本发明涉及生物医药领域，具体涉及诱导性多 能干细胞的制备方法以及用 于制备诱导性多能干细胞的培养基。 背景技术

胚胎干细胞来源于早期胚胎的内细胞团， 在体外培养中能够自我更新、 保持多能性并具有向三个胚层细胞分化的能力 。随着 1981年小鼠胚胎干细胞 和 1998年人的胚胎干细胞的建系成功 [1,2]，再生医学的研究真正地拉开了序 幕。 胚胎干细胞的应用前景主要是用于移植治疗， 以胚胎干细胞作为起始细 胞， 通过体外培养及定向分化， 可以为临床治疗提供大量的组织和器官的移 植材料。 通过对于胚胎干细胞自我更新和定向分化机制 的研究， 许多特异性 的细胞类型 (例如， 神经细胞、 心肌细胞等:)已经具备了成熟的分化方法的检 测标准， 这些研究为帕金森氏病、 老年痴呆症、 心肌损伤、 糖尿病、 肝硬化 等疾病的治疗带来了希望。 然而， 胚胎干细胞真正从体外研究到进入临床应 用还面临许多技术和伦理问题， 比如， 如何获得无免疫排斥的胚胎干细胞？ 如何获得病人自身的胚胎干细胞？ 等等。

2006年， Yamanaka实验室首先报道可以利用过表达 Oct4、 Sox2、 Klf4 和 c-Myc四种转录因子使小鼠的成纤维细胞逆分化� ��具有胚胎干细胞特性的 细胞， 并将其命名为诱导性多能干细胞 (Induced Pluripotent Stem Cells, iPS Cells)[3]。在这篇发表在《Cell》杂志上的文章� �， 研究人员最初是选取了 24 个与胚胎干细胞信号调控相关的基因作为候选 基因， 以逆转录病毒为基因转 染载体， 用混合有多种不同基因的病毒感染小鼠成纤维 细胞， 最终以细胞形 态学特征、 胚胎干细胞特定基因的表达以及畸胎瘤的形成 等指标作为 iPS细 胞多能性的鉴定指标。他们在实验中最终将 24个候选基因减少到 Oct4、Sox2、 Klf4和 c-Myc这四个转录因子。 虽然在这篇文章中， 研究人员最终没有得到 嵌合体小鼠， 但是直接从已分化的细胞得到干细胞为胚胎干 细胞领域甚至生 命科学领域都带来了概念性的革新。 iPS 细胞诱导技术的出现也引起了人们 对其生物医学应用的极大关注， 因为我们可以病人的体细胞为来源得到病人 特异的 iPS细胞， 这种 iPS细胞又可以分化为具有功能的细胞、 组织和器官， 用于疾病治疗。 这样的应用方式可以避免免疫相容性和伦理问 题。

2007年，三个不同的实验室均发表文章报道获� �了具有种系嵌合能力的 小鼠 iPS细胞 [4-6]。在此之后，也陆续有实验室报道获得了� ��的 iPS细胞 [7, 8]。 2009年， 研究人员首次利用 iPS细胞通过四倍体囊胚注射得到存活并具有繁 殖能力的小鼠， 证明了 iPS细胞具有真正的全能性 [9]。 iPS作为诱导产生多 能性干细胞的一种技术， 在临床疾病治疗方面的应用价值是巨大的， 因为它 不像传统的核移植或者细胞融合等获取干细胞 的方式那样需要人的卵子或人 的胚胎干细胞， 并且它由成体细胞重编程为干细胞的特性避免 了免疫排斥使 得自体移植变得更加可行； 另一方面， iPS对于干细胞自我更新机制的研究、 干细胞信号调控的研究以及很多疾病的研究都 有很大意义。

但是， iPS 细胞的应用仍然有两大问题， 安全问题和诱导效率问题。 在 生物安全问题方面， 最初实验体系中过表达的外源基因中含有两个 癌基因 (c-Myc和 Klf-4)， 并且外源基因的导入方式是逆转录病毒， 病毒在基因组中 有多个拷贝的插入也会导致基因突变及癌变。 因此， 研究人员正在致力于优 化 iPS技术使其应用的安全性增加， 例如， 减少转录因子的数目 [10, 11]， 或 者使用非整合到基因组的基因转染方法 [12]， 还有直接添加透膜的转录因子 蛋白的形式进行重编程 [13]。 但是， 这些方法会导致 iPS 细胞的诱导效率更 加低下， 目前 iPS细胞的形成效率一般都低于 1 %， 这对 iPS细胞的发展和 应用造成了巨大障碍。 因此， 寻找能够提高 iPS细胞诱导效率的培养条件、 发明内容

因此，针对现有技术中存在的问题，本发明人 进行了广泛和深入的研究， 最终完成本发明。

为了提高 iPS细胞的诱导效率， 本发明提供了一种诱导性多能干细胞的 制备方法， 该方法包括以下歩骤：

歩骤 1， 将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；

歩骤 2， 使用添加了锂盐的培养基培养歩骤 1中导入了干细胞多能性因 子的体细胞； 以及

歩骤 3， 鉴定诱导性多能干细胞克隆。

优选地， 所述方法进一歩包括将报告基因导入体细胞以 此通过报告基因 来指示所述诱导性多能干细胞的产生及其产生 效率。 且更优选地， 所述报告 基因为 Oct4-GFP或 Nanog-GFP， 且更优选为 Oct4-GFP。

优选地， 在歩骤 1中， 将所述干细胞多能性因子的 cDNA以病毒感染方 式导入小鼠胚胎成纤维细胞。

优选地，在歩骤 1中，所述干细胞多能性因子可选自 Oct4、 Sox2、 Soxl、 Klf4、 Klf2、 Klf5、 Nanog, c-Myc、 L-Myc、 N-Myc、 Lin28和 Esrrb中。 且 更优选地， 所述干细胞多能性因子可包括 Oct4、 Sox2、 Klf4和 c-Myc。 且更 优选地， 所述干细胞多能性因子可包括 Oct4、 Sox2和 Klf4。

优选地， 在歩骤 2中， 所述锂盐包括氯化锂、 碳酸锂、 醋酸锂、 溴化锂、 门东氨酸锂、 γ亚麻酸锂、 肝素锂、 硫酸锂、 硝酸锂等所有包含锂离子的化

^口

子

更优选地， 在歩骤 2中， 所述锂盐为氯化锂。

优选地， 所述锂盐的工作浓度为 0.1-40mM。更优选地， 所述锂盐的工作 浓度为 0.5-20 mM。 且更优选地， 所述锂盐的工作浓度为 1 -10 mM。 且更优 选地， 所述锂盐的工作浓度为 5- 10 mM。 且最优选地， 所述锂盐的工作浓度 为 10 mM。

歩骤 2中使用的培养基可为添加有 15%胎牛血清、 1000U/mL白血病抑 制因子 (LIF)、 L-谷氨酰胺、 非必需氨基酸、 青霉素 /链霉素和 β-巯基乙醇的 DMEM(Dulbcco's Modified Eagle's Medium) ( mES培养基） 以及添加有 15% 替代血清、 1000U/mL白血病抑制因子 (LIF)、 L-谷氨酰胺、 非必需氨基酸、 青霉素 I链霉素和 β-巯基乙醇的 Knockout DMEM ( KSR培养基）。

优选地， 所述歩骤 2具体包括如下歩骤：

将歩骤 1中制备的导入了四因子 (Oct4、 Sox2、 Klf4和 c-Myc)或三因子 (Oct4, Sox2、 Klf4)的小鼠胚胎成纤维细胞在第二天消化并接� ��到饲养层细胞 中使用 mES培养基培养， 并在第三天使用添加了锂盐的 mES培养基培养， 在第六天换为添加锂盐的 KSR培养基培养， 在第八天换为 KSR培养基继续 培养； 以及

挑选具有良好干细胞形态或 Oct4-GFP阳性的克隆进行传代。

"良好干细胞样形态"是指与小鼠干细胞形态相� ��的克隆。 " Oct4-GFP 阳性"是指转基因 Oct4-GFP报告基因阳性的克隆。 Oct4是干细胞特异性基 因， 其表达比较真实地表征小鼠胚胎成纤维细胞已 经重编程为干细胞。

歩骤 3中， 鉴定诱导多能性干细胞克隆包括 AP染色， 内源 Oct4表达检 测， 荧光定量 PCR检测多能性标志物表达水平， 外源病毒基因的沉默， 畸胎 瘤的形成， 嵌合体的形成， 以及是否有生殖系传递 (germ line transmission)。

本发明的方法中， 优选地， 所述体细胞来自哺乳动物的体细胞。 且更优 选地， 所述哺乳动物选自小鼠、 大鼠、 兔、 猪、 羊、 牛、 猴或人。

此外， 本发明提供了一种用于制备诱导性多能干细胞 的培养基， 其进一 歩包含锂盐。 优选地， 所述锂盐包括氯化锂、 碳酸锂、 醋酸锂、 溴化锂、 门东氨酸锂、 γ亚麻酸锂、 肝素锂、 硫酸锂、 硝酸锂等所有包含锂离子的化学品。

且更优选地， 所述锂盐为氯化锂。

优选地， 所述锂盐的工作浓度为 0.1-40 mM。 更优选地， 所述锂盐的工 作浓度为 0.5-20 mM。 且更优选地， 所述锂盐的工作浓度为 1-10 mM。 且更 优选地， 所述锂盐的工作浓度为 5-10 mM。 且最优选地， 所述锂盐的工作浓 度为 10 mM。

锂盐浓度超过 40 mM时， 长期培养将导致细胞死亡； 锂盐浓度低于 0.1 mM时， 不能显著增加 iPS细胞的诱导效率。

优选地， 所述培养基为添加了锂盐的 mES培养基和添加了锂盐的 KSR 培养基。

本发明的锂盐能高效产生 iPS细胞。 流式细胞计数实验计算效率显示添 加锂盐的实验组比对照组提高约 5倍 (转导四因子实验)和 60倍 (转导 3因子实 验：)。在 iPS诱导过程中添加锂盐也可以加快重编程的过 程， 添加锂盐的实验 组在感染第 8天即可检测到 Oct4-GFP阳性的克隆， 而对照组一般要到 10天 以后才能检测到 Oct4-GFP阳性的克隆。利用锂盐诱导的 iPS细胞具有良好的 全能性， 转导四因子或三因子的 iPS克隆均能形成嵌合体小鼠， 其中四因子 iPS 的嵌合体小鼠实现了生殖系传递， 并产下后代。 本发明提供的高效诱导 iPS细胞的方法对推动 iPS的基础研究和临床应用有着重要的意义。 附图说明

图 1为利用添加锂盐的干细胞培养基促进 iPS细胞的形成的实验操作流 程图。

图 2 显示了添加锂盐的干细胞培养基提高四因子 (Oct4、 Sox2、 Klf4、 c-Myc)诱导 iPS效率并加快 iPS诱导进程。 A为显示感染后第 10天 96孔板 内一孔的代表性图像的照片， 其中， 10 mM LiCl 处理的孔中出现较多的 Oct-GFP阳性克隆； B为显示对 Oct-GFP阳性克隆的统计数据的图， 在感染 后第 8天， LiCl处理的孔中即能观察到 10个左右 Oct-GFP阳性克隆， 而对 照孔则没有； 第 10天， LiCl处理的孔中的 Oct-GFP阳性克隆数能达到 20个 左右。 *， p<0.05; C为显示添加不同浓度 LiCl的 Oct-GFP阳性克隆的统计数 据的图， 可以观察到明显的剂量效应， 其中 LiCl浓度为 10 mM时效果最为 显著。 *， p<0.05

图 3显示了流式细胞仪检测锂盐提高四因子诱导 iPS效率。 A为显示了 感染后第 12天细胞消化后经流式细胞仪分析的 GFP阳性细胞百分比的图； B 为显示了 3次独立实验统计数据的图。 ***， p<0.001 o

图 4显示了添加锂盐的干细胞培养基提高三因子 (Oct4、 Sox2、 Klf4)诱导 iPS效率。 A为显示了对 Oct-GFP阳性克隆的统计数据的图， 在感染后第 14 天， 5 mM或 10 mM的 LiCl均能显著提高 iPS诱导效率； B为显示了感染后 第 16天细胞消化后流式细胞仪检测 GFP阳性细胞百分比的图。 *， p<0.05， **， ρ<0·01。

图 5显示了碱性磷酸酶染色及免疫荧光染色。 上半部分显示在 iPS细胞 系具有类似胚胎干细胞的形态， 强烈的表达 Oct4-GFP， 碱性磷酸酶染色呈阳 性并且均一。 下半部分为干细胞特异性蛋白 Nanog和 SSEA-1的免疫荧光染 色， iPS细胞系表达这两种干细胞特异性蛋白。

图 6显示了荧光定量 PCR检测干细胞特异基因的表达和外源病毒基因 的 沉默。 A、 以小鼠胚胎成纤维细胞为阴性对照， 小鼠胚胎干细胞系 E14细胞 为阳性对照， 检测干细胞特异基因的表达。 所有四因子及三因子加锂盐诱导 的 iPS克隆均高表达干细胞特异基因， 包括内源 Oct4、 内源 Sox2、 Nanog和 Rexl ; B、 以病毒感染后 4天的小鼠胚胎成纤维细胞为阳性对照， ES细胞为 阴性对照，检测外源病毒基因的沉默。所有四 因子及三因子加锂盐诱导的 iPS 克隆均显示良好的外源病毒基因沉默。

图 7显示了四因子加锂盐诱导的 iPS形成畸胎瘤实验。由组织结构判断， iPS 细胞系能够分化形成三个胚层的特有组织， 左侧为属于外胚层的表皮样 结构， 中间为属于中胚层的软骨样及肌肉样结构， 右侧为属于内胚层的消化 道管腔结构。

图 8显示了四因子加锂盐诱导的 iPS细胞形成嵌合体及生殖系传递实验。 左侧为 4因子加锂盐处理得到的 iPS细胞系具有生殖系传递能力， 右侧为 3 因子加锂盐处理得到的 iPS细胞系具有嵌合体形成能力。 具体实施方式

定义和技术

除非另外指明， 本发明的实验使用分子生物学、微生物学、细 胞生物学、 免疫学和重组 DNA传统技术，其属于本领域技术范围。参见例 如， Sambrook, Fritsch和 Maniatis, 分子克隆实验指南， 第三版（2002) ; Current Protocols in Molecular Biology ( F. M. Ausubel 等人编著 （1987 ) )； 丛书 Methods in Enzymology (酶学方法 ) ( Academic Press, Inc. )； PCR2： A Practical Approach (PCR实验方法） （M. J. MacPherson, B. D. Hames和 G. R. Taylor编著， ( 1995))； Antibodies, A Laboratory Manual and Animal Cell Culture (抗体实 验手册及动物细胞培养） (R. I. Freshney编著， ( 1987))； Handbook of Stem Cells (干细胞手册）， 卷 2 (W. French等人编著)。

除非另外说明， 本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规 理解的含 义， 为了便于理解本发明， 将本文中使用的一些术语进行了下述定义。

本文所述的 "诱导性多能干细胞"（iPS细胞:)是这样的细胞� � 其来源是体 细胞通过导入干细胞多能性因子在体外重编程 而成。 这样的细胞在胚胎干细 胞（ES)培养条件下， 与 ES细胞在细胞形态、 生长特性、 特异性基因表达、 DNA甲基化方式等性质均与小鼠 ES细胞非常相似， 而且在畸胎瘤形成、 嵌 合体动物形成和生殖系传递等方面也与小鼠 ES细胞非常相似。

本文所述的 "诱导体细胞重编程的干细胞多能性因子"是维� ��干细胞多 能性的关键因子， 通过向体细胞导入这些因子可以诱导体细胞重 编程为干细 胞。已有多篇文献报导了多个这样的可以诱导 重编程的因子 [14-18]。优选地， 所述的多能性因子包括选自 Oct4、 Sox2(或 Soxl)、 Klf4(或 Klf2或 Klf5)、 Nanog, c-Myc (或 L-Myc或 N-Myc)、 Lin28及 Esrrb中的一个或多个。 上述 干细胞多能性因子可以根据需要来源于任何物 种， 优选为小鼠的干细胞多能 性因子。

本文所述的 "诱导重编程"（有时也仅被简化为 "诱导"） 是指将体细胞 去分化为多能性干细胞的过程。 优选地， 通过将维持干细胞多能性所需的多 能性因子的 cDNA导入体细胞可以诱导体细胞去分化为多能� �细胞。 其中， 优选地， 所述的多能性因子包括选自 Oct4、 Sox2(或 Soxl)、 Klf4(或 Klf2或 Klf5)、 Nanog, c-Myc (或 L-Myc或 N-Myc)、 Lin28及 Esrrb中的一个或多个。

将所述干细胞多能性因子的 cDNA导入体细胞的方法可采用多种方法， 包括病毒感染、 脂质体转染、 电穿孔、 粒子轰击、 转座子介导的插入表达、 穿膜蛋白、 药物诱导等的各种将 DNA转入细胞的方法。 优选地， 使用包含 cDNA的病毒载体进行转染。 所述病毒载体包括慢病毒、 逆转录病毒、 腺病 毒等多种病毒载体。 优选地， 使用逆转录病毒载体 （PMX载体）。

本文所述的 "培养基"可为添加有 15%胎牛血清、 1000U/mL白血病抑 制因子 (LIF)、 L-谷氨酰胺、 非必需氨基酸、 青霉素 /链霉素和 β-巯基乙醇的 DMEM(Dulbcco's Modified Eagle's Medium) (mES培养基） 以及添加有 15% 替代血清、 1000U/mL白血病抑制因子 (LIF)、 L-谷氨酰胺、 非必需氨基酸、 青霉素 I链霉素和 β-巯基乙醇的 Knockout DMEM (KSR培养基）。

本发明所述的 "报告基因"是指能够指示细胞已经转变到类似� ��胎干细 胞的阶段， 包括利用转基因或同源重组手段加入一段荧光 蛋白序列或针对抗 生素的抗性基因序列， 这段序列处于胚胎干细胞特异表达的一些基因 的启动 子控制下， 故而可以在细胞到达类似胚胎干细胞状态时激 活这段荧光蛋白或 抗性基因的表达， 从而使这个细胞具有某些可以被检测的特征。 本实施例中 使用的小鼠胚胎成纤维细胞为 OG2 (Oct4-GFP ^+/ —)细胞， 分离自纯合 OG2 (Oct4-GFP ^+/+ )雄鼠与 129母鼠交配产生的 13.5天的胚胎。

本发明所述的检测细胞多能性的方法是本领域 技术人员熟知的，包括 AP 染色， 细胞荧光染色， 荧光定量 PCR分析干细胞特异基因表达及病毒基因的 沉默， 分析体内分化为畸胎瘤的能力， 嵌合鼠的形成及生殖系的传递。 实施例

下列实施例举例说明了发明人的标准实验室实 践， 用于示范本发明的模 式， 而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范 围。

本发明中所用技术概述：

除了特别说明， 本说明书中提及的各种物质均购自 Invitrogen。

反转录病毒生产以及产生 iPS细胞的实验过程如下：

从 Addgene公司购置包含小鼠 Oct4、 Sox2、 Klf4、 c-Myc的 cDNA的反 转录病毒载体 （pMXs)。 使用 Fugene HD (罗氏） 按其产品说明书进行转染 至 PlatE细胞以产生病毒， 48小时后收集病毒上清液并且过滤， 补充 1 ,5-二 甲基 -1 ,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物（8 mg/L)后感染小鼠胚胎成纤维细胞。 添加病毒上清液的当天被定义为第 0天。 将病毒感染后的成纤维细胞培养在 mES培养基中， 在感染后 14-18天（4因子感染实验）或 20-24天（3因子感 染实验） 挑取 iPS集落， 这是基于 Oct-GFP的表达和典型的干细胞形态来挑 取的。

重编程效率的定量的实验过程如下： 用于计算重编程效率的主要方法是计数 Oct-GFP阳性克隆： 1. 利用流式 细胞仪对四因子感染后 10-12 天或三因子感染后 14-16 天的 iPS 细胞测定 Oct-GFP阳性的细胞比例； 2. 在原孔中直接用荧光显微镜计数 Oct-GFP阳性 克隆数。

iPS细胞的鉴定实验过程如下：

进行碱性磷酸酶染色、 干细胞标记蛋白荧光染色、 鉴定多能性基因的表 达、 病毒基因的沉默、 畸胎瘤的形成、 嵌合体的形成及生殖系传递 [19, 20]。 实施例 1 : 添加了锂盐的干细胞培养基能促进四因子诱导 的 iPS的形成 a. 将四因子 (Oct4、 Sox2、 Klf4、 c-Myc)的病毒以等体积混合， 感染到 6 孔板的一孔中共计 18万个 OG2小鼠胚胎成纤维细胞中， 在 37°C、 5% C0 ₂ 的环境中培养在添加了 10%胎牛血清的 DMEM培养基中。以加入 病毒当天为第 0天， 第 2天将细胞消化并重悬于 mES培养基中， 并种 在预先种满饲养层细胞 (放射线处理的小鼠胚胎成纤维细胞：)的 96孔板 中， 每孔 5000个细胞， 第 3天开始使用添加了不同浓度 LiCl(0.6 mM, 1.2 mM, 2.5 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM禾口 40 mM)的 mES培养基，第 6 天开始换为添加了不同浓度 LiCl(0.6 mM, 1.2 mM, 2.5 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM和 40 mM)的 KSR培养基， 第 8天开始再换为 KSR培养 基培养， 整个过程如图 1所示。

b. 使用如 a所述的方法，从第 8天开始，每天在倒置荧光显微镜下观 察并计数 Oct-GFP阳性克隆数， 同时使用荧光显微镜拍照。 图 2A为 第 10天时 96孔板中代表性的图片，可以看到 10 mM LiCl处理的孔相 对于不处理的孔， 有更多 Oct-GFP阳性的克隆。 图 2B是对 Oct-GFP 阳性克隆的统计数据。 第 8天时， 对照孔几乎看不到 Oct-GFP阳性克 隆，而 lO mM LiCl处理的孔可以观察到 10个左右克隆。而到第 10天， 10 mM LiCl处理的孔可以观察到 20个左右克隆， 其效率是对照组的 5-6倍。图 2C是用不同浓度的 LiCl (0.6 mM, 1.2 mM, 2.5 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM和 40 mM)处理之后出现的阳性克隆数， 可以发现明显的 剂量效应曲线， 其中 LiCl浓度为 10 mM时效果最为显著。

c 使用如 a所述的方法， 在第 12 天消化细胞， 利用流式细胞仪检测 Oct-GFP阳性的细胞比例。 图 3A为代表性的流式数据图； 图 3B是对 3次实验的统计数据， 显示在四因子诱导条件下， 10 mM LiCl处理可 提高 iPS诱导效率 5-6倍。 实施例 2: 添加锂盐的干细胞培养基能促进三因子诱导的 iPS的形成 a. 将三因子 (Oct4、 Sox2、 Klf4)的病毒以等体积混合， 感染到 6孔板的一 孔中共计 18万个 OG2小鼠胚胎成纤维细胞中，在 37°C、 5% C0 ₂ 的环 境中培养在添加了 10%胎牛血清的 DMEM培养基中。以加入病毒当天 为第 0天， 第 2天将细胞消化并重悬于 mES培养基中， 并种在预先种 满饲养层细胞 (放射线处理的小鼠胚胎成纤维细胞：)的 96孔板中， 每孔 5000个细胞， 第 3天开始使用添加了不同浓度 LiCl(0.6 mM, 1.2 mM, 2.5 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM和 40 mM)的 mES培养基， 第 6天开始 换为添加了不同浓度 LiCl(0.6 mM, 1.2 mM, 2.5 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM和 40 mM)的 KSR培养基， 第 8天开始再换为 KSR培养基培养， 整个过程如图 1所示。

b. 使用如 a所述的方法， 从第 12天开始， 每天在倒置荧光显微镜下 观察并计数 Oct-GFP阳性克隆数， 同时使用荧光显微镜拍照。如图 4A 所示， 第 14天时， 与对照组相比， 添加 5 mM或 10 mM LiCl均能够 显著提高 iPS效率， 其中添加 10 mM LiCl的效率可增加 7倍左右。 c 使用如 a所述的方法， 在第 16 天消化细胞， 利用流式细胞仪检测 Oct-GFP阳性的细胞比例。如图 4B所示，对照组的 Oct-GFP阳性的细 胞比例仅为 0.24%。而添加 10 mM LiCl的实验组的 Oct-GFP阳性细胞 比例可达到 14.5%， 增加了近 60倍。 实施例 3 : 添加锂盐得到的 iPS细胞系具有多能性

a. 如上所述，用 4因子 (Oct4、 Sox2、 Klf4、 c-Myc)或 3因子 (Oct4、 Sox2、 Klf4)感染小鼠胚胎成纤维细胞， 在添加 LiCl的干细胞培养基中培养， 感染后 14天 (4因子)或 20天 (3因子：)， 根据克隆形态及荧光表达挑取 具有代表意义的克隆团， 经过传代后形成均匀的 iPS细胞系。

b. 对于挑选出来的 iPS细胞系进行形态观察，并进行干细胞特异性 蛋 白的染色。 如图 5所示， iPS细胞系具有类似胚胎干细胞的特征形态， 强烈表达 Oct-GFP的绿色荧光， 并且碱性磷酸酶 (AP)呈阳性。 使用针 对干细胞特征蛋白的抗体对 iPS细胞进行免疫荧光染色，结果表明 iPS 细胞系均表达干细胞特异性蛋白 Nanog和 SSEA-1。

c. 在提取 RNA 之前， 利用差速贴壁法去除滋养层细胞， 使用 Trizol

(Invitrogen公司）试剂， 按照制造商说明提取 iPS细胞的总 RNA。用 PrimeScriptTM试剂盒（Takara公司）进行逆转录， 并使用 JumpStart™ Taq ReadyMix™试剂盒（Sigma公司）， Mx 3000P荧光定量 PCR仪（ ABI 公司）进行 Real-Time PCR分析。所有上述 PCR条件均使用常规 PCR 条件， 按照制造商说明进行。 其中鉴定 iPS特异基因使用的引物列表 如表 1所示。

表 1] 内源 -Oct4 F TAGGTGAGCCGTCTTTCCAC

内源 -Oct4 R GCTTAGCCAGGTTCGAGGAT

Nanog F CTCAAGTCCTGAGGCTGACA

Nanog R TGAAACCTGTCCTTGAGTGC 内源 -Sox2 F AGGGCTGGGAGAAAGAAGAG 内源 -Sox2 R CCGCGATTGTTGTGATTAGT

Rexl F GACGAAGCAAGAGAAGAG

Rexl R CGATAAGACACCACAGTAC 外源 -Sox2 F GGGTGGACCATCCTCTAGAC

外源 -Sox2 R GGGCTGTTCTTCTGGTTG

外源 -Klf4 F GGGTGGACCATCCTCTAGAC

外源 -Klf4 R GCTGGACGCAGTGTCTTCTC

夕卜源 -cMyc F GGGTGGACCATCCTCTAGAC

夕卜源 -cMyc R CCTCGTCGCAGATGAAATAG

外源 -Oct4 F GCTTGGATACACGCCGC

外源 -Oct4 R TTCATGTCCTGGGACTCCTC

如图 6A所示， 使用本发明方法获得的 iPS细胞系表达较高水平 的多能性因子， 包括内源性 Oct4、 内源性 Sox2、 Nanog和 Rexl , 其 表达水平与小鼠的胚胎干细胞系 E14相当。而这些因子在原始的小鼠 胚胎成纤维细胞中均没有可检测到的表达。 同时如图 6B所示， 利用 本发明方法获得的 iPS细胞系均能够较好地沉默外源的病毒基因， 也 说明细胞完成了重编程到干细胞的状态。

使用胰酶消化添加锂盐得到的小鼠 4因子 iPS克隆，将 100万个 iPS 细胞重悬在 200 mES培养基中注射入 NOD-SCID小鼠大腿内侧肌 肉中。 4-5 周后， 处死小鼠， 畸胎瘤用石蜡包埋、 切片， 使用苏木精 / 伊红染色进行组织结构上的分析。 如图 7所示， 在 iPS细胞形成的畸 胎瘤切片中能够发现源于 3个胚层的组织， 包括代表外胚层的表皮样 组织， 代表中胚层的软骨和肌肉组织， 以及代表内胚层的消化管腔样 组织。 说明添加锂盐得到的小鼠 4因子 iPS克隆能够像小鼠胚胎干细 胞那样具有分化为 3个胚层的不同类型细胞的多能性。

e. 将添加锂盐得到的小鼠 4因子 iPS克隆注射入 ICR小鼠囊胚中， 使得 其与所注射的小鼠囊胚中的胚胎干细胞混合， 再将此囊胚移植入代孕 母鼠的子宫内生长发育。 待小鼠出生后， 观察小鼠的皮肤颜色判断嵌 合。 若检测到嵌合， 再将嵌合体小鼠与白色的 ICR小鼠交配， 观察子 代小鼠的毛色判断有无生殖系传递。 如图 8所示， 3因子及 4因子的 iPS细胞系均能产生嵌合体小鼠，且 4因子 iPS细胞系产生的嵌合体小 鼠的子代小鼠中有黑色小鼠， 证明此添加锂盐得到的 iPS细胞系确实 有生殖系的传递能力， 说明此细胞确实具有与胚胎干细胞相似的全能 性。

总之， 本发明使用添加了锂盐的培养基能够高效产生 iPS细胞。 流式细 胞计数实验计算效率显示， 添加锂盐的实验组比对照组提高约 5— 6倍 (转导 四因子实验:)和 60倍 (转导 3因子实验：)。在 iPS诱导过程中添加锂盐也可以加 快重编程的过程， 添加锂盐的实验组在感染第 8天即可检测到 Oct4-GFP阳 性的克隆， 而对照组一般要到 10天以后才能检测到 Oct4-GFP阳性的克隆。 利用锂盐诱导的 iPS细胞具有良好的全能性， 转导四因子或三因子的 iPS克 隆均能形成嵌合体小鼠， 其中四因子 iPS的嵌合体小鼠实现了生殖系传递， 并产下后代。 本发明的高效诱导 iPS细胞的方法对推动 iPS的基础研究和临 床应用有着重要的意义。

以上所示仅为本发明较佳的实施例而已， 当然不能以此来限定本发明的 权利范围， 因此依本发明权利要求所作的等同变化， 仍属本发明所涵盖的范 围。

参考文献：

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