MéTODO DE DIAGNóSTICO Y/O PRONóSTICO DE CáNCER DE MAMA

DESCRIPCIóN

CAMPO DE LA INVENCIóN

La presente invención tiene su campo de aplicación dentro del sector sanitario, principalmente aquel relacionado con el cáncer. En concreto está dirigida a métodos de diagnóstico y/o pronóstico del cáncer de mama basados en Ia determinación del factor de transcripción SnaiH .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIóN

La invasión tumoral local representa Ia primera etapa de Ia cascada metastásica de los carcinomas. La invasión de las células de carcinoma requiere cambios profundos en las propiedades migratorias, de polaridad y de adhesión celular de las células tumorales, conocidos colectivamente como transición epitelio-mesénquima (TEM).

La TEM es un proceso principal del desarrollo, que permite Ia remodelación tisular mediante Ia alteración de Ia adhesión celular y permitiendo Ia migración celular. Pero además, este proceso, esencial para Ia formación del mesodermo durante Ia embriogénesis, también Io pueden usar las células tumorales para escapar del entorno de alta presión encontrado en el tumor primario y que se extiende hacia los tejidos distantes formando metástasis (Thiery JP. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nat. Rev. Cáncer 2002; 2(6): 442-454; Mehlen P. et al. Metástasis: a question oflife or death. Nat. Rev. Cáncer 2006; 6(6): 449-458).

La pérdida de cadherina-E funcional es un acontecimiento esencial para Ia TEM, considerándose uno de sus sellos distintivos (Thiery JP. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progresión. Nat. Rev. Cáncer 2002; 2(6): 442-454; Thiery JP. Et al. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat. Rev. Mol. CeII Biol. 2006; 7(2):131-142). Esta pérdida se detecta en Ia mayoría de los carcinomas invasivos y metastásicos y su estudio ha conducido a Ia caracterización

de los dos mecanismos moleculares principales implicados en su regulación a Ia baja: los cambios epigenéticos y Ia represión de Ia transcripción (Peinado H. et al. Transcriptional regulation of cadherins during development and carcinogenesis. Int. J. Dev. Biol 2004; 48(5-6):365-375).

En los últimos años se han caracterizado varios represores de Ia transcripción del gen de cadherina-E. Entre éstos, dos miembros de Ia familia de dedos de zinc Snail, SnaiM (Snail) y Snail2 (Slug), han surgido como reguladores principales de Ia TEM durante el desarrollo y progresión tumoral (Thiery JP. et al. Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat. Rev. Mol. CeII Biol. 2006;

7(2):131-142; Peinado H. et al. Snail, Zeb and bHLH factors in tumour progression: an alliance against the epithelial phenotype? Nat Rev Cáncer 2007 ;7 (6): 415-428; Nieto MA. The snail superíamily of zinc-finger transcription factors. Nat Rev Mol CeII Biol 2002;3(3):155-166; Peinado H. et al. Transcriptional regulation of cadherins during development and carcinogenesis. Int. J. Dev. Biol 2004; 48(5-6):365-375), así como en otras patologías, tales como Ia fibrosis renal (Boutet A. et al. Snail activation disrupts tissue homeostasis and induces fibrosis in the adult kidney. Embo J 2006). Los factores Snail también desempeñan papeles importantes en otros procesos biológicos significativos, incluyendo Ia regulación del ciclo celular (Vega S. et al. Snail blocks the cell cycle and confers resistance to cell death.

Genes Dev 2004;18(10):1131-1143), Ia inducción del movimiento y Ia supervivencia celular (Barrallo-Gimeno A. et al. The Snail genes as inducers of cell movement and survival: implications in development and cáncer. Development 2005;132(14):3151- 3161).

La expresión de Snail2 confiere resistencia a Ia muerte celular inducida por radiación a los progenitores hematopoyéticos (Inoue A. et al. Slug a highly conserved zinc finger transcriptional represor, protects hematopoietic progenitor cells from radiation-induced apoptosis in vivo. Cáncer Cell 2002; 2(4): 279-288; Pérez-Losada J. et al. The radioresistance biological function of the SCF/kit signaling pathway is mediated by the zinc-finger transcription factor Slug. Oncogene 2003; 22(27): 4205-4211) mediante Ia represión de Ia diana de p53, PUMA, un antagonista de Bcl-2 (Wu WS. et al. Slug antagonizes p53-mediated apoptosis of hematopoietic progenitors by repressing puma. Cell 2005;123(4):641-653).

Las células que expresan SnaiH sobreviven a Ia privación de suero y son resistentes a Ia apoptosis inducida por los estímulos pro-apoptóticos o mediante agentes genotóxicos (Vega S. et al. Snail blocks the cell cycle and confers resistance to cell death. Genes Dev 2004; 18(10):1131-1143; Kajita M. et al. Aberrant expresión of the transcription factors snail and slug alters the response to genotoxic stress. Molecular and cellular biology 2004; 24(17):7559-7566). La acción completa de SnaiH puede tener un efecto principal sobre el crecimiento, Ia supervivencia y/o el comportamiento invasivo de las células tumorales, así como en Ia progresión tumoral (Thiery JP et al. Complex networks orchestrate epithelial- mesenchymal transitions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2006; 7(2):131-142; Peinado H. et al. Snail, Zeb and bHLH factors in tumour progresión: an alliance against the epithelial phenotype? Nat Rev Cáncer 2007;7(6):415-428; Barrallo-Gimeno A. et al. The Snail genes as inducers of cell movement and survival: implications in development and cáncer. Development 2005;132(14):3151-3161).

En base a estos hallazgos, en los documentos ES2161612, ES2161655 y ES2234619 se describe el empleo del factor de transcripción SnaiH como marcador de diagnóstico y de progresión tumoral, mediante Ia determinación de Ia capacidad invasiva y metastásica de un tumor epitelial.

Recientemente, se han proporcionado pruebas a favor de un papel principal de SnaiH en Ia tumorigénesis, puesto que el silenciamiento estable de SnaiH en líneas de células de carcinoma epidérmico de Ia piel del ratón conduce a un fenotipo más diferenciado y menos invasivo, con una reducción drástica en el potencial del crecimiento tumoral in vivo (Olmeda D. et al. Snail silencing effectively suppresses tumour growth and invasiveness. Oncogene 2007,26(13) : 1862-187 '4).

En el caso concreto del cáncer de mama, Ia expresión de SnaiH y/o de su homólogo Snail2 (Slug) se ha asociado con Ia represión de cadherina-E en diferentes series de tumores. Sin embargo, no se ha determinado Ia contribución específica de cualquier factor al avance del cáncer de mama. Así, existen estudios que plantean que Snail2 es el represor esencial de Ia cadherina-E (Hajra, K.M. et al. The slug zinc-finger protein represses E-cadherin in breast cáncer. Cáncer. Res.62, 1613-1618,2002). Estudios posteriores, en carcinomas de mama primarios y

metástasis, apoyan el papel de Snail2, junto con Snaih o por sí solo, en diferentes tipos de diseminación metastásica de carcinomas de mama (Martin TA. et al. Expression of the transcription factors snail, slug and twist and their clinical sigriif ¡canee in human breast cáncer. Ann Surg Oncol 2005; 12(6):488-496; Elloul S. et al. Snail, slug and Smad-interacting protein 1 as novel parameters of disease aggresiveness in metastatic ovarían and breast carcinoma. Cáncer 2005; 103(8):1631-1643) así como Ia asociación entre Ia expresión de Snail2 y recurrencia de carcinomas de mama (Come C. et al. Snail and Slug play a distinct roles during breast carcinoma progresión.2006. p 5395-5402). Asimismo, otros estudios han mostrado Ia expresión de otros represores de cadherina-E en carcinomas de mama y su asociación con progresión tumoral. El factor Twist, de Ia familia bHLH, en virtud de su actividad represora sobre cadherina-E, se ha asociado a Ia capacidad de intravasación y metástasis en un modelo de ratón de carcinoma de mama, y su expresión se ha asociado a carcinomas de mama lobulillares (Yang et al. Twist, a master regulador of morphogenesis, plays an essential role in tumor metástasis. CeII, 117, 927-939, 2004), así como a Ia capacidad de invasión y angiogénesis (Mironchik et al. Twist overexpression induces in vivo angiogenesis and correlates with chromosomal instability in breast cáncer. Cáncer Res, 65, 10808-10809,2005) y/o peor pronóstico de carcinomas ductales de mama (Martin TA. et al. Expression of the transcription factors snail, slug and twist and their clinical signif ¡canee in human breast cáncer. Ann Surg Oncol 2005; 12(6) A88-496). Por consiguiente, las referencias anteriores evidencian Ia participación conjunta de SnaiH y otros represores de cadherina-E en Ia progresión de carcinomas de mama.

Por otra parte, Ia expresión de Snail 1 se ha asociado con Ia represión de cadherina-

E, el estado de los ganglios linfáticos y Ia metástasis, mediante estudios de correlación estadística (Zhou BP. et al. Dual regulation of Snail by GSKSbeta- mediated phosphorylation in control of epithelial-mesenchymal transition. Nature cell biology 2004,6(10):931 -940; Blanco MJ et al. Correlation of Snail expresión with histológica/ grade and lymph node status in breast carcinomas. Oncogene

2002;21(20):3241-3246; Chen CW. et al. Mechanisms of inactivation of E-cadherin in breast carcinoma: modification of the two hit hypothesis of tumor suppressor gene. Oncogene 2004;20(29):3814-3823; Come C. et al. Snail and Slug play a distinct roles during breast carcinoma progresión.2006. p 5395-5402), así como con

Ia recurrencia del tumor en un modelo de ratón de cáncer de mama y, de manera importante, algunos análisis de expresión génica de micromatrices del cáncer de mama (disponibles en bases de datos) correlacionaron Ia expresión elevada de SnaiH con Ia disminución de Ia supervivencia libre de recidiva (Moody SE. et al. The transcriptional repressor Snail promotes mammary tumour recurrent. Cáncer cell

2005;8(3): 197-209). Asimismo, en el documento WO2007025231 se define el factor de transcripción Snail 1 como marcador del riesgo de recurrencia de cáncer de mama en un modelo de ratón.

Sin embargo, en ninguno de los documentos del estado de Ia técnica se ha demostrado experimental y/o funcionalmente que Ia expresión de SnaiH sea suficiente para incidir en el desarrollo y/o progresión de los carcinomas de mama, ya que Ia falta de anticuerpos apropiados frente a SnaiH ha impedido hasta ahora el establecimiento de una relación directa entre Ia expresión de Snail 1 y los hallazgos histopatológicos. Además, hasta ahora no se han descrito estudios funcionales sobre el papel de Snail 1 ih vivo en las células de carcinoma de mama humano.

En base a las necesidades del estado de Ia técnica, los autores de Ia presente invención han realizados importantes estudios de experimentación de pérdida de Ia función en líneas celulares de carcinoma de mama en humanos, mediante el silenciamiento estable de Snail 1.

Así, por primera vez, los autores de Ia presente invención han determinado una relación directa entre Ia expresión de Snail 1 y el desarrollo y progresión de los carcinomas de mama, demostrando, mediante análisis in vivo, el papel principal y esencial de SNAIL1 en el potencial del crecimiento tumoral de las células de carcinoma de mama.

Estos resultados han permitido desarrollar un método de diagnóstico y/o pronóstico de cáncer de mama donde Ia determinación del factor de transcripción Snail 1 permite evaluar Ia capacidad de crecimiento, de recurrencia y de desarrollo de metástasis, local y a distancia, del tumor, así como evaluar Ia capacidad de respuesta del tumor a agentes quimioterapéuticos.

Además, los desarrollos realizados por los autores de Ia presente invención, dan lugar al empleo del silenciamiento de SnaiH como agente terapéutico, no sólo en tratamientos anti-metastásicos, sino también en tratamientos de sensibilidad tumoral, aumentando Ia quimiosensibilidad de las células de carcinoma de mama humano frente a agentes quimioterapéuticos clínicamente relevantes en el cáncer de mama.

DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Análisis de Ia expresión de cadherina-E y de Ia regulación de marcadores mesenquimáticos tras el silenciamiento de Snail-1 . A) Análisis RT-PCR de los niveles de RNAm de SnaiH humano (hSNAM) y SnaiH de ratón (mSnail) en células MDA-MB-231 originales, dos clones estables generados tras Ia transfección de shSNAM (shSNAI1-C2 y shSNAI1-C4) y dos clones estables generados tras Ia expresión de una versión mutante de SnaiH de ratón (mutS), no reconocida por el ShSNAH , en células shSNAI1-C2 y shSNAI1-C4 (shSNAM- C2+mutS, shSNAI1-C4-mutS). Se incluyen como controles las células MDA-MB- 231 transfectadas de manera estable con shEGFP (MDA-MB-231-shEGFP). Los niveles de RNAm de GAPDH se muestran como control de carga. B) Análisis qRT- PCR de los niveles de RNAm de SnaiH humano (hSNAH), Snail2 humano (hSNAI2) y cadherina-E humana (hE-CD) de las líneas celulares descritas en A. C) Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de los niveles de proteína de SnaiH humana/de ratón (h/mSNAI1), Snail2 humana (hSNAI2) y los marcadores mesenquimáticos fibronectina y vimentina en clones independientes y células control indicadas en A y B. La inmunotransferencia de tipo Western de α-tubulina se muestra como control de carga.

Figura 2: Análisis de Ia expresión y organización de vimentina y fibronectina tras el silenciamiento estable de SnaiH en células MDA-MB-231. Análisis de inmunofluorescencia de los niveles y localización subcelular de fibronectina, vimentina, y SnaiH -HA en células MDA-MB-231 y MDA-MB-231 -shEGFP (shEGFP) control, dos clones estables generados tras Ia transfección con shSNAH (shSNAM-

C2 y shSNAI1-C4) y dos clones estables generados tras Ia expresión de una versión mutante de SnaiH de ratón (mutS) (clones shSNAI1-C2/C4+mutS). Barras, 20 Dm.

Figura 3. Análisis de Ia capacidad invasiva de las células MDA-MB-231 tras el silenciamiento estable de SnaiM. A) Análisis qRT-PCR de los niveles de RNAm de MMP2, SPARC, ID1 e ID2 en células MDA-MB-231 originales y MDA-MB-231- shEGFP control (shEGFP), clones estables de shSNAM (shSNA1-C2 y -C4) y clones estables obtenidos tras Ia expresión del mutante silencioso de Snail de ratón (mutS) en células shSNA1-C2 y -C4. B) Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de los niveles de proteína total de ID1 y SPARC humanas en los clones independientes y las células control, indicado como en A. La inmunotransferencia de tipo Western de α-tubulina se muestra como control de carga. C) Ensayo de zimografía de Ia actividad de MMP-9 secretada realizada en el medio condicionado de las células descritas en A. La actividad de MMP-2 se muestra como control. D) Análisis del fenotipo invasivo de las líneas celulares indicadas en A, crecidas sobre filtros recubiertos con una matriz de colágeno de tipo IV. Los resultados muestran Ia media ± DE de tres ensayos independientes. Análisis ANOVA; ** p<0,01. Figura 4. Análisis del potencial tumorigénico de las células MDA-MB-231 tras silenciamiento de SnaiH. A) Análisis del potencial de crecimiento tumoral (latencia del tumor y tasa de crecimiento) de las líneas celulares MDA-MB-231 » shEGFP -o— , ShSNAI 1-C2 -"— , shSNAI1C4 -o—, shSNAI1-C2+mutS →— y shSNAI1-C4+mutS — ° — , tras su inyección ortotópica en el panículo adiposo mamario de los ratones inmunodeprimidos. Los resultados muestran Ia media ± DE de dos ensayos independientes realizados con 5 ratones/línea celular cada uno. Análisis ANOVA: ^*** p<0,001. B) Análisis RT-PCR de Ia expresión de SnaiH y Snail2 humanos (hSNAM y hSNAI2) y de SnaiH de ratón (mSnail) realizado en muestras de RNA aisladas de los tumores individuales generados por las líneas celulares indicadas en A. Se muestran dos tumores de cada tipo celular indicado. Los niveles de RNAm de GAPDH se incluyen como control de carga. C ) Análisis qRT-PCR de los niveles de RNAm de cadherina-E (hE-CD), SPARC, ID1 e ID2 humanos realizado en muestras de RNA aisladas de tumores individuales generados por los clones indicados anteriormente. Los resultados muestran la

media ± De de dos tumores independientes para cada clon.

Figura 5. Análisis del efecto del silenciamiento estable de Snaih sobre el fenotipo de los tumores inducidos por MDA-MB-231 A) Análisis histológico y de proliferación de tumores inducidos por células MDA-MB-231-shEGFP control, un clon en el que se interfiere SNAH representativo (shSNAI1-C2) y su correspondiente control tras Ia expresión estable del muíante silencioso de SnaiM (shSNAI1-C2+mutS). Se muestran imágenes de bajo aumento (a-c) y de alto aumento (d-f). Las zonas necróticas se indican mediante flechas. Se muestra Ia inmunotinción del antígeno de proliferación Ki67 en los paneles g-i. B) Análisis de inmunofluorescencia de las secciones de tumor de las líneas celulares indicadas anteriormente. Las secciones muestran tinción para MMP9 (a-c), CD31 (d-f) e ID2 (g-i). Detección de células apoptóticas mediante ensayo de TúNEL (j-l). Barras, 50 Dm. Figura 6. Caracterización de líneas celulares derivadas de ganglios linfáticos en ratones nu/nu. A) Representación esquemática del diseño experimental; 1. Crecimiento del tumor y extracción; 2. Selección de células MDA-MB-231 resistentes a antibióticos; 3. Líneas celulares obtenidas a partir de ganglios linfáticos de las extremidades contralaterales. B) Análisis de PCR para determinar Ia presencia de alelo de amelogenina humano en las líneas celulares indicadas en

A. C) Análisis de PCR de Ia presencia del casette de expresión H1 del vector pSuperior-shRNA en las líneas celulares indicadas. Se indican los tamaños esperados del pSuperior-shRNA control (281 pb) y pSuperior-shRNA que contiene shEGFP o ShSNAM (345 pb).

Figura 7. Análisis de Ia expresión de SnaiM en líneas celulares derivadas de ganglio linfático. A) Análisis qRT-PCR de los niveles de RNAm de SnaiH humano (hSNAH) y Snail2 humano (hSNAI2) de células MDA-MB-231 originales, dos líneas celulares derivadas de metástasis de ganglios linfáticos a partir de células MDA- MB-231 -shEGFP control (shEGFP-OI y shEGFP-2D), una línea celular derivada de metástasis de ganglios linfáticos a partir de Ia línea celular MDA-MB-231-shSNAI1- C2 (shSNAI1-C2-2D) y dos líneas celulares derivadas de metástasis de ganglios linfáticos a partir de MDA-MB-231-shSNAI1-C4 (shSNAI1-C4-SM y shSNAI1-C4- Ol). B) Análisis de inmunotransferencia de tipo Western de los niveles de proteínas

de SnaiH (SNAI1) y Snail2 (SNAI2) humanas en células MDA-MB-231 originales y clones derivados de ganglios linfáticos independientes según se indica en A. La inmunotransferencia de tipo Western de Ia D-tubulina se muestra como control de carga. C) Análisis del potencial tumorigénico de las células 231-shSNA-C2-2D y 231-shSNA-C4-SM comparado con las MDA-MB-231 originales mediante inyección ortotópica en el panículo adiposo mamario de ratones inmunodeprimidos.

Figura 8: Análisis de las propiedades proliferativas de células con SnaiM silenciado mediante Ia incorporación de BrdU en presencia o ausencia de suero en las líneas celulares MDA-MB-231, shEGFP, shSNAI1-C2, shSNAM-

C2+mutS, shSNAM -C4 y shSNAI1-C4+mutS.

Figura 9. Análisis de Ia apoptosis inducida tras un tratamiento de 48 h con docetaxel 100 nM (A) o gemcitabina 6 pM (B) en células MDA-MB-231 originales y MDA-MB-231 -shEGFP control, clones en los que se interfiere

SnaiH de manera estable (shSNAI1-C2 y -C4) y clones estables obtenidos tras Ia expresión de SnaiH de ratón mutante (mutS). Los resultados muestran Ia media ± DE de tres ensayos independientes. Análisis ANOVA: ^** p < 0,01 ; * ^* * p < 0,001.

Figura 10. Análisis de Ia apoptosis inducida tras el tratamiento de 48 h con docetaxel 100 nM (A) o gemcitabina 6 pM (B) en líneas celulares derivadas de ganglios linfáticos: MDA-MB-231 originales, dos líneas celulares derivadas de metástasis de ganglios linfáticos a partir de células MDA-MB-231 -shEGFP control (shEGFP-OI y shEGFP-2D), una línea celular derivada de metástasis de ganglios linfáticos a partir de Ia línea celular MDA-MB-231-shSNAI1-C2 (shSNAI1-C2-2D) y dos líneas celulares derivadas de metástasis de ganglios linfáticos a partir de MDA- MB-231-shSNAI1-C4 (shSNAI1-C4-SM y shSNAI1-C4-OI).

OBJETO PE LA INVENCIóN

En primer lugar, Ia invención se refiere a un método de diagnóstico y/o pronóstico de cáncer de mama basado en Ia determinación del nivel de expresión del factor de transcripción SnaiM en una muestra biológica aislada de un sujeto.

Es también objeto de Ia presente invención el empleo de un oligonucleótido interferente de SnaiH en Ia preparación de un medicamento destinado al tratamiento de cáncer de mama.

Finalmente, es objeto de Ia invención una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un oligonucleótido interferente de SnaiH , para su uso en el tratamiento del cáncer de mama.

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN

Debido principalmente a Ia falta de anticuerpos apropiados frente al factor de transcripción SnaiH , hasta ahora no se habían descrito estudios funcionales sobre el papel de SnaiH in vivo en células de carcinoma de mama humano, Io que no ha permitido establecer una relación directa entre Ia expresión de SnaiH y los hallazgos histopatológicos en cáncer de mama humano.

Los autores de Ia presente invención, mediante el silenciamiento estable de Ia expresión del factor de transcripción SnaiH en líneas celulares de cáncer de mama humano, han demostrado que SnaiH desempeña un papel directo en el cáncer de mama humano. Así, han demostrado que el silenciamiento estable de SnaiH disminuye significativamente el fenotipo invasivo de líneas celulares de carcinoma de mama humano. Además, los experimentos realizados han demostrado que Ia expresión de SnaiH es necesaria, no sólo para Ia invasión local y Ia metástasis, como ya se había descrito para otro tipo de tumores, sino Io que es más importante, para el crecimiento tumoral primario y han confirmado su papel en Ia recurrencia del tumor en cáncer de mama humano.

En base a estos avances, han desarrollado nuevas aplicaciones en el campo del diagnóstico, pronóstico y terapia del cáncer de mama, proporcionando un diagnóstico más sensible, y facilitando el pronóstico y Ia toma de decisiones respecto a actuaciones terapéuticas adecuadas.

Así, un aspecto principal de Ia invención se refiere a un método para el diagnóstico y/o pronóstico de cáncer de mama basado en Ia determinación del nivel de expresión del factor de transcripción SnaiM (a nivel de proteína y/o mRNA) en una muestra biológica aislada de un sujeto, comparando los resultados obtenidos con valores de referencia previamente establecidos.

El término "sujeto", tal como se emplea en Ia presente invención, incluye seres humanos y animales, preferiblemente mamíferos.

La muestra biológica procede de un tejido tumoral de un sujeto con cáncer de mama.

El factor SnaiH se refiere al anteriormente denominado Snail, mientras que Snail2 se refiere a Slug. De forma general, en Ia presente invención se emplea Ia denominación Snail1/Snail2. Al referirse a los factores humanos se utiliza Ia forma

SNAIL1/SNAIL2 o de forma abreviada, SNAM y SNAI2, respectivamente. Asimismo, Ia forma abreviada Snail se utiliza para el factor Snail 1 de ratón.

Como "método de diagnóstico" se entiende un ensayo realizado sobre un sujeto que presenta síntomas que podrían ser de cáncer de mama. Como "método de pronóstico" se entiende un método que ayuda a predecir, al menos en parte, el curso de Ia enfermedad. En este sentido, se puede analizar un sujeto al que se Ie ha diagnosticado previamente cáncer de mama para conocer el progreso de Ia enfermedad, así como Ia posibilidad de que responda favorablemente a un tratamiento terapéutico concreto.

En una realización particular de Ia invención, Ia determinación del nivel de expresión del factor de transcripción Snail 1 permite evaluar Ia capacidad de recurrencia del tumor. Además, Ia implicación directa de SnaiH en el crecimiento del tumor primario implica que Ia detección de SnaiM en un carcinoma de mama en el momento del diagnóstico puede predecir Ia velocidad de crecimiento del tumor primario, no sólo de su recurrencia, aumentando considerablemente Ia sensibilidad del diagnóstico y Ia toma de decisiones. Así, en otra realización particular de Ia

invención, la determinación del nivel de expresión del factor de transcripción SnaiH , en el método definido, permite evaluar Ia capacidad de crecimiento del tumor.

En otra realización particular, Ia determinación del nivel de expresión del factor de transcripción SnaiH permite evaluar Ia capacidad de desarrollo de metástasis local del tumor. Además, Ia implicación directa de SnaiH en Ia capacidad invasiva y metastásica permite predecir Ia capacidad de desarrollo de metástasis a distancia del tumor, facilitando el pronóstico y Ia toma de decisiones respecto a actuaciones terapéuticas adecuadas.

La detección de SnaiH en un carcinoma de mama en el momento del diagnóstico permite además predecir y evaluar Ia capacidad de respuesta del tumor a agentes quimioterapéuticos utilizados en el tratamiento del carcinoma de mama, incluyendo, pero no de forma exclusiva, a docetaxel y gemcitabine, utilizados en clínica para el tratamiento de diversos tipos tumorales en estadios localmente avanzados y metastásicos, entre ellos el cáncer de mama, habiéndose demostrado su utilidad en el tratamiento, primero en situación metastásica y, posteriormente, en Ia situación más favorable de adyuvancia.

En otro aspecto principal de Ia invención se contempla el uso de un oligonucleótido interferente de SnaiH en Ia preparación de un medicamento destinado al tratamiento de cáncer de mama.

En Ia presente invención, el término oligonucleótido se refiere tanto a secuencias de RNA interferente de SnaiH (siRNA) como a secuencias de DNA que, incorporadas en un vector de expresión, son capaces de dirigir, una vez dentro de Ia célula, Ia síntesis de un shRNA.

siRNA es una molécula de RNA de doble cadena, generalmente de 19 pb cada una con 2 bases desapareadas en cada extremo ("overhangs"). Así, se encuentra de forma natural en las células. shRNA es RNA monocadena que forma un "lazo"

(hairpin) plegándose sobre sí mismo para dar una estructura de doble cadena. Este "lazo" es cortado en el citoplasma por Ia enzima DICER dando lugar a un siRNA de doble cadena. Por tanto, los shRNA son precursores sintéticos de siRNA que se

transcriben a partir de un plásmido/virus exógeno introducido en Ia célula para tal fin.

En una realización preferida, el oligonucleótido empleado es RNA interferente de

SnaiH , de doble cadena, preferiblemente con secuencias mostradas en SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2.

En otra realización preferida, el oligonucleótido empleado es DNA, preferiblemente con secuencia mostrada en SEQ ID NO 3.

El silenciamiento específico de SnaiH mediante Ia interferencia estable del RNA induce a una disminución en los marcadores mesenquimáticos (fibronectina, vimentina) y pro-invasivos (MMP9, ID1 , SPARC) en las células de cáncer de mama (p.ej. MDA-MB-231), de manera concomitante con una disminución en su comportamiento invasivo in vitro. Y Io que es más importante, Ia interferencia estable de SnaiH en dichas células conduce a una drástica reducción en Ia incidencia tumoral in vivo y a un aumento de dos veces en Ia latencia tumoral. Los tumores inducidos por las células silenciadas muestran regiones necróticas extensas y una disminución significativa en los marcadores invasivos y angiogénicos.

Así, en realizaciones particulares de Ia invención, se contempla el empleo de un oligonucleótido interferente de SnaiH , en Ia preparación de un medicamento destinado a Ia disminución de Ia formación de tumores primarios en cáncer de mama.

En otra realización particular, se emplea dicho oligonucleótido en Ia preparación de un medicamento destinado a Ia disminución de Ia recurrencia de tumores primarios en cáncer de mama.

En otra realización particular, se contempla el uso del oligonucleótido en Ia preparación de un medicamento destinado a Ia disminución de Ia capacidad invasiva del tumor en cáncer de mama.

En otra realización particular, el oligonucleótido se emplea en Ia preparación de un medicamento destinado a Ia disminución de Ia formación de metástasis local en cáncer de mama.

En otra realización particular se contempla el uso del oligonucleótido en Ia preparación de un medicamento destinado a Ia disminución de Ia formación de metástasis a distancia en cáncer de mama.

Además, el silenciamiento de SnaiH en las células de cáncer de mama aumenta Ia sensibilidad a los agentes quimioterapéuticos relevantes en los tratamientos del cáncer de mama, por Io que en otra realización particular, el oligonucleótido se emplea en Ia preparación de un medicamento destinado al aumento de Ia sensibilidad a agentes quimioterapéuticos, preferiblemente gemcitabina y docetaxel.

Finalmente, en otro aspecto principal de Ia invención se contempla una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un oligonucleótido interferente de SnaiH , para su uso en el tratamiento del cáncer de mama.

En Ia presente invención, Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad de secuencia de un oligonucleótido de Ia invención (siRNA) o a Ia cantidad de una construcción génica (capaz de generar shRNA) que permita su expresión intracelular calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichas secuencias y construcciones y el efecto terapéutico a conseguir.

En una realización particular, el oligonucleótido incluido en Ia composición farmacéutica es RNA interferente de SnaiH (siRNA), de doble cadena, preferentemente de secuencias SEQ ID NO 1 y 2.

Los oligonucleótidos de RNA pueden emplearse "desnudos" (naked siRNA) en su estado nativo o con modificaciones que mejoren su estabilidad en condiciones fisiológicas.

De manera preferida, las modificaciones son químicas. Por modificaciones químicas

se entiende toda modificación en Ia composición química del nucleótido de siRNA que conduzca a incrementar Ia estabilidad del siRNA en suero, incrementar Ia estabilidad termodinámica, tropismo celular, potencia de silenciamiento y propiedades farmacocinéticas.

Ejemplos de modificaciones químicas son las contempladas en Ia Tecnología LNA (Locked Nucleid Acid) (Braasch DA, Jensen S, Liu Y, et al. RNA interference in mammalian cells by chemically-modified RNA. Biochemistry 2003;42(26):7967- 7975), los fosfotiatos (Crooke ST. Potential roles of antisense technology in cáncer chemotherapy. Oncogene 2000; 19(56):6651 -6659), los residuos añadidos a Ia cadena de ribosas : Chiu YL, Rana TM. siRNA function in RNAi: a Chemical modification analysis. RNA (New York, NY 2003;9(9): 1034-1048; Li CX, Parker A, Menocal E, Xiang S, Borodyansky L, Fruehauf JH. Delivery of RNA interference. CeII cycle (Georgetown, Tex 2006;5(18):2103-2109; lkeda Y, Taira K. Ligand- targeted delivery of therapeutic siRNA. Pharmaceutical research 2006;23(8):1631-

1640.

Pueden emplearse cualquiera de los sistemas de vehiculización, disponibles o en desarrollo actual, para favorecer Ia entrada de los oligonucleotidos en Ia celular En una realización particular se emplean liposomas, nanoparticulas (p.ej, quitosanos, polietilenglicol y oligodendrómeros), complejos peptídicos así como modificaciones de todos estos que permitan el direccionamiento de los oligonucleotidos a un tipo celular/ tejido concreto. Por complejos peptídicos se entiende un conjunto de péptidos de composición variable. La secuencia peptídica se puede establecer de manera que favorezca el tropismo a tipos celulares determinados, en función de Ia presencia de receptores celulares específicos para dichos secuencia peptídica {Crombez L, Charnet A, Morris MC, Aldrian-Herrada G, Heitz F, Divita G. A non-covalent peptide-based strategy for siRNA delivery. Biochemical Society transactions 2007;35(Pt 1):44-46), (Ikeda Y, Taira K. Ligand-targeted delivery of therapeutic siRNA. Pharmaceutical research 2006; 23(8): 1631 -1640), (Temming K, Schiffelers RM, Molema G, Kok RJ. RGD-based strategies for selective delivery of therapeutics and imaging agents to the tumour vasculature. Drug Resist Updat 2005;8(6):381-402). Así, en una realización particular, los complejos peptídicos pueden contener secuencias de péptidos reconocibles por receptores de células de mama.

En otra realización particular de Ia invención, el oligonucleótido empleado en Ia elaboración de Ia composición farmacéutica es DNA en forma de plásmido, lineal o formando parte de un vector viral, que sea capaz de dirigir, una vez dentro de Ia célula, Ia síntesis de un shRNA. Preferiblemente, el DNA presenta Ia secuencia SEQ ID NO 3.

Las secuencias de DNA no sólo han de entrar en Ia célula sino que han de llegar hasta el núcleo para que se pueda transcribir. Por esto, aparte de usar los mismos sistemas de vehiculización que los oligonucleótidos de RNA (liposomas, nanoparticulas (p.ej. quitosanos, polietilenglicol y oligodendrómeros) y complejos peptídicos), se emplean como vectores sistemas virales que contienen en su genoma Ia secuencia que permite Ia síntesis del shRNA deseado. Entre los sistemas utilizados están los Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, Virus asociados a

Adenovirus y Baculovirus.

Las composiciones farmacéuticas proporcionadas por Ia presente invención pueden ser administradas por cualquier vía de administración apropiada que dé como resultado una respuesta terapéutica adecuada frente al cáncer de mama, para Io cual dicha composición se formulará en Ia forma farmacéutica adecuada a Ia vía de administración elegida.

Estos resultados han permitido desarrollar nuevas aplicaciones en relación con el diagnóstico, pronóstico y tratamiento del cáncer de mama, que podrían ser extensibles a otros tipos de carcinomas y melanomas, en base a Ia expresión de SnaiH en diferentes tipos de tumores.

EJEMPLOS

Los materiales y métodos empleados en Ia realización de los ejemplos se describen a continuación:

Cultivo celular

Se hicieron crecer células MDA-MB-231 de cáncer de mama humano y sus líneas celulares derivadas en DMEM (Gibco BRL; San Diego, CA) complementado con FBS al 10%, L-glutamina 2 mM y antibióticos, a 37 ⁰ C en una atmósfera de CO ₂ al

5% humidificada.

Generación de vectores de expresión y líneas celulares estables

La generación del vector pcDNA3-Sna¡M-HA ya ha sido descrita (Peinado H. et al.

Snail mediates E-cadherin repression by the recruitment of the Sin3A/histone deacetylase 1 (HDAC1)/HDAC2 complex. Molecular and cellular biology 2004,24(1) :306-319). pcDNA3-Snail1-mutS-HA se construyó usando pcDNA3- Snail1-HA como molde para mutagénesis dirigida al sitio siguiendo protocolos convencionales. Los oligonucleótidos usados para Ia amplificación por plásmidos, con cinco mutaciones puntuales silenciosas, fueron: SEQ ID NO 4 y SEQ ID NO 5. Recientemente se ha descrito (Jorda M. et al. Upregulation of MMP-9 in MDCK epithelial cell Une in response to expresión of the Snail trasncription factor. J. CeII Sci 2005;118(Pt 15) .3371-3385) Ia generación de shRNA, que contiene secuencias de oligonucleótidos específicas frente a EGFP (proteína verde fluorescente potenciada) o Snaih de ratón/humano (SEQ ID NO 3), clonada en el vector pSuperior-Puro (Oligoengine, Seattle, WA). En dicho vector, Ia transcripción del shRNA está dirigida por el promotor H1. La secuencia completa de DNA que aparece en el vector para generación de shRNA se muestra en SEQ ID NO 6, que incluye Ia secuencia específica SEQ ID NO 3 y Ia secuencia que formará el "lazo" al transcribirse el DNA a RNA como shRNA. Todas las transfecciones se llevaron a cabo usando lipofectamina (Gibco BRL). Los vectores pSuperior-shEGFP (shEGFP) y pSuperior-shSnaiH (shSNAM) se transfectaron en células MDA-MB-231 , y se realizó Ia selección con puromicina 1 μg/ml durante 2-4 semanas. pcDNA3-Snail1- mutS-HA se transfectó en las líneas celulares MDA-MB-231-shSNAI1-C2/C4 y se seleccionó con G418 400 μg/ml durante 4-6 semanas. Se aislaron diez clones tras Ia transfección de shRNA en cada tipo celular y se caracterizaron individualmente, o se recogieron como clones reunidos en las transfecciones control.

RT-PCR v RT-PCR cuantitativa (αRT-PCR).

Se aisló el RNA total de las diferentes líneas celulares y se llevaron a cabo análisis de RT-PCR usando cebadores específicos para Snail 1 de ratón o humano y

GAPDH (Gliceraldehido 3 fosfato deshidrogenasa) {Bolos V. et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors. CeII Sci 2003; 116(Pt3):499-511; Cano A. et al. The transcription factor snail controls epithelial- mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature cell biology

2000; 2(2) :76-83; Pérez-Moreno et al. A new role for E12/E47 in the repression of E- cadherin expression and epithelial-mesenchymal transitions. J Biol Chem 2001; 276(29):27424-27431). La RT-PCR de los tumores se realizó tal como se describe en Peinado H. et al. A molecular role for lysyl oxidase-like 2 enzyme in snail regulation and tumor progresión. Embo J 2005; 24(1 '9) : 3446-3458). Para Ia qRT-

PCR, el cDNA de las células y los tumores se sintetizó usando el kit High Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems, Foster City, CA. La qRT-PCR se llevó a cabo en un sistema 7900HT Fast Real Time PCR (Applied Biosystems) según las instrucciones del fabricante.

Para RT-PCR de Snail2 humano, se usaron los cebadores directo (SEQ ID NO 7) e inverso (amplifica un fragmento de 810 pb) (SEQ ID NO 8).

Para el análisis de qRT-PCR de células y tumores, se usaron los siguientes cebadores: SNAH humano, SEQ ID NO 9 y SEQ ID NO 10; SNAI2 humano, SEQ ID NO 11 y SEQ ID NO 12; cadherina-E humana (CDH1), SEQ ID NO 13 y SEQ ID

NO 14; SPARC humana, SEQ ID NO 15 y SEQ ID NO 16; MMP2 humana, SEQ ID NO 17 y SEQ ID NO 18. Se realizaron qRT-PCR para genes de ID tal como se describió anteriormente (Xu, et al. 2005).

Extractos celulares y análisis de inmunotransferencia de tipo Western. Se obtuvieron extractos de células completas usando el tampón RIPA (Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, NaCI 150 mM, NP-40 al 1%, desoxicolato al 0,5%, SDS al 0,1%), que contiene inhibidores de proteasas. Para el análisis de inmunotransferencia de tipo Western, se cargaron 50 μg de proteínas totales de los diferentes extractos en geles de SDS-PAGE al 7,5, 10 ó 12%. La transferencia, el bloqueo y Ia incubación con los anticuerpos apropiados se llevó a cabo tal como se describe en Bolos V. et al. The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors.

Cell Sci 2003;116(Pt3):499-511; Cano A. et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature cell biology 2000; 3(3): 155-166; Pérez-Moreno et al. A new role for E12/E47 in the repression of E-cadherín expression and epithelial-mesenchymal transitions. J Biol Chem 2001; 276(29):27424-27431). Los anticuerpos primarios usados incluyeron: anti-D-tubulina monoclonal de ratón (1 :1000) (SIGMA Chemical Co, St. Louis, MO), anti-vimentina (1 :2000) (Babeo, Richmond, CA), anti-Snail1 (1 :40) (Franci et al. 2006), anti-Snail2 (1 :100) (Wu et al. 2005) y anti-SPARC 15G12, (1 :100) (Novocastra Laboratories, Newcastle upon Tyne, RU), anti-fibronectina policlonal de conejo (1:4000) (SIGMA Chemical Co) y anti-ID1 (1 :500) (Santa Cruz

Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Zimoprafía en gelatina

La zimografía en gelatina se llevó a cabo tal como se describe en Olmeda D. et al.

Snail silencing effectively suppresses tumour growth and invasiveness. Oncogene 2007;26(13):1862-1874 y Jorda M. et al. Upregulation of MMP-9 in MDCK epithelial cell Une in response to expresión of the Snail trasneription factor. J. CeII Sci 2005;118(Pt 15): 3371-3385). En resumen, se hicieron crecer las células en medios de crecimiento normal y se colocaron los medios libres de suero en cultivos confluentes durante 24 horas para recoger los medios condicionados. Se separaron 12 μg de medio condicionado y se analizaron en geles de SDS-PAGE al 7,5% que contenían gelatina al 0,1% y se trataron tal como se describió anteriormente (Olmeda D. et al. Snail silencing effectively suppresses tumour growth and invasiveness. Oncogene 2007;26(13):1862-1874 y Jorda M. et al. Upregulation of

MMP-9 in MDCK epithelial cell Une in response to expresión of the Snail trasneription factor. J. Cell Sci 2005; 118(Pt 15):3371-3385). Se tiñeron los geles con Azul Brillante de Coomassie R250 y se detectaron las actividades gelatinolíticas como bandas transparentes frente al fondo azul.

Ensayos de invasión

Se llevaron a cabo ensayos de invasión sobre cámaras de Boyden modificadas recubiertas con gel de colágeno tipo IV, tal como se describe en Cano A. et al. The

transcríption factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature cell biology 2000;3(3):155-166; Pérez-Moreno et al. A new role for E12/E47 in the repression of E-cadherin expression and epithelial- mesenchymal transitions. J Biol Chem 2001; 276(29):27 '424-27 '431; Olmeda D. et al. Snail silencing effectively suppresses tumour growth and invasiveness.

Oncogene 2007;26(13):1862-1874, comenzando con 1x10 ⁶ células sembradas y contando las células en Ia parte inferior del filtro 24 h tras Ia siembra.

Tumorigénesis, ensayos de metástasis espontánea y obtención de líneas celulares derivadas de ganglio linfático.

Se inyectaron ortotópicamente células MDA-MB-231 humanas originales y clones derivados de cultivos subconfluentes (1x10 ⁶ en 0,05 mi de medio de crecimiento libre de suero) en el panículo adiposo mamario de ratones inmunocomprometidos desnudos hembra Balb/c, de 8 semanas de edad (Charles River, Wilmington, MA).

El crecimiento de los tumores se midió cada dos días mediante Ia determinación de los dos diámetros externos ortogonales usando un calibrador. Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de 0,4 cm ³ , se extirparon quirúrgicamente y se trataron para análisis de histología, inmunofluorescencia y RT-PCR. Se generó un mínimo de 10 tumores por cada línea celular y, al menos, se analizaron 4 tumores diferentes derivados de cada línea celular. Para el ensayo de metástasis espontánea, tras Ia extirpación quirúrgica del tumor primario, los ratones se dejaron vivos durante otros 6 meses y después se sacrificaron. Los ganglios linfáticos contralaterales se extirparon entonces quirúrgicamente, se disecaron cuidadosamente y se cultivaron durante 3-4 semanas en presencia de puromicina (excepto en el caso de los derivados de animales a los que se inyectaron las células originales) para seleccionar las células MDA-MB-231 humanas resistentes a antibióticos. Los ratones se alojaron y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos y se usaron según las directrices institucionales y aprobadas por el Use Committee for Animal Care.

Análisis de inmunohistoαuimica, RT-PCR y TúNEL de los tumores primarios

Para Ia tinción inmunohistoquímica, una parte del tumor se fijó en formalina y se embebió en parafina y otra se congeló en nitrógeno líquido embebido en Tissue Tek

OCT Compound (compuesto para corte a temperatura óptima) y se almacenó a - 70 ⁰ C. Se tiñeron las secciones en parafina con hematoxilina y eosina o se inmunotiñeron con anti-Ki67 monoclonal de conejo (1 :200) (Clone SP6, Lab Vision Corporation, CA ₁ EE.UU.); las secciones congeladas se inmunotiñeron simultáneamente con anti-MMP-9 de conejo (1 :200), anti-CD31 de rata (1 :300)

(Chemicon, Billerica, MA), anti-ID2 policlonal de conejo (1 :100) (Santa Cruz Biotechnology) y anticuerpos secundarios apropiados, tal como se describe en Peinado H. et al. A molecular role for lysyl oxidase-like 2 enzyme In snail regulation and tumor progresión. Embo J 2005; 24(19) .3446-3458. Para el análisis de fragmentación del ADN, se analizaron secciones de criostato fijadas con paraformaldehído mediante el método TúNEL usando el kit CeII Death Detection in situ (Roche, Basilea, Suiza) según el protocolo del fabricante. Se realizaron análisis de RT-PCR en las secciones tumorales congeladas en nitrógeno líquido tras Ia extirpación cuidadosa de toda Ia piel circundante, tal como se describe en Olmeda D. et al. Snail silencing effectively suppresses tumour growth and invasiveness.

Oncogene 2007;26(13):1862-1874 y en Peinado H. et al. A molecular role for lysyl oxidase-like 2 enzyme in snail regulation and tumor progresión. Embo J 2005; 24(19):3446-3458.

Ensayos de sensibilidad a fármacos

La sensibilidad a fármacos se analizó con Ia concentración mínima dé fármacos que induce una reducción del 80% en el crecimiento celular en comparación con las células no tratadas (CI80). Las células que crecían exponencialmente se trataron con docetaxel 100 mM (Taxotere®, Aventis Pharma SA, París, Francia)

(Hernández-Vargas, et al. Molecular profiling of docetaxel cytotoxicity in breast cáncer cells: uncoupling of aberrant mitosis and apoptosis. Oncogene 2007;26(20):2902-2913) o gemcitabina 6 pM (Gemzar®, Lilly S.A, Indianápolis, IN) (Hernández-Vargas H. et al. Gene expression profiling of breast cáncer cells in response to gemcitabine: NF-kappaB pathway activation as a potencial mechanism of résistance. Breast cáncer research and treatment 2007; 102(2): 157-172) durante 48 horas. Las células tratadas y control se trataron entonces con tripsina y, tras centrifugación y lavado dos veces con PBS, se tiñeron con anexina-V-FITC/yoduro de propidio usando el kit Annexin V/FITC (MBL internacional, Woburn, MA) según

las instrucciones del fabricante. Las células teñidas se analizaron mediante citometría de flujo. Los resultados muestran Ia media ± DE de tres ensayos independientes.

Ejemplo 1. El silenciamiento estable de SnaiH en las células MDA-MB-231 aumenta los transcritos de cadherina-E y disminuye Ia expresión de los marcadores mesenquimáticos.

Para analizar directamente el papel de SnaiH en Ia metástasis y el crecimiento tumoral de los carcinomas de mama, se silenció de manera estable Ia expresión de

SNAH , sin afectar a Ia expresión de Snail2, en Ia línea celular de cáncer de mama humano desdiferenciada MDA-MB-231. Las células MDA-MB-231 originales son células altamente tumorigénicas y débilmente metastásicas, que presentan altos niveles de SnaiH y Snail2 y sin expresión de cadherina-E. Con el fin de obtener clones con SnaiH silenciado de manera estable, se transfectaron células MDA-MB-

231 con un vector pSuperior-shSNAH diseñado para reconocer a los mRNA de SnaiH tanto humano como de ratón y recientemente descrito como capaz de silenciar eficazmente SnaiH en células de carcinoma de ratón (Olmeda D. et al. Snail silencing effectively suppresses tumour growth and invasiveness. Oncogene 2007,26(13): 1862-1874). Tras Ia selección con el antibiótico de selección puromicina, 1 Dg/ml, se aislaron al menos diez clones y se caracterizaron para determinar Ia expresión de SnaiH ; entre ellos, se seleccionaron los clones MDA- MB-231-shSNAI1-C2 y -C4 (denominados de aquí en adelante shSNAI1-C2 y shSNAI1-C4) como los más representativos (figura 1A, B). Como control, se transfectó establemente una forma mutante de SnaiH de ratón en los clones shSNAI1-C2 y shSNAI2-C4. Esta forma mutante de SnaiH , fue obtenida por ingeniería genética para que no se reconociera por el siRNA de Snail 1 al llevar 5 mutaciones puntuales silenciosas (mutS), tal como se describe en el apartado de "Generación de vectores". Tras Ia selección con antibiótico (G480, 400 Dg/ml), se ^' reunieron las células (shSNAI1-C2+mutS y shSNAI1-C4+mutS). Como control adicional, se transfectó establemente una secuencia de shRNA irrelevante frente a EGFP en células MDA-MB-231 (células shEGFP). Tal como se muestra en Ia figura 1A, Ia expresión estable de shSNAM condujo a Ia inhibición casi completa de Ia expresión de SnaiH , tanto al nivel del mRNA, como de Ia proteína en las células

MDA-MB-231 , sin afectar significativamente a Ia expresión de Snail2 (figura 1 B y C, comparación de las células control y MDA-MB-231 originales con shSNA1-C2 y C4). La sobreexpresión de Ia forma mutante de SnaiH de ratón (mutS) en las células shSNA1-C2+mutS y shSNA1-C4+mutS se confirmó a los niveles del mRNA y de Ia proteína, obteniendo niveles similares o incluso superiores de Ia expresión de SnaiH a los observados en las células MDA-MB-231 originales (figura 1 A-C). Debido a Ia alta conservación de las secuencias de SnaiM de ratón y ser humano (Nieto MA. The snail superfamily of zinc-finger transcription factors. Nat Rev Mol CeII Biol 2002;3(3):155-166; Manzanares M et al. The increasing complexity of the Snail gene superfamily in metazoan evolution. Trenos Genet 2001; 17(4):178-181), se detecta mRNA de SnaiH mutS de ratón en las reacciones de PCR y qRT-PCR que utilizan oligonucleótidos frente a SnaiH humano (figura 1A, panel superior y figura 1 B, panel izquierdo), así como en Ia reacción cruzada de los anticuerpos frente a SnaiH (figura 1C, panel superior), Io que explica los niveles aumentados de SnaiM en las células que llevan el alelo SnaiH mutante, aunque no puede descartarse completamente Ia modesta expresión de nuevo de Snail 1 humano endógeno en estas células. También se confirmó Ia expresión y Ia localización nuclear de Ia proteína Snail 1 mutS en los clones de sobreexpresión mediante inmunofluorescencia con anticuerpos anti-HA (figura 2). Puesto que SnaiH es un inductor auténtico de Ia TEM (Cano A. et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature cell biology 2000;2(2):76-83;) se analizó el efecto del silenciamiento de SnaiH en las células MDA-MB-231 en algunos marcadores epiteliales (cadherina-E) (hE-CD) y mesenquimáticos (fibronectina y vimentina). El silenciamiento estable de SnaiH en las células MDA-MB-231 indujo un modesto aumento en los niveles de mRNA de cadherina-E de hasta 2,5 veces, medido mediante qRT-PCR (figura 1 , derecha). De manera importante, el aumento en los transcritos de cadherina-E detectado en los clones shSNAI1-C2 y -C4 se invirtió completamente mediante Ia sobreexpresión del alelo mutS (figura 1 B, comparar los niveles de hE-CD de shSNAI1-C2 y -C4 con shSNAI1-C2+mutS y -C4+mutS, respectivamente). Pese al aumento en los niveles de mRNA, no pudo detectarse Ia expresión de Ia proteína cadherina-E en los clones en los que se interfiere SnaiH . Por el contrario, se observó una fuerte disminución en Ia expresión y/u organización de los marcadores mesenquimáticos fibronectina y vimentina en los clones shSNAI1-C2 y -C4 (figura 1C y figura 2) un efecto también

suprimido por Ia sobreexpresión del mutante silencioso de ratón, mutS-Snail (figura 1C y figura 2). La detección de SnaiH muts, que porta el epitopo HA, solo se detectó en el núcleo de las células shSNAI1-C2-mutS y shSNAI1-C4-mutS, como cabía esperar (figura 2, paneles de Ia derecha). Tomados juntos, estos resultados confirmaron que el silenciamiento de SnaiH induce una transición de mesénquima a epitelio parcial en las células MDA-MB-231.

Ejemplo 2. El silenciamiento estable de SnaiH inhibe el comportamiento invasivo de las células MDA-MB-231

A continuación se estudió el efecto del silenciamiento de SnaiH en el comportamiento invasivo de las células MDA-MB-231. Para este fin, se analizó en primer lugar, mediante qRT-PCR, los niveles de expresión de genes diana SnaiH , descritos recientemente, implicados en Ia invasión y Ia metástasis, tales como MMP2, SPARC, ID1 y Ia proteína íntimamente relacionada ID2 (Jorda M. Et al. ld-1 is induced in MDCK epithelial cells by activated Erk/MAPK pathway in response to expression of the Snail and E47 trasncription factors. Exp CeII Res 2007; Minn AJ. Et al. Genes that medíate breast cáncer metástasis to lung. Nature 2005; 436(7050): 518-524; Moreno-Bueno. Et al. Genetic profϊling of epithelial cells expressing e-cadherin repressors reveáis a distinct role for snail, slug and e47 factors in epithelial-mesenchymal trasnition. Cáncer Research 2006,66(19):9543- 9556; Stighall M. et al. High ID2 protein expresión correlatos with a favourale prognosis in patients with primary breast cáncer and reduces cellular invasiveness of breast cáncer cells. International journal of cáncer 2005:115(3):403-411) en las células MDA-MB-231 con SnaiH silenciado. El silenciamiento de SnaiH indujo una fuerte disminución en Ia expresión de SPARC e ID1 en el mRNA (figura 3A) y en los niveles de proteína total (figura 3B). Por el contrario, los niveles de mRNA de ID2 aumentaron fuertemente tras el silenciamiento de SnaiH , De manera importante, los efectos del silenciamiento de SnaiH en Ia expresión de los genes SPARC e ID se invirtió completamente tras Ia sobreexpresión del alelo mutS-SnaiH (figura 3 A, B; comparar shSNAI1-C2 y -C4 con shSNAI1-C2+mutS y -C4+mutS y las células MDA-MB-231 originales), Io que apoya un efecto específico del silenciamiento de SnaiH sobre estos genes.

Por otra parte, los niveles de transcrito de otra diana de SnaiH notificada, MMP2 (Miyoshi A. et al. Snail and SIP1 increase cáncer invasión by upregulating MMP family in hepatocellular carcinoma cells. British journal of cáncer 2004; 90(6): 1265- 1273; Yokoyama K. et al. Increased invasión and matriz metalloproteinase-2 expression by Snail induced mesenchymal transition in squoamous cell carcinomas.

Internacional journal of oncology 2003;22(4):891-898) no variaron tras el silenciamiento de SnaiH o Ia sobreexpresión de mutS-SnaiH en las células MDA- MB-231 (figura 3A, panel superior), porque los niveles de MMP2 secretados en las células MDA-MB-231 originales fueron muy bajos (figura 3C). Por el contrario, las células MDA-MB-231 originales mostraron altos niveles de actividad de metaloproteinasa MMP9, otra diana de SnaiH (Jorda M. et al. Upregulation of MMP- 9 in MDCK epithelial cell Une in response to expression of the Snail transcription factor. J. Cell Sci 2005;118(Pt 15) :337 '1-3385), y el silenciamiento de SnaiH redujo de hecho Ia actividad de MMP9 (figura 3C), un efecto revertido completamente por Ia sobreexpresión del alelo mutS- SnaiH (figura 3C, comparar shSNAI1-C2 y C4 con C2-mutS y C4+mutS, respectivamente, y las células originales), Io que confirmó el efecto específico del silenciamiento Snail 1 sobre Ia regulación de MMP9.

Para comprobar que los cambios moleculares observados tras el silenciamiento de SnaiM en las células MDA-MB-231 podrían influir en su fenotipo invasivo, se realizaron ensayos de invasión in vitro en cultivos crecidos sobre filtros (0,8 μm de poro) (transwells) recubiertos con una matriz de colágeno tipo IV. Las células se sembraron en placa por encima de Ia matriz y se permitió que migraran durante 24 horas. Tras este tiempo, las células que habían migrado hacia Ia cámara inferior se sometieron a tratamiento con tripsina y se contaron. Los resultados muestran Ia media ± DE de tres ensayos independientes. Análisis ANOVA; ^** p<0,01. Tal como se muestra en Ia figura 3D, el silenciamiento de SnaiH redujo drásticamente Ia capacidad de las células MDA-MB-231 para migrar en matrices de colágeno IV y se logró una reversión de más del 50% en Ia capacidad de invasión tras Ia expresión de mutS-SnaiMen los clones con SnaiH silenciado (figura 3D, comparar shSNAH-

C2 y -C4 con shSNAI1-C2-mutS y -C4-mutS, respectivamente, y con las células originales), Io que confirma que el silenciamiento específico de SnaiH confiere un fenotipo menos invasivo en las células MDA-MB-231.

Ejemplo 3. La interferencia de SnaiH disminuye drásticamente las propiedades tumorigénicas de las células MDA-MB-231

Los dos clones con SnaiH silenciado independientes, shSNAI1-C2 y C4 y las células derivadas tras Ia expresión de mutS-SnaiH (C2+mutS y C4+mutS), junto con las células MDA-MB-231 originales y MDA-MB-231-shEGFP control se inyectaron ortotópicamente en el panículo adiposo mamario de ratones desnudos. En Ia tabla 1 se muestran datos comparativos de Ia incidencia del tumor de las células MDA-MB-231 originales, MDA-MB-231-shEGFP control, clones en los que se interfiere SnaiH de manera estable (C2 y C4) y clones estables obtenidos tras Ia expresión del muíante silencioso de SnaiH de ratón (mutS). Las líneas celulares indicadas se inyectaron en el panículo adiposo mamario de ratones desnudos hembra de 8 semanas de edad. La incidencia se representa como el porcentaje de los tumores inducidos por ratón a los 2 meses tras Ia inyección. Tal como se muestra en Ia tabla 1, Ia incidencia de tumores primarios inducida por las células MDA-MB-231 originales y las células MDA-MB-232-shEGFP control era muy alta (80-90% de los sitios inyectados), pero las células MDA-MB-231-shSNAI1 indujeron tumores con frecuencias mucho menores (sólo el 30-40% de los sitios inyectados). De manera significativa, Ia incidencia de los tumores primarios se recuperó completamente tras Ia expresión de Ia forma mutS-SnaiH (tabla 1, comparar shSNAI1-C2 o C4 con shSNAI1-C2+mutS y -C4+mutS y las células control).

Tabla 1. Datos comparativos de incidencia tumoral

Además, se detectó una reducción drástica en Ia tasa de crecimiento de los

tumores inducidos por las células con SnaiH silenciado (figura 4A). Se observó una reducción de más del 95% en el volumen de los tumores inducidos por los clones shSNA1-C2 y C4 a los 40 días tras Ia inyección, junto con un aumento de 2 veces en Ia latencia del tumor (días hasta alcanzar un tamaño de tumor de 0,1 cm ³ ) en comparación con los tumores inducidos por las células originales y control. De manera importante, Ia tasa de crecimiento tumoral se recuperó casi completamente tras Ia expresión de nuevo del alelo mutS-SnaiH (figura 4A, comparar shSNA1-C2 o shSNA1-C4 con C2+mutS y C4+mutS, respectivamente, y con las células control).

El análisis mediante RT-PCR de los tumores derivados de las diferentes líneas celulares indicó que los transcritos de SnaiH permanecían silenciados en todos los tumores derivados de los clones shSNAM , mientras que no se observaron cambios significativos en Ia expresión del gen Snail2 homólogo (figura 4B). De hecho, el silenciamiento de Snail2 en las células MDA-MB-231 no produjo ninguna diferencia en Ia tasa de crecimiento o incidencia del tumor, Io que apoya adicionalmente un efecto específico del silenciamiento de SnaiH en el comportamiento tumorigénico de las células MDA-MB-231 de carcinoma de mama.

De manera interesante, se detectó un aumento de hasta 6 veces en los niveles de mRNA de cadherina-E y una fuerte disminución en los niveles de los transcritos de

SPARC en los tumores inducidos por las células shSNAI1-C2 y -C4 (figuras 4C, paneles superiores). De manera similar al comportamiento observado in vitro, estos cambios de expresión se anularon en los tumores inducidos por las células shSNAl que expresan el alelo mutS-SnaiH (figura 4C, superior). La regulación de Ia expresión de ID2 también se mantuvo entre Ia situación ex vivo e in vitro con un aumento de hasta 1 ,8 veces en los niveles de mRNA detectados en los tumores inducidos mediante las células con SnaiH silenciado (figura 4C, paneles de ID2). De manera sorprendente, los niveles de mRNA de ID1 detectados en los tumores inducidos por los clones shSNAl y las células derivadas mutS-SnaiH mostraron el patrón inverso al observado en cultivo (figura 4C panel de ID1), Io que indica un mecanismo diferencial de Ia regulación para Ia expresión de ID1 entre Ia situación

' ex vivo e in vitro.

Para comprender adicionalmente el efecto del silenciamiento por SnaiH sobre el

fenotipo de los tumores inducidos por MDA-MB-231 , se analizaron cortes en parafina de tumores de tamaño similar generados por los diferentes clones celulares mediante histología e inmunohistoquímica. No se detectaron diferencias significativas en Ia histología de los tumores inducidos por las células shSNAI1-C2 con respecto a los inducidos por las células C2 control o que sobreexpresan mutS-

SnaiH (figura 5A, a-f). Sin embargo, se encontraron diferencias principales en el número y Ia extensión de zonas necróticas detectadas dentro de los tumores, que fueron más destacadas en los derivados de las células con SnaiH silenciado (figura 5A, a-c). De manera concomitante con el aumento en las zonas necróticas, se detectó un aumento en el número de células apoptóticas (hasta 27 veces) dentro de los tumores derivados de los clones con SnaiH silenciado, en comparación con los tumores de las células control (figura 5B, j-k). Además, Ia inmunotinción frente al marcador de Ia proliferación Ki67 mostró que el silenciamiento de SnaiH indujo una reducción drástica en el potencial proliferativo del tumor (figura 5A, g-h). Los análisis de inmunofluorescencia de los marcadores invasivos y angiogénicos en los tumores confirmaron los datos obtenidos mediante qRT-PCR. Se observó un fuerte aumento en Ia expresión de ID2 con marcada localización citoplasmática (figura 5B, g-i), mientras que se observó una reducción en el número de células positivas para MMP-9 y CD31 en los tumores inducidos por células shSNAI1-C2 (figura 5B, a-c y d-f, respectivamente). Los cambios en los marcadores anteriores y en el potencial tumoral proliferativo y anti-apoptótico se recuperaron completamente en los tumores inducidos tras Ia expresión del alelo mutS-SnaiH en las células shSNA1-C2 (figura 5A, B, comparar los paneles derechos con el resto), Io que confirmó el efecto específico del silenciamiento de SnaiH en el comportamiento tumorigénico de las células MDA-MB-231.

Ejemplo 4. La expresión de SnaiH favorece Ia metástasis de los ganglios linfáticos distantes.

Una vez establecido el efecto del silenciamiento de SnaiH en el comportamiento tumorigénico de las células MDA-MB-231 , se analizó las consecuencias de Ia disminución de SnaiH en las capacidades metastásicas de las células MDA-MB- 231. Para este fin, se llevó a cabo un ensayo de metástasis espontánea tras Ia

extirpación quirúrgica de tumores primarios inducidos por Ia inyección de células control y MDA-MB-231 con SnaiH silenciado en el panículo adiposo mamario. Seis meses después, se sacrificaron los ratones y se analizaron los órganos (pulmón, hígado y bazo) para determinar Ia aparición de lesiones metastásicas. No se detectó macrometástasis en ningún órgano de acuerdo con el bajo potencial metastásico espontáneo de las células MDA-MB-231 originales (Minn AJ. Et al. Genes that medíate breast cáncer metástasis to luna. NAture 2005; 436(7050): 518- 524; Kang Y. et al. A multigenic program mediatin breast cáncer metástasis to bone. Cáncer CeII 2003; 3(6): 537-549). Sin embargo, se observó inflamación de los ganglios linfáticos de las extremidades en Ia región contralateral en Ia mayoría de los animales. Por tanto, se analizó Ia existencia de metástasis en los ganglios linfáticos distantes mediante Ia extirpación quirúrgica del ganglio linfático contralateral. Además, se derivaron líneas celulares de los ganglios linfáticos, tras su disección cuidadosa y crecimiento en cultivo durante 3-4 semanas, en presencia de puromicina, para evitar el crecimiento de las células de ratón, y se seleccionaron las células MDA-MB-231 humanas resistentes a antibióticos. Sólo se obtuvieron 6 líneas celulares, de un total de 24 ratones con los ganglios linfáticos disecados: 1/6 de ratones a los que se inyectó MDA-MB-231 (denominadas 231-20), 2/6 de ratones a los que se inyectó MDA-MB-231-shEGFP (denominadas shEGFP-OI y shEGFP-2D), 1/6 de ratones a los que se inyectó shSNAI1-C2 (denominadas shSNAI1-C2-2D) y 2/6 de los ratones a los que se inyectó shSNAI1-C4 (denominadas shSNAI1-C4-SM y shSNAI1-C4-OI) (figura 6A). Para descartar Ia selección de células de ratón inmortalizadas, se analizó mediante PCR Ia presencia del gen amelogenina humano, usado frecuentemente en las pruebas forenses para el DNA humano y en Ia determinación del sexo (Mitchell RJ. Et al. An investigation of sequence deletions of amelogenin (AMELY), a Y-chromosome locus commonly used for gender determination. Annals of human biology 2006; 33(2): 227-240). Todas las líneas celulares seleccionadas, excepto 231-20, fueron positivas para Ia forma femenina del gen amelogenina (figura 6B), Io que confirmó su origen humano y su derivación de Ia metástasis de los ganglios linfáticos distantes de los tumores primarios inducidos por las células derivadas de MDA-MB-231 indicadas. El tamaño esperado del amplicón de amelogenina de PCR es de 977 pb para hembras y 788 pb para machos.

A continuación se analizó Ia expresión de SnaiH en las líneas celulares derivadas del ganglio linfático. Sorprendentemente, se detectó Ia expresión de SnaiH mediante RT-PCR e inmunotransferencia de tipo Western, en las cinco líneas celulares derivadas de ganglio linfático, independientemente de si el origen del tumor primario era a partir de células control MDA-MB-231-shEGFP o a partir de los clones silenciados MDA-MB-231-shSNAI1. Los niveles de SnaiM detectados fueron similares o incluso superiores a los observados en las células MDA-MB-231 originales (figura 7 A, B). La falta de interferencia de SnaiH observada en las células shSNA1-C2-2D, shSNA1-C4-SM y shSNA1-C4-OI derivadas de ganglios linfáticos no pudo atribuirse a Ia pérdida del casette de expresión de shSNAM mediante Ia reorganización del DNA, ya que todavía se detectó Ia presencia del vector pSuperior-shRNA, que contenía el inserto correspondiente al control de 64 nucleótidos específico o a Ia horquilla de SNAM mediante PCR en todas las líneas celulares derivadas de ganglios linfáticos (figura 6C). Además, también se detectó un aumento en los niveles de expresión de Snail2 endógeno, tanto a nivel del mRNA como de Ia proteína, en Ia mayoría de las líneas analizadas derivadas de ganglios linfáticos, en comparación con los detectados en las células MDA-MB-231 originales (figura 7A, B). Para obtener información adicional, se analizó el potencial tumorigénico de las células shSNAI1-C2-2D y shSNAI1-C4-SM derivadas de ganglios linfáticos, junto con las células MDA-MB-

231 originales, mediante inyección ortotópica. Los tumores inducidos por las células shSNAI1-C2-2D y shSNAI1-C4-SM derivadas de ganglio linfático crecieron a Ia misma tasa que los inducidos por las células MDA-MB-231 originales (figura 7C), a diferencia del potencial de crecimiento tumoral retrasado de las células MDA-MB- 231-shSNAI1-C2 y -shSNAI1-C4 (figura 5B). De hecho, el análisis de Ia expresión de cadherina-E, SPARC, ID1 e ID2 en los tumores inducidos por las líneas celulares derivadas de ganglios linfáticos revelaron niveles similares a los encontrados en los tumores inducidos por las células MDA-MB-231 originales.

Colectivamente, los datos in vivo confirman Ia fuerte presión selectiva en favor de las células que expresan SnaiM y Snail2 dentro de Ia subpoblación de células de carcinoma de mama MDA-MB-231 más agresivas / metastásicas.

Ejemplo 5. El silenciamiento estable de SnaiM confiere sensibilidad a Ia

quimioterapia

Para analizar si Ia resistencia a Ia apoptosis inducida por lesión genotóxica puede resultar afectado por el silenciamiento de SnaiH en las células MDA-MB-231 , se analizaron las propiedades proliferativas de las células con SnaiH silenciado, no detectando diferencias significativas en comparación con las células originales cuando se las hacía crecer en presencia o ausencia de suero en cultivos in vitro, basándose en Ia incorporación de BrdU (figura 8).

Para analizar si el silenciamiento de SnaiM podía conferir sensibilidad a Ia lesión genotóxica inducida, se trataron las células con dos fármacos quimioterápicos diferentes, docetaxel y gencitabina, usados comúnmente para tratar el cáncer de mama (Hernández-Vargas, et al. Molecular profiling of docetaxel cytotoxicity in breast cáncer cells: uncoupling of aberrant mitosis and apoptosis. Oncogene 2007; 26(20) : 2902-2913; Hernández-Vargas H. et al. Gene expresión profiling of breast cáncer cells in response to gemcitabine: NF-kappaB pathway activation as a potencial mechanism of resistance. Breast cáncer research and treatment 2007; 102(2): 157-172). Aunque ambos fármacos provocan un nivel modesto de apoptosis en las células MDA-MB-231 , el silenciamiento de SnaiH indujo una respuesta 2 veces superior a Ia apoptosis bajo ambos tratamientos quimioterápicos, un efecto anulado tras Ia expresión del mutante silencioso mutS-SnaiH en los clones shSNA1-C2 y -C4 (figura 9). De manera importante, el tratamiento de las líneas celulares derivadas de ganglios linfáticos (shSNAI1-C2-2D, shSNAI1-C4-SM y shSNAI1-C4-OI) con cualquiera de los fármacos indujo una baja respuesta apoptótica, similar a Ia mostrada por las células originales y control (figura 10), Io que confirma adicionalmente Ia asociación entre SnaiH , el comportamiento tumorigénico / metastásico y Ia resistencia a Ia apoptosis en las células MDA-MB- 231.

Tomados conjuntamente, los datos in vivo e in vitro demostraron que Ia expresión de SnaiH confiere propiedades a las células del carcinoma de mama que van más allá de Ia represión de cadherina-E y Ia inducción de Ia TEM, confiriendo Ia ventaja de crecimiento tumoral, Ia resistencia a los fármacos quimioterápicos y Ia invasión y las capacidades metastásicas.