Domaine technique de l’invention

L’invention se rapporte à l’analyse des effets des substances chimiques sur le corps humain ou animal.

L’invention a plus spécifiquement pour objet un procédé permettant de détecter l’activité mutagène de substances chimiques à des doses de l’ordre du picogramme (1 pg = 10 ² g).

Etat de la technique antérieure

En 1973, le Professeur Bruce Ames et son équipe ont mis au point un test de mutagénèse, dénommé depuis le test d'Ames, qui consiste à examiner si une substance chimique est capable d'induire des mutations spécifiques chez différentes souches de Salmonella typhimurium porteuses de mutations dans divers gènes gouvernant la synthèse de l'acide aminé histidine. Ces mutations préexistantes agissent comme des points chauds pour les mutagènes qui causent des dommages à l'ADN via différents mécanismes. Ces mutations rendent les souches auxotrophes à l’histidine (souches dites His ), c’est à dire incapables de pousser sur un milieu sans histidine. Elles réversent avec une fréquence très faible, spontanément vers His ⁺ , permettant à ces cellules de retrouver leur capacité à se développer sur un milieu sans histidine. Cette fréquence de réversion peut augmenter en exposant les bactéries I Iis à des agents mutagènes. Ainsi, le test d'Ames permet de quantifier l'induction de ces mutations réverses. Lors de l’exposition de ces souches à un agent mutagène en présence ou en l'absence d'un système d'activation métabolique exogène (fraction S9 du foie), leur incapacité à pousser sur un milieu sans histidine est corrigée, en restaurant leur indépendance ou prototrophie à l’histidine. La correction peut se produire sur le site de la mutation préexistante ou à proximité. Différentes souches sont actives avec différentes classes de composés. Référence est faite à cet égard à la revue D. M. Maron et B. N. Ames publiée en 1983 (Référence 1)

La ligne directrice de l’OCDE N° 471 indique que l’essai de mutation réverse (Référence 2) doit être réalisé sur au moins cinq souches de Salmonella typhimurium porteuses d’une mutation dans un des gènes gouvernant la synthèse de l'acide aminé histidine, incluant obligatoirement les souches TA1535, TA1537 ou TA97a ou TA97, T98 etTAlOO, avec lesquelles la fiabilité et la reproductibilité de la réponse entre laboratoires ont été démontrées . La souche Salmonella typhimurium TA102 ou la souche Escherichia Coli (E.coli) WP2 uvrA (PKM101) doit aussi être utilisée pour pouvoir détecter certains mutagènes oxydants, agents de réticulation ou des hydrazines.

Des mutations ou altérations génétiques additionnelles les rendent plus sensibles à certains mutagènes chimiques particuliers. Référence est faite à cet égard à la revue de K. Mortelsmans et E. Zeiger publiée en 2000 (Référence 3). Le protocole standard d'Ames comprend une méthode de préincubation qui consiste à exposer pendant 20 à 30 minutes dans 2 cm ³ (2 ml) de tampon phosphate, 100 mm ³ (100 pi) d'une culture de souche de Salmonella typhimurium porteuse d’une mutation dans un des gènes gouvernant la synthèse de l'acide aminé histidine, à 100 mm ³ (100 pL) de substance d'essai dissoute dans de l'eau ou du DMSO en présence, soit de 500 mm ³ (500 pl) d’un système d'activation métabolique (fraction S9 de foie de rat), soit d'un tampon phosphate sans système d’activation métabolique. Après une incubation supplémentaire facultative de vingt à trente minutes à 37°C, les cellules exposées sont mélangées avec 2 cm ³ (2 ml) de top agar à 40-50°C contenant une faible quantité d'histidine et étalées sur des plaques de gélose solide. Après quarante-huit heures d'incubation à 37°C, les boites sont examinées, la toxicité est appréciée par l’observation du tapis bactérien et le nombre de colonies est enregistré. Chaque composé est testé en six doses couvrant une plage d'au moins trois logarithmes, chaque dose étant triplement testée. Une altération du tapis bactérien avec ou sans diminution du nombre de révertants indique une toxicité. Une augmentation du taux de réversion de plus de deux fois comparé au bruit de fond (taux de réversion observé avec le solvant), indique que le composé testé est mutagène.

Le test d'Ames traditionnel est utilisé dans le monde entier comme procédé pour détecter le potentiel mutagène de nouveaux composés. Il existe un grand nombre de variétés de test d’Ames. Un test réglementaire OCDE est réalisé directement sur les 5 souches TA98, TA100, TA97 ou TA97a ou TA1537, TA1535, TA102 ou E.Coli ; cela permet d’évaluer un large éventail de produits ayant des mécanismes d’action différents TA98/ TA1535, TA100/TA1537, TA102 ou E.coli, avec et sans la fraction S9, et répété le cas échéant pour confirmer un résultat positif. Une faible réponse sur la souche TA97 peut être confirmée avec la souche TA1537. Les souches TA102 et TA104 peuvent être utilisées si l'on soupçonne que le produit chimique peut induire des dommages oxydatifs ou être un agent de réticulation de l'ADN.

Cependant le test d'Ames tel qu’explicité au paragraphe précédent, est long dans sa mise en œuvre et il ne permet pas de détecter l’activité mutagène potentielle de composés présents à des quantités inférieures au microgramme.

Les inventeurs se sont donc attachés à mettre au point une méthode dérivée du test d’Ames qui permet de détecter l’activité mutagène de très petites quantités de composés chimiques, de l’ordre de la dizaine de picogrammes jusqu’au nanogramme.

Exposé de l’invention

L’invention vise à remédier à tout ou partie des inconvénients mentionnés ci-dessus.

L’invention a donc pour objet un procédé pour détecter le caractère mutagène potentiel d’une substance chimique, dénommée ci-après substance chimique d’essai, mettant en œuvre les souches bactériennes de Salmonella typhimurïum porteuses d’une mutation dans un des gènes gouvernant la synthèse de l'acide aminé histidine, dénommées respectivement souche TA97a, souche TA98, souche TA100, souche TA1535 et souche TA102, ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il comprend, pour chacune des souches susmentionnées, dénommées ci-après souches d’essai, les étapes suivantes :

- Une étape A. de quantification par une réaction de polymérisation en chaîne, dénommée ci-après qPCR, de la proportion de gènes sauvages présents dans un premier échantillon d’une élution d’acides désoxyribonucléiques, ci-après dénommés ADNs, extraits d’une population de ladite souche d’essai, après qu’elle ait été exposée à ladite substance chimique d’essai, ledit premier échantillon ayant été en outre, préalablement à ladite qPCR, additionné d’une proportion non nulle d’un mélange d’amorces et de sondes spécifiques pour mettre en évidence les bactéries révertantes de ladite souche d’essai ;

- Une étape B. de quantification par qPCR, de la proportion de gènes mutés, présents dans un deuxième échantillon de la même élution d’ADNs que celle mise en œuvre à l’étape A., ledit deuxième échantillon ayant été en outre, préalablement à ladite qPCR, additionné d’une proportion non nulle d’un mélange d’amorces et de sondes spécifiques pour mettre en évidence les bactéries mutées de ladite souche d’essai ;

- Une étape C. mise en œuvre par ordinateur, de détermination dans l’échantillon de ladite élution d’ADNs soumis à l’étape A. et dans l’échantillon de ladite élution d’ADNs soumis à l’étape B., des quantités de gènes sauvages (WtEXp) et de gènes mutés (MUÎEXP) ;

- Une étape D. mise en œuvre par ordinateur, de calcul du rapport :

REXP ⁼ WtEXp/ (WtEXp+MutEXp)

- Une étape E. de quantification par qPCR, de la proportion de gènes sauvages, présent dans un premier échantillon d’une élution d’ADNs extraits de la population de la même souche d’essai que celle mise en œuvre aux étapes A. et B. précédentes et qui a été uniquement exposée au solvant ayant servi à la dissolution de ladite substance chimique d’essai, ledit premier échantillon ayant été en outre, préalablement à ladite qPCR, additionné d’une proportion non nulle dudit mélange d’amorces et de sondes spécifiques mentionné à l’étape A. précédente ;

- Une étape F. de quantification par qPCR, de la proportion de gènes mutés, présents dans un deuxième échantillon de la même élution d’ADNs que celle mise en œuvre à l’étape E., ledit deuxième échantillon ayant été en outre, préalablement à ladite qPCR, additionné d’une proportion non nulle dudit mélange d’amorces et de sondes spécifiques mentionné à l’étape B. précédente ; - Une étape G. mise en œuvre par ordinateur, de détermination dans l’échantillon de ladite élution d’ADNs soumis à l’étape E. et dans l’échantillon de ladite élution d’ADNs soumis à l’étape R, des quantités de gènes sauvages (W ÎNEG) et de gènes mutés (MUÎNEG) ; et

- Une étape H. mise en œuvre par ordinateur, de calcul du rapport :

RNEG ⁼ WÎNEG/ (WINEG+MUÎNEG) -

Le procédé tel que défini ci-dessus, permet par une méthodologie dérivant de la qPCR, ou PCR en temps réel, de quantifier le nombre de gènes sauvages et de gènes mutés dans une population de salmonella thyphimurïum après exposition à la substance chimique d’essai et de comparer les proportions obtenues à celles observées en l’absence d’exposition à la substance d’essai. Les réactions de qPCR ciblent l’ADN total, qu’il soit issu de cellules mortes ou vivantes.

La proportion de gènes sauvages et de gènes mutés est déterminée en comparant, pour une souche donnée, les résultats de deux qPCR distinctes réalisées avec différents mélanges d’amorces et de sondes, un premier mélange spécifique du gène sauvage non muté et un second mélange spécifique du gène muté.

Les amorces oligonucléotidiques sont des oligonucléotides utilisés pour s'hybrider à une région d'un acide nucléique cible, afin de faciliter la polymérisation d'un acide nucléique complémentaire. N'importe quelle amorce peut être synthétisée par l’homme du métier. Les amorces spécifiques de chaque gène sont préparées en prenant comme référence la séquence de l’opéron histidine de salmonella typhimurïum (ncbi accession number : JO1804.1) de manière à amplifier la région du gène qui couvre la mutation de chacune des souches TA97a, TA98, TA100, TA102 et TA1535.

Les sondes nucléotidiques sont des segments de nucléotides qui permettent de rechercher de manière spécifique un fragment d’acide nucléique que l’on désire étudier. N'importe quelle sonde peut être synthétisée par l’homme du métier. Dans le cadre de présente invention, les sondes utilisées sont des sondes froides et des séquences d’ADN.

A chaque souche correspondent deux mélanges d’amorces et de sondes spécifiques :

- Le mélange TA100WT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche et TA100 et le mélange TA100MUT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche,

- Le mélange TA98WT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche TA98 et le mélange TA98MUT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche,

- Le mélange TA102WT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche TA102 et le mélange TA102MUT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche, - Le mélange TA97aWT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche TA97a et le mélange TA97aMUT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche, et

- Le mélange TA1535WT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche TA1535, et le mélange TA1535MUT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche.

Il y a donc deux qPCR réalisées pour chaque échantillon de souche. Ces amplifications sont effectuées avec un appareil approprié, notamment celui commercialisé par Applied Biosystems, le QuantStudio™ 3.0.

Dans le procédé tel que défini ci-dessus, les étapes C. et G. mises en œuvre par ordinateur, sont généralement effectuées en utilisant un logiciel associé à l’appareil de qPCR, notamment le logiciel de conception et d’analyse développé par la société QuantStudio et conçu pour analyser les données collectées à partir des systèmes de PCR (QuantStudio™ Design & Analysis Desktop software en langue anglaise). L’étape C. permet de déterminer le nombre de gènes sauvages (WtEXp) et de gènes mutés (MutEXp), pour chacune des cultures des souches d’essai qui a été exposée à ladite substance chimique d’essai pour en détecter l’activité mutagène potentielle. L’étape G. quant à elle, permet de déterminer le nombre de gènes sauvages (WINEG) et de gènes mutés (MUÎNEG), pour chacune des cultures des souches d’essai après exposition au solvant ayant servi à la dissolution de ladite substance chimique d’essai (Témoin négatif).

Les étapes D. et H. mises en œuvre par ordinateur, sont aussi généralement effectuées en utilisant le même logiciel que celui utilisé pour les étapes C. et G. susmentionnées. Elles permettent de calculer, pour chacune des souches testées, respectivement le rapport REXP entre le nombre de gènes révertants et le nombre de gènes totaux, dans les cas où elle a été exposée à ladite substance chimique d’essai pour en détecter l’activité mutagène potentielle et le rapport RNEG, dans le cas où elle a été uniquement exposée au solvant de la substance chimique dont il est souhaité détecter l’activité mutagène potentielle (Témoin négatif). Ces deux rapports sont inférieurs ou égaux à un (REXP <1 et RNEG — 1) •

Grâce au procédé tel que défini ci-dessus, il est possible de comparer pour chacune des souches d’essai mentionnées, les rapports REXP et RNEG- Lorsque, pour au moins une des souches d’essai, le rapport REXP/RNEG est supérieur à 1, un effet mutagène de la substance chimique est détecté.

Selon un mode particulier du procédé tel que défini ci-dessus, celui-ci comprend une étape I. de calcul du rapport REXP/RNEG. et, plus particulièrement une étape I. mise en œuvre par ordinateur, de calcul du rapport REXP/RNEG.

Selon ce mode particulier, l’étape I. mise en œuvre par ordinateur, est aussi généralement effectuée en utilisant le même logiciel que celui utilisé pour les étapes C. D„ G. et H. susmentionnées. Selon un autre mode particulier , le procédé tel que défini précédemment est caractérisé en ce qu’il comprend en outre, pour chacune des dites souches d’essai, les étapes suivantes :

- Une étape T. de quantification par qPCR, de la proportion de gènes sauvages, présents dans un premier échantillon d’une élution d’ADNs extraits de la population de la même souche d’essai que celle mise en œuvre aux étapes A., B. E. et F. précédentes, après qu’elle ait été exposée à une substance chimique de référence, ledit premier échantillon ayant été en outre, préalablement à ladite qPCR, additionné d’une proportion non nulle dudit mélange d’amorces et de sondes spécifiques mentionné à l’étape A. ;

- Une étape K. de quantification par qPCR, de la proportion de gènes mutés, présents dans un deuxième échantillon de la même élution d’ADNs que celle mise en œuvre à l’étape J„ ledit deuxième échantillon ayant été en outre, préalablement à ladite qPCR, additionné d’une proportion non nulle dudit mélange d’amorces et de sondes spécifiques mentionné à l’étape B. ;

- Une étape L. mise en œuvre par ordinateur, de détermination dans l’échantillon de ladite élution d’ADNs soumis à l’étape T. et dans l’échantillon de ladite élution d’ADNs soumis à l’étape I<„ des quantités de gènes sauvages (Wtpos) et de gènes mutés (Mutpos) ;

- Une étape M. mise en œuvre par ordinateur, de calcul du rapport :

Rpos ⁼ Wtpos/ (Wtpos+Mutpos)-

Selon cet aspect particulier du procédé tel que défini ci-dessus, l’étape L. mise en œuvre par ordinateur, est effectuée elle-aussi en utilisant un logiciel associé à l’appareil de qPCR, par exemple, le logiciel de conception et d’analyse développé par la société QuantStudio et conçu pour analyser les données collectées à partir des systèmes de PCR (QuantStudio™ Design & Analysis Desktop software en langue anglaise). L’étape L. permet de déterminer le nombre de gènes sauvages (Wtpos) et de gènes mutés (Mutpos), pour chacune des cultures des souches d’essai qui a été exposée à ladite substance chimique de référence pour en détecter l’activité mutagène potentielle (Témoin positif). L’étape M. telle que définie ci-dessus, est elle-aussi généralement effectuée en utilisant le même logiciel que celui utilisé pour l’étape L. C’est une étape de calcul, pour chacune des souches testées, respectivement du rapport RPOS entre le nombre de gènes révertants et le nombre de gènes totaux, dans les cas où elle a été exposée à ladite substance chimique de référence pour en détecter l’activité mutagène potentielle (Témoin positif). Ce rapport est inférieur ou égal à un (R _P os<l).

Par substance chimique de référence, on désigne une substance chimique pour laquelle il a été détectée une activité mutagène vis-à-vis d’une ou de plusieurs des souches d’essai mises en œuvre dans le procédé tel que défini ci-dessus. Il est possible de comparer pour chacune des souches d’essai mentionnées, les rapports REXP et RPOS et d’évaluer ainsi l’effet mutagène par rapport à celui de ladite substance chimique de référence. Ces substances chimiques de référence mises en œuvre aux étapes J. et I<„ sont spécifiques à une, plusieurs ou à l’ensemble des souches d’essai mises en œuvre dans le procédé tel que défini ci-dessus.

Grâce au mode particulier du procédé tel décrit ci-dessus, il est possible de comparer pour chacune des souches d’essai mentionnées, les rapports REXP et RPOS- Lorsque, pour une des souches d’essai, le rapport REXP/RPOS. est supérieur à 1, cela signifie que l’effet mutagène détecté est plus intense que celui de la substance chimique de référence.

Selon un autre mode particulier, le procédé tel que défini ci-dessus, celui-ci comprend une étape N. de calcul du rapport REXP/RPOS- et, plus particulièrement, une étape N. mise en œuvre par ordinateur de calcul du rapport REXP/RPOS-

L’étape N. telle que définie ci-dessus, est elle-aussi généralement effectuée en utilisant le même logiciel que celui utilisé pour les étapes L. et M..

L’invention a plus particulièrement pour objet le procédé tel que défini précédemment, caractérisé en ce qu’il comprend en outre, pour chacune des dites souches d’essai :

- Une étape O. de préparation des élutions d’ADNs extraits de la population de ladite souche d’essai, dont les échantillons sont mis en œuvre aux étapes A. B., E. et F. et, si désiré, aux étapes J. et K. précédentes, ladite étape O. comportant les sous-étapes suivantes :

- Une sous-étape OL de préparation d’une culture de ladite souche d’essai en l’introduisant dans un milieu de culture liquide supplémenté, soit en ampicilline pour chacune des dites souches TA97a, TA98, TA100, TA102 et TA1535, soit en ampicilline et en tétracycline pour ladite souches TA102, puis en y laissant croître ladite colonie dans des conditions de lumière, de température et de durée appropriées, pour obtenir au sein de ladite culture bactérienne, entre 10 ⁸ et 1O ^1CI cellules par centimètre cube de culture ;

- Une sous-étape 02. de préparation d’une solution témoin négatif sans activateur métabolique, en mélangeant entre 0,5 volume et 2,5 volumes, plus particulièrement entre 0,75 volume et 1,5 volumes de ladite culture de la souche d’essai préparée à la sous-étape OL avec entre 100 volumes et 200 volumes d’un milieu de culture liquide, entre 2 volumes et 10 volumes d’une solution aqueuse tamponnée et entre 0,4 volume et 2 volumes du solvant utilisé pour préparer la solution initiale de ladite substance chimique d’essai ;

- Une sous-étape 03. de préparation, d’une solution témoin négatif avec activateur métabolique, en mélangeant entre 0,5 volume et 2,5 volumes, plus particulièrement entre 0,75 volume et 1,5 volumes de ladite culture de la souche d’essai préparée à la sous-étape OL avec entre 100 volumes et 200 volumes du même milieu de culture liquide que celui utilisé à la sous-étape 02 précédente, entre 2 volumes et 10 volumes d’un activateur métabolique et entre 0,4 volume et 2 volumes du solvant utilisé pour préparer la solution initiale de ladite substance chimique d’essai ;

- Une sous-étape 04. de préparation d’une solution sans activateur métabolique, de ladite substance chimique d’essai, en mélangeant entre 0,5 volume et 2,5 volumes, plus particulièrement entre 0,75 volume et 1,5 volumes de ladite culture de la souche d’essai préparée à la sous-étape Ol. avec entre 100 volumes et 200 volumes du même milieu de culture liquide que celui utilisé à la sous-étape 02 précédente, 2 volumes et 10 volumes d’une solution aqueuse tamponnée et entre 0,4 volume et 2 volumes d’une solution initiale comprenant entre 2,5 pg/ cm ³ et 300 pg/ cm ³ de ladite substance chimique d’essai;

- Une sous-étape 05. de préparation d’une solution avec activateur métabolique, de ladite substance chimique d’essai, en mélangeant entre 0,5 volume et 2,5 volumes, plus particulièrement entre 0,75 volume et 1,5 volumes de ladite culture de la souche d’essai préparée à la sous-étape OU avec entre 100 volumes et 200 volumes du même milieu de culture liquide que celui utilisé à la sous -étape 02 précédente, entre 2 volumes et 10 volumes d’un activateur métabolique et entre 0,4 volume et 2 volumes d’une solution initiale comprenant entre 2,5 pg/cm ³ et 300 pg/cm ³ de ladite substance chimique d’essai ;

- Optionnellement une sous-étape 06. de préparation, d’une solution témoin positif sans activateur métabolique, en mélangeant entre 0,5 volume et 2,5 volumes, plus particulièrement entre 0,75 volume et 1,5 volumes de ladite culture de la souche d’essai préparée à la avec entre 100 volumes et 200 volumes du même milieu de culture liquide que celui utilisé à la sous-étape 02 précédente, entre 2 volumes et 10 volumes d’une solution aqueuse tamponnée et entre 0,4 volume et 2 volumes d’une solution comprenant entre 2,5 pg/ cm ³ et 300 pg/ cm ³ de ladite substance chimique de référence ; et

- Optionnellement une sous-étape 07. de préparation, d’une solution témoin positif avec activateur métabolique, en mélangeant entre 0,5 volume et 2,5 volumes, plus particulièrement entre 0,75 volume et 1,5 volumes de ladite culture de la souche d’essai préparée à la avec entre 100 volumes et 200 volumes du même milieu de culture liquide que celui utilisé à la sous -étape 02 précédente, entre 2 volumes et 10 volumes d’un activateur métabolique et entre 0,4 volume et 2 volumes d’une solution comprenant entre 2,5 pg/cm ³ et 300 pg/ cm ³ de ladite substance chimique de référence ;

- Une sous-étape 08. de préincubation de chacune des solutions préparées aux sous-

02.. 03 04. et 05, et optionnellement aux sous-étapes 06. et O7„ en les laissant au repos, à l’abri de la lumière, pendant une durée comprise entre huit et seize heures, à une température comprise entre 35°C et 45°C et plus particulièrement comprise entre 36°C et - Une sous-étape 09. d’incubation de chacune des solutions issues de la sous -étape 08. de préincubation, en mélangeant 1 volume de chacune d’entre elles avec entre 15 volumes et 25 volumes d’un milieu de culture et entre 3 volumes et 6 volumes d’une solution aqueuse tamponnée, puis en laissant chacune des dilutions résultantes au repos, à l’abri de la lumière pendant une durée comprise entre soixante et quatre-vingt-quatre heures, à une température comprise entre 35°C et 45°C et plus particulièrement comprise entre 36°C et 38°C;

- Optionnellement une sous-étape OlO. de congélation de chacune des solutions issues de la sous-étape 09. d’incubation ;

- Optionnellement une sous-étape OU. de décongélation de chacune solutions congelées issues de la sous -étapes OlO. ;

- Une sous-étape 012. d’extraction puis d’élution des ADNs à partir de chacune des solutions, soit issues de la sous-étape 09. d’incubation, soit décongelées à l’issue de la sous- étape Oll„ pour obtenir les élutions mises en œuvre aux étapes A., B., E., et F. et optionnellement aux étapes J^. et K, d’ADNs extraits des populations de chacune des dites souches d’essai.

Par milieu de culture liquide, on désigne de préférence un milieu liquide à température ambiante qui favorise la croissance des bactéries de type « salmonella typhimurium ». Un tel milieu est accessible à l’homme du métier ou il peut être aisément préparé par lui.

Dans la sous -étape Ol. du procédé tel que défini ci-dessus, lesdites souches d’essai sont généralement mises à disposition sous une forme congelée dans un cryotube ou sous forme de colonies isolées.

Par conditions de lumière, de température et de durée appropriées, pour obtenir au sein de ladite culture bactérienne, entre 10 ⁸ et 1O ^1CI cellules par centimètre cube de culture, on signifie plus particulièrement à la sous-étape Ol. du procédé tel que défini précédemment, que la culture a lieu sous agitation pendant environ 10 heures à l’abri de la lumière à une température d’environ 37°C.

Selon un aspect plus particulier de la présente invention, chacune des cultures des dites souches d’essai préparées à la sous -étape Ol. du procédé tel que défini ci-dessus, comportent entre 5.10 ⁸ et 5.10 ⁹ par centimètre cube de cellules de ladite souche d’essai.

Par solution aqueuse d’activateur métabolique, on entend principalement dans l’étape O du procédé tel que défini ci-dessus, une solution aqueuse comprenant 10% volumique d’une fraction surnageante d’un homogénat de foie et de rat identifiée sous le nom de fraction S-9. Une telle solution est dénommée par la suite « S9-Mix ».

La solution aqueuse tamponnée mise en œuvre dans différentes sous-étapes de l’étape O. du procédé tel que défini ci-dessus, permet d’équilibrer les proportions volumiques des solutions aqueuses préparées qui ne comprennent pas d’activateur métabolique. Comme solution aqueuse tamponnée, il y a par exemple le tampon phosphate ou le tampon acétate.

Selon un autre aspect plus particulier de la présente invention, la sous-étape 08. du procédé tel que défini ci-dessus, est effectuée à une température de37°C pendant une nuit.

Selon un autre aspect plus particulier de la présente invention, la sous-étape 09. du procédé tel que défini ci-dessus, est effectuée à une température de37°C pendant 72 heures.

Comme substances chimiques de référence utilisées pour préparer les solutions témoins positifs sans activation métabolique, il y a notamment :

L’acridine-9-amine (Numéro CAS = 90-45-9) pour ladite souche TA97a,

Le 2-nitro-9H-fluorène (Numéro CAS = 607-57-8) pour ladite souche TA98,

Le 4-nitroquinoline-N-oxyde (Numéro CAS = 56-57-5) pour lesdites souches TA97a, TA98, TA100, TA1535 et TA102 ,

La mitomycine C (Numéro CAS = 50-07-7) pour ladite souche TA102, et

L’azoture de sodium (Nombre CAS = 26628-22-8) pour lesdites souches TA 1535 etTAlOO. Comme substance chimique de référence utilisée pour préparer les solutions témoins positifs avec activation métabolique, il y a notamment l’anthracen-2-amine (Nombre CAS = 613-13-8), et le benzo[a]pyrène pour lesdites souches TA97a, TA98, TA100, TA1535 et TA102.

Comme solvants utilisés pour préparer les solutions initiales des dites substances chimiques d’essai et desdites substances chimiques de référence, il y a tout solvant qui n’interfère pas avec lesdites souches d’essai dans les conditions expérimentales mises en œuvre dans le procédé tel que défini ci-dessus. Comme exemples de solvant il y a notamment l’eau, le diméthyl sulfoxyde (DMSO), l’éthanol et l’acétonitrile.

Selon un autre mode particulier, l’invention a pour objet le procédé tel que défini précédemment, caractérisé en ce que la substance chimique de référence mise en œuvre à la sous-étape 06. est l’acridine-9-amine lorsque ladite souche d’essai est la souche TA97a, le 2-nitro-9H-fluorène lorsque ladite souche d’essai est la souche TA98, le 4-nitroquinoline-N-oxyde lorsque ladite souche d’essai est la souche TA100, la Mitomycine C lorsque ladite souche d’essai est la souche TA102 et l’azoture de sodium lorsque ladite souche d’essai est la souche TA1535. et en ce que la substance chimique de référence mise en œuvre à la sous-étape 07. est l’anthracen-2-amine pour toutes lesdites souches d’essai.

Selon un autre mode particulier du procédé tel que défini ci-dessus, la sous-étape 09. d’incubation est effectuée en l’absence de tout milieu de culture solide à une température inférieure à 60°C, et plus particulièrement en l’absence d’agar-agar, ou d’agar-agar modifié. Selon un autre mode particulier du procédé tel que défini ci-dessus, ledit milieu de culture liquide mis en œuvre à chacune des sous-étapes 02 à 07. et ledit milieu de culture liquide mis en œuvre à la sous-étape 09. d’incubation, sont identiques.

Comme exemple de milieu de culture liquide exempt de de tout milieu de culture solide à une température inférieure à 60°C, et plus particulièrement en l’absence d’agar-agar, ou d’agar-agar modifié, il y a le milieu Gencar.

L’invention a plus particulièrement un procédé tel que défini précédemment, dans lequel lesdites substances chimiques d’essai sont analysées à au moins cinq concentrations différentes.

Lorsque les sous-étapes 09. et 012. sont réalisées dans des lieux différents, il est nécessaire d’effectuer la sous-étape 010. de congélation des incubats obtenus à l’issue de la sous-étape 09. puis de transférer les incubats congelés du lieu de mise en œuvre de la sous -étape 09. vers le lieu de mise en œuvre de la sous-étape 012.. puis d’effectuer la sous-étape OÏL de décongélation des incubats congelés, préalablement à la mise en œuvre de la sous-étape 012..

Lorsque les sous-étapes 09. et 012. sont réalisées sur un même lieu et/ ou qu’un transfert de lieu est inutile, il est généralement inutile d’effectuer les sous-étapes 010. et OÏL La sous-étape 012. est alors effectuée à partir de chacun des incubats directement obtenus à l’issue de la sous -étape 09..

La mise en œuvre de la sous-étape 012. du procédé tel que défini précédemment est généralement réalisée en utilisant une trousse du commerce, par exemple la trousse dénommée « Mag-Bind™ Bacterial DNA 96 kit» commercialisé par la société OMEGA Bioteck. Cette sous- étape inclut si nécessaire ou si désiré, une centrifugation des échantillons afin d’en éliminer les surnageants suivi d’un lavage du culot au BBS, qui sera lui-même éliminé par centrifugation. Pour contrôler la réalité et/ ou l’efficacité de l’extraction des ADNs, il est utile d’effectuer une mesure spectrophotomé- trique de l’échantillon avant l’utilisation de la trousse puis une seconde mesure spectrophotomé- trique après élution des ADNs obtenus pour en déterminer la qualité et la concentration finale.

Comme exemple de spectrophotomètre que l’on peut utiliser pour effecteur ces mesures, il y a notamment le nanophotomètre NP80, commercialisé par la société Implen, qui permet de quantifier les ADNs dans des échantillons liquides de volume autour de 0,5 mm ³ (0,5 pi).

L’invention a aussi pour objet un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la souche bactérienne diEscherichia coli porteuse d’une mutation dans un gène gouvernant la synthèse de l’acide aminé tryptophane dénommée souche E.coli WP2 uvrA pKMIOl est mise en œuvre, soit en remplacement ladite souche TA102, soit en complément de l’ensemble des dites souches d’essai listées précédemment.

Selon cet aspect de la présente invention, les étapes A. et E. du procédé mises en œuvre avec ladite souche E.coli WP2 uvrA pKMIOl, sont effectuées avec un mélange d’amorces et de sondes spécifiques pour metre en évidence les bactéries révertantes de cete souche et les étapes B. et F. avec un mélange d’amorces et de sondes spécifiques pour metre en évidence les bactéries mutées de cete souche. De plus, lorsqu’elle est mise en œuvre, la sous-étape Ol. de préparation d’une culture de ladite souche E.coli WP2 uvrA pKMIOl est effectuée en l’introduisant dans un milieu de culture liquide supplémenté, en ampicilline et en tétracycline, puis en y laissant croître ladite colonie dans des conditions de lumière, de température et de durée appropriées, pour obtenir au sein de ladite culture bactérienne, entre 10 ⁸ et 1O ^1CI cellules par centimètre cube de culture.

Comme substances chimiques de référence utilisées pour préparer les solutions témoins positifs lorsque ladite souche mise en œuvre est la souche E.coli WP2 uvrA pKMIOl, il y a notamment le 4-nitroquinoline-N-oxyde en l’absence d’activateur métabolique et l’anthracen-2 -amine ou le benzo[a]pyrène en présence d’activateur métabolique.

Le procédé tel que défini précédemment, peut être avantageusement utilisé pour détecter un éventuel effet mutagène d’une substance chimique. Il est particulièrement utile pour contrôler l’innocuité des composés chimiques couramment mis en œuvre dans les produits du commerce.

C’est pourquoi, selon un dernier aspect, l’invention a pour objet le procédé tel que défini précédemment, dans lequel ladite substance chimique d’essai, dont il est souhaité détecter le caractère mutagène potentiel est un composant de produits de nettoyage, de produits cosmétiques, de produits pharmaceutiques ou de produits industriels comme les laques, les peintures ou les additifs utilisés dans tout genre d’industrie, ledit composant en étant un des excipients ou un des principes actifs.

Le procédé tel que décrit ci-dessus permet ainsi de détecter l’activité mutagène et le caractère toxique de substances chimiques présentes en de très faibles quantités dans des mélanges commerciaux de l’ordre du nanogramme, ce que ne permet pas le test d’Ames classique.

Exemple de mise en œuvre de l’invention

L’exemple suivant illustre l’invention sans toutefois la limiter.

A. Choix des souches et du matériel

L’essai est réalisé sur des souches de Salmonella typhimurïum TA97a, TA98, TA100, TA102 et TA1535 soit en présence, soit en l’absence de S9-Mix dans des plaques 96-puits pour la préincubation puis dans des tubes pour l’incubation. L’incubation est réalisée en milieu liquide sans gélose ni dérivés de gélose. Les plaques 96-puits sont identifiées par le nom de la souche, la date de l’essai, la présence ou l’absence d’activation métabolique et le nom du produit à tester. Tout le matériel utilisé pour l’essai doit être stérile.

B. Choix de l’activateur métabolique : L’activateur métabolique utilisé est la solution S9-Mix dont la composition est indiquée dans le tableau 1 suivant :

Tableau 1

C. Préparation des cultures des souches d’essai TA97a. TA98. TA100, TA1535 et A102 Cl. A partir d’un cryotube congelé

Le volume nécessaire de souche est introduit à raison de 2% en volume (2% v/v) de milieu Gencar (milieu de culture liquide), puis supplémenté en ampicilline à raison de 25 pg/ cm ³ pour les souches TA97a, TA98, TA100 etTA102 et aussi de 2 pg/ cm ³ de tétracycline pour la souche TA102.

C2. A partir d’une culture isolée Une colonie de chacune des souches isolées est introduite dans 7 cm ³ (7ml) de milieu Gencar puis supplémenté en ampicilline à raison de 25 pg/cm ³ pour les souches TA97a, TA98, TA100 et TA102 et aussi de 2 pg/cm ³ de tétracycline pour la souche TA102. Les quantités utilisées sont recensées dans le tableau 2 suivant :

Tableau 2 C3. Les solutions préparées aux paragraphes Cl. et C2. précédents, sont laissées pendant une nuit au bain-marie à une température de 37°C puis conservées à 4°C dès l’arrêt du bain-marie. A l’issue de cette période, les cultures bactériennes obtenues contiennent entre 5.10 ⁸ et 5.10 ⁹ cellules par centimètre cube.

D. Préparation des solutions témoins négatifs

Ces solutions sont préparées dans les puits de plaques de quatre-vingt-seize puits selon une distribution détaillée au paragraphe G. suivant.

Dl. Solution témoin négatif sans activateur métabolique

1,5 mm ³ (1,5 pi) de chaque culture bactérienne préparée à l’étape C. précédente sont mélangés à 150 mm ³ (150 pl) du milieu Gencar, 6 mm ³ (6 pl) de tampon phosphate et 1,2 mm ³ (1,2 pl) du solvant utilisé pour préparer la solution initiale de ladite substance chimique d’essai.

D2. Solution témoin négatif avec activateur métabolique

1,5 mm ³ (1,5 pl) de chaque culture bactérienne préparée à l’étape C. précédente sont mélangés à 150 mm ³ (150 pl) du milieu Gencar, 6 mm ³ (6 pl) de l’activateur métabolique S9-Mix tel que défini au paragraphe B. précédent et 1,2 mm ³ (1,2 pl) du solvant utilisé pour préparer la solution de ladite substance chimique d’essai.

E. Préparation des solutions témoins positifs

Ces solutions sont préparées dans les puits de plaques de quatre-vingt-seize puits selon une distribution détaillée au paragraphe G. suivant.

El. Solution témoin positif sans activateur métabolique

1,5 mm ³ (1,5 pl) de chaque culture bactérienne préparée à l’étape C. précédente sont mélangés à 150 mm ³ (150 pl) du milieu Gencar, 1,2 mm ³ (1,2 pl) de la solution de la substance chimique de référence et 6 mm ³ (6 pl) de tampon phosphate.

E2. Solution témoin négatif avec activateur métabolique :

1,5 mm ³ (1,5 pl) de chaque culture bactérienne préparée à l’étape C. précédente sont mélangés à 150 mm ³ (150 pl) du milieu Gencar, 1,2 mm ³ (1,2 pl) de la solution de la substance chimique de référence et 6 mm ³ (6 pl) de l’activateur métabolique S9-mix tel que défini au paragraphe B. précédent.

E3. Substances chimiques de référence utilisées : Les solutions initiales des substances chimiques de référence utilisées en l’absence et en présence d’activateur métabolique, sont recensées dans les tableaux 3 et 4 suivants : Tableau 3

Tableau 4

F. Préparation des solutions de substances chimiques dont on souhaite détecter le caractère mutagène

Ces solutions sont préparées dans les puits de plaques de quatre-vingt-seize puits selon une distribution détaillée au paragraphe G. suivant. Pour chaque substance chimique d’essai à analyser, il est préparé des solutions de cinq concentrations différentes.

Fl. Solution sans activateur métabolique

1,5 mm ³ (1,5 pi) de chaque culture bactérienne préparée à l’étape C. précédente sont mélangés à 150 mm ³ (150 pl) du milieu Gencar, 1,2 mm ³ (1,2 pl) de la solution initiale de ladite substance chimique d’essai, et 6 mm ³ (6 pl) de tampon phosphate pour maintenir le pH autour de 7,4.

F2. Solution avec activateur métabolique : 1,5 mm ³ (1,5 pl) de chaque culture bactérienne préparée à l’étape C. précédente sont mélangés à 150 mm ³ (150 pl) du milieu Gencar, 1,2 mm ³ (1,2 pl) de la solution initiale de ladite substance chimique d’essai et 6 mm ³ (6 pL) de l’activateur métabolique S9-Mix tel que défini au paragraphe B. précédent.

G. Etape de préincubation des souches

Gl. Préparation des plaques de préincubation. : On prépare, pour chaque souche d’essai, une plaque de 96 puits, comportant 12 colonnes de 8 puits. En ce qui concerne les essais sans activateur métabolique, - 5 puits de ladite plaque de 96 puits contiennent 157,5 mm ³ (157,5 pi) de la solution témoin négatif, comme préparée au paragraphe Dl. précédent ;

- 5 puits de ladite plaque contiennent 158,7 mm ³ de la solution témoin positif, comme préparée au paragraphe El. précédent ;

- Pour les 5 chaque concentrations choisies, 5 puits de ladite plaque contieenent 158,7 mm ³ de la solution de la substance chimique d’essai, comme préparée au paragraphe Fl. ;

- Le reste des puits, soit 61 puits contiennent chacun le milieu Gencar. La même distribution est adoptée pour les plaques concernant les essais avec activation métabolique avec les différentes solutions comme préparées aux paragraphes D2., E2. et F2..

G2. Préincubation : Les plaques comme préparées aux paragraphes Gl. et G2. précédents avec chacune des souches d’essais, sont entourées par un film (type Parafilm) et laissées incuber une nuit à 37°C sous agitation.

H. Etape d’incubation en milieu liquide

Hl. Préparation des solutions pour incubation

Les contenus de chacun des puits après préincubation, sont versés dans des tubes contenant 3 cm ³ (3ml) de milieu Gencar puis dans lesquels sont incorporés 720 mm ³ (720 pi) de tampon phosphate. Chaque tube contient environ 3879 mm ³ (3879 pi) de liquide, dont 3225 mm ³ sont finalement répartis dans 5 puits à raison de 645 mm ³ (645 pl) par puits.

H2. Incubation

Le produit en quantité de l’ordre du picogramme au microgramme est incubé en présence ou en absence de S9 dans un milieu de culture pendant un temps maximum d’une nuit.

I. Analyse des échantillons

11. Conception des amorces nécessaires à la qPCR

La technologie qPCR permet l’amplification spécifique de chaque type d’allèle. La proportion de gènes sauvages et de gènes mutés est déterminée dans le présent essai en comparant les résultats de deux qPCR distinctes effectuées avec différents types d’amorces et de sondes. Un premier mélange spécifique du gène sauvage non muté, appelé mélange Wt, et un deuxième mélange spécifique du gène muté, appelé mélange Mut. Les amorces spécifiques de chaque gène sont conçues en prenant comme référence, la séquence de l’opéron histidine de Salmonella typhimurïum (numéro ncbi : JO1804.1) de manière à amplifier la région du gène qui couvre la mutation de chacune des souches TA100, TA98, TA1535, TA102 et TA97a.

12. Extraction de l’ADN de cellules de Salmonella typhimurium des tubes après incubation

Les échantillons de 645 mm ³ (645 pl) résultant de l’étape H d’incubation précédente, sont si nécessaire centrifugés pour éliminer tout surnageant. On y ajoute ensuite dans chacun 200 mm ³ (200|u,l) de tampon phosphate sous poste de sécurité microbiologique (sous PSM). Après agitation vigoureuse, la densité optique (DO) à 600 nm de chaque échantillon est mesurée au moyen d’un spectrophotomètre Implen NP80. Si nécessaire les échantillons sont de nouveau centrifugés, puis leur ADN est extrait en utilisant la trousse dénommée « Mag Bind Bacterial DNA 96 kit » commercialisé par la société OMEGA bio teck. L’ADN recueilli de chaque échantillon est ensuite élué dans 50 mm ³ de tampon d’élution puis la quantité et la concentration de l’ADN obtenu est mesurée au moyen du même spectrophotomètre Implen NP80 (DO à 260, 230 et 280 nm).

Des dilutions en cascade de plasmides recombinants porteurs des fragments d’intérêt sont préalablement préparés de manière à ce que les nombres de copies (amplifiées pour chacune des souches en version mutée et en version révertante) s’échelonnent de 2,5 copies /mm ³ à 2,5 10 ⁶ copies /mm ³ . 2 mm ³ de chaque échantillon d’ADN sont mélangés à 2 mm ³ d’eau, 5 mm ³ de réactif de la trousse « Genotyping Master Mix » commercialisé par la société ThermoFisher Scientific et à 1 mm ³ des mélanges spécifiques d’amorces et de sondes à chaque souche suivants :

- Les mélanges TA100WT, pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche et TA100, et TA100MUT, pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche ;

- Les mélanges TA98WT, pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche TA98, et TA98MUT, pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche ;

- Les mélanges TA102WT, pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche TA102, et TA102MUT, pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche ;

- Les mélanges TA97aWT, pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche TA97a et TA97aMUT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche ; et

- Les mélanges TA1535WT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche TA1535, et TA1535MUT, pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche.

13. Analyse des échantillons

Deux qPCR sont réalisées pour chaque échantillon de souche, afin de quantifier pour chaque souche, la quantité de gènes sauvages non mutés et celle de gènes mutés. Ces amplifications sont effectuées avec un QuantStudio™ 3.0 (Applied Biosystems), en activant l’attaque à 90°C pendant 10 minutes, en effectuant 45 cycles de PCR (95°C 15 s ; 66°C 60s) avec une rampe de montée en température de l,6°C/s. La normalisation des résultats de qPCR est permise grâce au réactif ROX contenu dans la trousse « Genotyping Master Mix » 14. Analyse des résultats

Les droites de régression établies à partir des valeurs des cycles de seuil (valeurs de Ct) obtenues pour chacune des gammes de dilutions de plasmide permettent de déterminer la quantité de gènes sauvages ( t) et mutés (Mut) dans chacune des échantillons traités et leur contrôle respectif (échantillon non traité). Ces quantités sont calculées automatiquement par le logiciel associé au QuantStudio ™ dénommé : « QuantStudio™ Design & Analysis Desktop Software ». Le rapport entre le nombre de gènes révertants (Wt)et le nombre de gènes totaux (Wt + Mut) est ensuite calculé pour chacun des échantillons. La proportion de révertants dans chacun des échantillons exposés à la substance chimique dont on souhaite détecter le caractère mutagène éventuel est alors comparée à la proportion observée dans les échantillons non traités. Un rapport supérieur à 1 suggère un effet mutagène potentiel induit par ladite substance d’essai.

Liste des documents cités

Référence 1. Dorothy M. Maron and Bruce N. Ames, Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Research, 113 (1983) 173-215 ; Référence 2. Lignes directrices de l’OCDE pour les essais de produits chimiques ; Section 4 ; Ligne directrice N° 471 ; Essai de mutation réverse sur des bactéries » OCDE, 26 juin 2000 ;

Référence 3. Kristien Mortelmans and Errol Zeiger, The Ames Salmonella/ microsome mutagenicity assay, Mutation Research 455 (2000) 29-60.