer Kamera, aufgenommen werden. Die Auswertung der

aufgenommenen Signale bzw. Bilder hinsichtlich Helligkeits- und/oder

Kontraständerungen erfolgt zweckmäßigerweise durch Vergleich der aufgenommenen Signale bzw. Bilder mit einem oder mehreren Vergleichssignalen bzw. -bildern. Liegt eine Helligkeitsänderung vor, wird diese Information zusätzlich mit dem zugehörigen Ausgangssignal des Detektors in

Verschieberichtung und/oder mit den zugehörigen x-y-Koordinaten des

Mikroskoptisches verknüpft. Auf diese Weise kann beispielsweise eine

Helligkeitsänderung registriert werden, wenn in Verschieberichtung nach einem leeren Glas-Objektträger eine Probe auftaucht. Der zugehörige Ort dieser

Helligkeitsänderung entspricht dann dem Anfangspunkt der Probe in der untersuchten Verschieberichtung. Diese Information kann zur Festlegung des Arbeitsbereichs herangezogen werden, um auf diese Weise die Probe auf dem Objektträger identifizieren und den Arbeitsbereich auf die Probe beschränken zu können. Es kann in diesem Zusammenhang auch zweckmäßig sein, über diese Auswertung Abmessungen der Probe jeweils in der genannten Verschieberichtung zu bestimmen. Bei einem zweidimensionalen Abscannen/Verschieben der Probe kann auf diese Weise die Ausdehnung der Probe in der x-y-Ebene bestimmt werden.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn die im Laufe der Verschiebung der

Probenanordnung in die zumindest eine Richtung erzeugten Ausgangssignale des Detektors der Autofokuseinrichtung zur Darstellung eines Profils (in einer

Dimension) oder einer Profilkarte (in zwei Dimensionen) der Probenanordnung verwendet werden. Diese Ausgestaltung war bereits weiter oben erwähnt und wird im Einzelnen im Zusammenhang mit den Ausführungsbeispielen ausführlich erläutert.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Mikroskop, das zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingerichtet ist.

Das erfindungsgemäße Mikroskop umfasst ein Mikroskopobjektiv, das eine optische Achse definiert, eine Messstrahleinrichtung zur Erzeugung eines auf eine Probenanordnung gerichteten Messstrahls und einen Detektor zur Erfassung eines von der Probenanordnung reflektierten Messstrahls, wobei der Detektor ein Ausgangssignal erzeugt, weiterhin eine Verschiebeeinrichtung zur Verschiebung der Probenanordnung in zumindest eine Richtung senkrecht zur optischen Achse und weiterhin eine Bestimmungseinrichtung zur automatischen Ermittlung mehrerer Positionen auf der Probenanordnung. Hierbei ist die

Bestimmungseinrichtung derart ausgebildet, dass die Positionen auf der

Probenanordnung mittels während einer Verschiebung der Probenanordnung in die zumindest eine Richtung erzeugten Ausgangssignalen des Detektors in

Abhängigkeit von der Verschiebung bestimmt werden.

Bezüglich Ausgestaltungen und Vorteilen des erfindungsgemäßen Mikroskops sei vollumfänglich auf die Ausführungen im Zusammenhang mit dem entsprechenden erfindungsgemäßen Verfahren verwiesen.

Vorteilhafterweise umfasst das Mikroskop einen Speicher, insbesondere in Form einer Datenbank, zur Abspeicherung von Abmessungen bekannter

Probenanordnungen. Auch diesbezüglich sei auf die Ausführungen im

Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verwiesen.

Vorteilhafterweise umfasst das erfindungsgemäße Mikroskop eine optische Auswerteeinrichtung zur Erzeugung und Auswertung von Helligkeits- und/oder Kontrastsignalen während der Verschiebung der Probenanordnung, insbesondere in Form einer Bilderzeugungseinrichtung zur Erzeugung mikroskopischer Bilder während der Verschiebung der Probenanordnung sowie einer

Bildauswertungseinrichtung zur Auswertung von Helligkeits- und/oder

Kontraständerungen der erzeugten Bilder. Auch bezüglich dieser Ausgestaltung sei auf die Ausführungen im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verwiesen.

Mit Vorteil ist die Bestimmungseinrichtung des erfindungsgemäßen Mikroskops derart ausgebildet, dass den ermittelten Positionen auf der Probenanordnung bestimmte x-y-Koordinaten eines Mikroskoptisches zugeordnet werden, der die Verschiebeeinrichtung des Mikroskops bildet. Die Bestimmungseinrichtung ist weiterhin vorteilhafterweise derart ausgebildet, dass anhand der ermittelten Positionen ein Arbeitsbereich zur Probenuntersuchung festgelegt wird. Weiterhin kann mit Vorteil die Bestimmungseinrichtung derart ausgebildet sein, dass zur Festlegung des Arbeitsbereichs die Auswertung der aufgenommenen Signale der optischen Auswerteeinrichtung bzw. Bilder der Bilderzeugungseinrichtung hinsichtlich Helligkeits- und/oder Kontraständerungen herangezogen wird und/oder Abmessungen einer auf der Probenanordnung befindlichen Probe über die Auswertung der aufgenommenen Signale bzw. Bilder hinsichtlich Helligkeits und/oder Kontraständerungen bestimmt werden.

Die Erfindung betrifft schließlich ein Computerprogramm mit Programmcode, bei dessen Ausführung auf einer einem erfindungsgemäßen Mikroskop zugeordneten Recheneinheit ein erfindungsgemäßes Verfahren durchgeführt wird. Weiterhin betrifft die Erfindung ein entsprechendes Computerprogrammprodukt mit einem darauf gespeicherten Computerprogramm mit Programmcode, bei dessen

Ausführung auf einer einem erfindungsgemäßen Mikroskop zugeordneten

Recheneinheit ein erfindungsgemäßes Verfahren durchgeführt wird. Das

Computerprogramm kann als solches heruntergeladen oder hochgeladen werden oder auf einem Computerprogrammprodukt gespeichert oder

zwischengespeichert sein. Als Computerprogrammprodukt kommen flüchtige oder nichtflüchtige Speichermedien, wie beispielsweise ein USB-Stick, RAM- oder ROM- Speicher bekannter Art, in Frage. Die genannte Recheneinheit kann die

Steuereinrichtung des Mikroskops oder ein Teil dieser Steuereinrichtung sein. Die genannte Bestimmungseinrichtung des erfindungsgemäßen Mikroskops kann Bestandteil dieser Recheneinheit und/oder der genannten Steuereinrichtung sein.

Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der

Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung. Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispiels in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben.

Figurenbeschreibung

Figur 1 zeigt schematisch eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Mikroskops,

Figur 2 zeigt das Ausgangssignal eines Detektors einer Autofokuseinrichtung eines erfindungsgemäßen Mikroskops bei Verschiebung einer Probenanordnung im Objektraum des Mikroskops in einer Richtung in einer möglichen

Ausführungsform,

Figur 3 zeigt schematisch eine Möglichkeit zur Erzeugung einer Profilkarte für eine Probenanordnung und

Figur 4 zeigt schematisch eine Ausführungsform einer Probenanordnung mit einer Möglichkeit der Bestimmung eines möglichen Arbeitsbereichs.

Die Figuren werden übergreifend beschrieben. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen gleiche oder gleichartige Elemente. Die Ausführungsform gemäß Figur 1 wurde bereits weiter oben zur Erläuterung des Aufbaus und der Funktionsweise einer triangulierenden Autofokuseinrichtung beschrieben, wobei nunmehr eine eine solche Autofokuseinrichtung verwendende vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung näher erläutert werden soll. Die triangulierende Autofokuseinrichtung ist insgesamt mit 2 bezeichnet. Sie umfasst zumindest eine

Autofokussierungslichtquelle 19 zur Erzeugung des Messstrahls 30, den

Strahlteiler 20 zur Umlenkung des Messstrahls 30 in Richtung Objektebene 16 sowie einen Detektor 28, auf den der an der Objektebene 16 reflektierte

Messstrahl 32 auftrifft ln der oben bereits erläuterten Art und Weise kann eine Verschiebung der Objektebene 16 nach 16' von dem Detektor 28 detektiert werden, da sich der reflektierte Messstrahl 32 in den reflektierten Messstrahl 32' verschiebt. Im Normalbetrieb eines Mikroskops 1 wird eine derartige

Verschiebung der Objektebene dadurch kompensiert, dass die

Autofokuseinrichtung 2 den Motor 27 ansteuert, der das Mikroskopobjektiv 10 in z-Richtung derart verschiebt, dass der Abstand zwischen Objektiv 10 und

Objektebene unverändert bleibt. Alternativ oder zusätzlich kann bei einer

Verschiebbarkeit der Objektebene 16 in z-Richtung, beispielsweise durch einen in z-Richtung verschiebbaren Mikroskoptisch, eine Verschiebung der Objektebene 16 in z-Richtung erfolgen.

Das in Figur 1 dargestellte Mikroskop 1 weist neben diesen bereits erläuterten Elementen außerdem eine Verschiebeeinrichtung 3 zur Verschiebung einer auf der Objektebene 16 befindlichen Probenanordnung (in Figur 1 nicht dargestellt) in zumindest eine Richtung senkrecht zur optischen Achse 8 auf. Bei dieser

Verschiebeeinrichtung 3 kann es sich um einen x-y-Mikroskoptisch handeln. Die x- y-Richtungen sind in Figur 1 entsprechend gekennzeichnet. Das Mikroskop 1 umfasst weiterhin eine Bestimmungseinrichtung 4 zur automatischen Ermittlung von Positionen, PI bis P8 (vergleiche Figur 2), auf der Probenanordnung, wobei die Bestimmungseinrichtung 4 derart ausgebildet ist, dass diese Positionen mittels während einer Verschiebung der Probenanordnung in eine Richtung erzeugten Ausgangssignalen des Detektors 28 der Autofokuseinrichtung 2 bestimmt werden. Hierzu ist die Bestimmungseinrichtung 4 mit dem Detektor 28 zur

Signalübertragung verbunden, wobei diese Verbindung mit Kabel oder kabellos erfolgen kann. Die Bestimmung von Positionen auf der Probenanordnung erfolgt zweckmäßigerweise vor dem Beginn des Normalbetriebs des Mikroskops 1, insbesondere zur Festlegung eines geeigneten Arbeitsbereichs, also

Probenbereichs zur Probenuntersuchung, für diesen Normalbetrieb. Die

Bestimmung von Positionen auf der Probenanordnung erfolgt somit vor dem zweckbestimmten Betrieb der Autofokuseinrichtung 2 zur Einstellung bzw. zum Halten des Fokus. Während der automatischen Ermittlung von Positionen auf der Probenanordnung ist somit die Autofokuseinrichtung 2 nicht dazu ausgelegt, etwaige Verschiebungen des Autofokus-Messstrahls 30 in z-Richtung aufgrund der in einer Richtung abgetasteten Probenanordnung etwa durch motorische

Verschiebung des Mikroskopobjektivs 10 zu kompensieren. Vielmehr werden die vom Detektor 28 der Autofokuseinrichtung 2 erzeugten Ausgangssignale zur automatischen Ermittlung markanter Positionen auf der vermessenen

Probenanordnung verwendet. Dies sei unter Heranziehen der Figur 2 näher erläutert.

Figur 2 zeigt schematisch die bei Verschiebung einer Probenanordnung in eine Richtung erzeugten Ausgangssignale bzw. den zeitlichen Verlauf des

Ausgangssignals des Detektors 28 der in Figur 1 gezeigten Autofokuseinrichtung 2. Beispielsweise wird der x-y-Mikroskoptisch 3 aus Figur 1 hierzu in x-Richtung entlang der langen Kante einer Probenanordnung (vgl. Figur 4) verfahren, während die Ausgangssignale der Autofokuseinrichtung 2 ausgewertet werden ln dem in Figur 2 dargestellten Beispiel umfasst die Probenanordnung einen

Halterahmen, innerhalb dessen ein Objektträger fixiert ist, wobei auf dem

Objektträger ein Deckglas aufgebracht ist. Zwischen Objektträger und Deckglas befindet sich üblicherweise die zu untersuchende Probe.

Solange sich zwischen Mikroskopobjektiv 10 und Objektebene 16 kein Objekt befindet, wird der Detektor 28 kein Signal ausgeben. Sobald bei weiterer

Verschiebung der Probenanordnung die Kante des verstellbaren Halterahmens über das Objektiv 10 gefahren wird, empfängt der Detektor 28 ein Signal und gibt aufgrund der eingetretenen Höhen- und/oder Materialänderung ein entsprechendes Ausgangssignal aus (erste Flanke), wodurch die Position der Kante des Halterahmens bekannt ist. ln Figur 2 bezeichnet PI den Startpunkt der

Verschiebung der Probenanordnung beispielsweise in x-Richtung und P2 die erste Kante des Halterahmens. P3 bezeichnet den Beginn des Objektträgers (zweite Flanke), der in dem dargestellten Fall eine abgeklebte Glasfläche aufweist. P4 bezeichnet den Beginn des Deckglases (dritte Flanke) und P5 dessen Ende (vierte Flanke). P6 bezeichnet den Endpunkt des Objektträgers und den Anfangspunkt des Halterahmens (fünfte Flanke). P7 bezeichnet den Endpunkt des Halterahmens (sechste und letzte Flanke), darüber hinaus gibt der Detektor 28 mangels Reflex des Messstrahls 30 kein Ausgangssignal. P8 bezeichnet schließlich das Ende des Verfahrbereichs. Die Positionen PI bis P8 können zusammen mit den zugehörigen Tischkoordinaten gespeichert werden und als (eindimensionales) Profil der Probenanordnung interpretiert werden. Die Auswertung des Profils erlaubt Rückschlüsse auf Position aber auch Beschaffenheit der Probenanordnung, da die Beschaffenheit der Oberfläche der Probenanordnung sich auf die Signalstärke des reflektierten Messstrahls 32 und somit auch des Ausgangssignals des Detektors 28 auswirkt.

Wenn die Abszisse der Figur 2 in Tischkoordinaten angegeben bzw. umgerechnet wird, ergeben sich aus dem in Figur 2 gezeigten Profil die Lage des Halterahmens zwischen P2 und P7, die Lage des Objektträgers zwischen P3 und P6 sowie die Lage des Deckglases zwischen P4 und P5 in Tischkoordinaten. Der Arbeitsbereich für die anschließende mikroskopische Untersuchung kann nun auf den innersten Bereich zwischen P4 und P5 oder einen Unterbereich dieses Bereichs festgelegt werden. Anschließend erfolgt die mikroskopische Untersuchung innerhalb des festgelegten Arbeitsbereichs, wobei hierzu die Autofokuseinrichtung 2 ihrem ursprünglichen Verwendungszweck wieder zugeführt wird. Ist der Tisch auf dem Arbeitsbereich positioniert, erfolgt eine Fokuskorrektur in z-Richtung, hierzu wird mit der Autofokuseinrichtung 2 ein zuvor kalibrierter z-Wert eingeregelt, welcher im Fokusbereich des Mikroskops 1 liegt und anschließend um die Dicke des Deckglases korrigiert wird. Diese Vorgehensweise ist an sich bekannt. Bei dem Mikroskop 1 kann es sich um ein aufrechtes Mikroskop, wie in Figur 1 dargestellt, handeln oder aber um ein inverses Mikroskop. Letztere Mikroskope werden häufig zur Untersuchung dünner biologischer Proben eingesetzt.

Während der oben beschriebenen Ermittlung des Profils der Probenanordnung können in vorteilhafter Weise parallel Bilder über eine Bilderzeugungseinrichtung 5 des Mikroskops 1 aufgenommen werden, wie in Figur 1 schematisch dargestellt. Anstelle von Bildern kann es ausreichend sein, lediglich Helligkeits- und/oder Kontrastverläufe aufzunehmen. Eine Kamera 17 der Bilderzeugungseinrichtung 5 ist hier mit ihrer lichtsensitiven Detektorfläche in der Bildebene 14 des

Mikroskops 1 schematisch angeordnet. Die erzeugten Bilder werden mittels einer Bildauswertungseinrichtung 6 insbesondere auf Helligkeitsänderungen

untersucht. Die Änderungen können jeweils gegenüber dem vorhergehenden Bild oder gegen ein Vergleichsbild bestimmt werden. Liegt eine Helligkeitsänderung vor, wird diese Information zusätzlich mit der entsprechenden Tischposition und dem zugehörigen Wert des Ausgangssignals des Detektors 28 verknüpft. Bei dieser Vorgehensweise kann beispielsweise der Beginn einer Probe während der

Verschiebung der Probenanordnung innerhalb des Bereichs des Deckglases, also beispielsweise innerhalb des Bereichs der Positionen P4 und P5 gemäß Figur 2, detektiert werden. In gleicher Weise kann das Ende der Probe innerhalb des Bereichs des Deckglases detektiert werden. Auf diese Weise erhält man die Abmessung der Probe in Verschieberichtung. Diese Information kann wiederum auf den festzulegenden Arbeitsbereich zur Probenuntersuchung angewendet werden.

Figur 3 zeigt nun eine vorteilhafte Erweiterung zur Erstellung einer Profilkarte über die gesamte Probenanordnung bzw. über wesentliche Teile dieser

Probenanordnung. Die Probenanordnung selbst ist mit 40 bezeichnet. Sie besteht in diesem Ausführungsbeispiel wiederum aus einer Halteeinrichtung bzw. einem Halterahmen 41, einem Probenträger bzw. Objektträger 42 und einem Deckglas 43. Zwischen Deckglas 43 und Objektträger 42 ist eine zu untersuchende Probe angeordnet. Interessierende Probenpunkte sind mit X bezeichnet (points of interest). Ohne Beschränkung der Allgemeinheit kann die lange Kante der

Probenanordnung 40 als x-Richtung und die hierzu senkrechte kurze Kante der Probenanordnung 40 als y-Richtung definiert werden. An verschiedenen Stellen in y-Richtung aufgenommene Profile von Ausgangssignalen des Detektors 28 der Autofokuseinrichtung 2 sind in Figur 3 eingezeichnet. Innerhalb des Objektträgers 42 aufgenommene Profile entsprechen dem im Zusammenhang mit Figur 2 erläuterten Profil. Außerhalb dieses Bereichs aufgenommene Profile zeigen als Positionen lediglich Beginn und Ende des Halterahmens, entsprechend den Punkten P2 und P3 bzw. P6 und P7 aus Figur 2. Durch engmaschige Messung in y- Richtung kann man auf diese Weise eine zweidimensionale Profilkarte erhalten, aus der die Begrenzungspunkte des Deckglases 43 in beiden Richtungen (x, y) entnommen werden können. Der Arbeitsbereich für die spätere Untersuchung der Probe kann sich dann innerhalb dieser Begrenzungspunkte halten. Durch zusätzliche Bildaufnahme oder Aufnahme von Helligkeitsverläufen , wie oben beschrieben, kann auf diese Weise auch die Begrenzung der Probe ermittelt werden und der Arbeitsbereich für die spätere mikroskopische Untersuchung entsprechend festgelegt werden.

Figur 4 zeigt schließlich eine Ausführungsform einer Probenanordnung 40, wie sie zu den im Zusammenhang mit den Figuren 2 und 3 beschriebenen Profilen führt. Die Probenanordnung 40 umfasst wiederum einen Halterahmen 41 als

Halteeinrichtung, einen Objektträger 42 als Probenträger und (hier nicht dargestellt) ein auf dem Objektträger 42 befindliches Deckglas. Die verstellbare Aufnahme des Halterahmens 41 ist mit 44 bezeichnet. Durch die verstellbare Aufnahme 44 kann eine Positionierung des Objektträgers 42 entlang der längeren Längsseite der Probenanordnung 40 erfolgen. Entsprechend gekennzeichnet sind mögliche Positionen 45 des Objektträgers 42. Sind die Abmessungen der Probenanordnung 40 bekannt, können diese in einem Speicher oder besser in einer Datenbank abgelegt werden. Aus dieser Datenbank kann der Nutzer die Art der Halteeinrichtung 41 oder allgemeiner der

Probenanordnung 40 auswählen, die er für die Aufnahme des Probenträgers 42 (Glasslide, Petrischale oder Wellplatte) verwendet. Die Datenbank liefert die Abmessungen und die festen Achsen der Probenanordnung 40. Durch diese Angaben kann die mögliche Position 45 des Objektträgers 42 bereits eingeschränkt werden. Der Mikroskoptisch kann dann in die Startposition PI gefahren werden, welche sich in der Mitte der kleineren Kante des Objektträgers 42 und am linken Rand der längeren Kante des möglichen Positionsbereichs 45 befindet.

Anschließend erfolgt die Messung, wie anhand von Figur 2 und/oder Figur 3 beschrieben. Nach Festlegung eines Arbeitsbereichs kann die eigentliche mikroskopische Untersuchung beginnen. Die vorliegende Erfindung eignet sich in besonderer Art und Weise zur Definition eines Arbeitsbereichs, insbesondere wenn eine visuelle Bestimmung dieses Arbeitsbereichs nicht möglich oder zu umständlich ist.

Bezugszeichenliste

1 Mikroskop

2 Autofokuseinrichtung

3 Verschiebeeinrichtung, x-y-Mikroskoptisch

4 Bestimmungseinrichtung

5 Bilderzeugungseinrichtung

6 Bildauswertungseinrichtung

8 optische Achse

10 Mikroskopobj ektiv

12 Tubuslinse

14 Bildebene

16, 16' Objektebene

17 Kamera

19 Messstrahllichtquelle, Autofokussierungslichtquelle

20 Strahlteiler

27 Motor

28 Detektor, Autofokus-Detektor

30 Messstrahl, Autofokus-Messstrahl

32, 32' reflektierter Messstrahl

40 Probenanordnung

41 Halteeinrichtung, Halterahmen

42 Probenträger, Objektträger

43 Deckglas

44 verstellbare Aufnahme

45 mögliche Positionen

A, B, B', C, D Punkt

x, y, z Raumrichtung

a Winkel