OBTENCIÓN

DESCRIPCIÓN

Campo de la invención

La presente invención pertenece al sector de la Biomedicina. Más en concreto, contempla extractos de origen fúngico y sus aplicaciones clínicas. En particular se refiere a un extracto del hongo Macrocybes titans que comprende un triglicérido que actúa como modificador de la respuesta biológica, lo que da lugar a importantes aplicaciones clínicas. Asimismo, se contempla el procedimiento para la obtención de dicho extracto.

Antecedentes de la invención

El cáncer es una enfermedad devastadora con una gran incidencia. En 2012 hubo 14.1 millones de nuevos diagnósticos de cáncer en el mundo y 8.2 millones de muertes causadas por este grupo de enfermedades. Se estima que para 2030 habrá unos 23.6 millones de nuevos casos al año (Cáncer Research UK. Worldwide cáncer statistics. https://www cancerresearchuk org/health-professional/cancer- statistics/wor¡dwide-cancer#heading-Zero 2018).

Aparte del grave coste en vidas humanas, esta enfermedad ejerce también un fuerte impacto en la economía sanitaria de los países desarrollados. Por ejemplo, el gasto asociado al tratamiento del cáncer en Estados Unidos en 2017 fue de 147.3 billones de dólares (NIH. Cáncer statistics. https://www cáncer gov/about- cancer/understanding/statistics 2018).

La lucha contra el cáncer tiene varios frentes. En primer lugar, la prevención se revela como la forma de intervención más eficaz, aunque requiere de un fuerte compromiso político y social para cambiar los hábitos perniciosos y evitar las causas principales del cáncer (Vineis P, Wild CP. Global cáncer patterns: causes and prevention. Lancet 2014;383:549-57). Pero también es importante el desarrollo de nuevos medicamentos que puedan atajar la enfermedad una vez detectada (Magalhaes LG, Ferreira LLG, Andricopulo AD. Recent Advances and Perspectives in Cáncer Drug Design. An Acad Bras Cienc 2018;90:1233-50).

Tradicionalmente, una forma de conseguir compuestos con propiedades terapéuticas ha sido el cribado de productos naturales, de forma que hasta un 60% de los medicamentos utilizados hoy en día para luchar contra el cáncer o las enfermedades infecciosas tienen un origen natural (Rafes SM. Plants as source of drugs. Toxicon 2001;39:603-13; Newman DJ, Cragg GM. Natural producís as sources of new drugs over the last 25 years. J Nat Prod 2007;70:461-77). Además, estos productos naturales pueden convertirse en compuestos líderes, a partir de los cuales se pueden generar familias de compuestos similares mediante técnicas de química sintética y diseño racional y así obtener nuevas funciones que no estaban presentes en el compuesto original ( Hamburger M, Hostettmann K. Bioactivity in plants: The link between phytochemistry and medicine. Phytochemistry 1991;30:3864-74).

El uso terapéutico de los hongos es bien conocido en la medicina tradicional oriental y estos organismos han servido como una fuente fecunda de compuestos farmacológicamente activos, proporcionando sustancias con capacidad antimicrobiana, antiviral, antitumoral, antialergénica, inmunomoduladora, antiinflamatoria, etc (Lindequist U, Niedermeyer TH, Julich WD. The pharmacological potential of mushrooms. Evid Based Complement Alternat Med 2005;2:285-99; Strader CR, Pearce CJ, Oberlies NH. Fingolimod (FTY720): a recently approved múltiple sclerosis drug based on a fungal secondary meiaboliie. J Nat Prod 2011;74:900-7).

A través de una colaboración con el Instituto Nacional de Biodiversidad (INBio) de Costa Rica los autores de la presente invención han estudiado la capacidad antitumoral de varios extractos de hongos autóctonos de las selvas tropicales de este país, buscando nuevos productos naturales con aplicación terapéutica. Como resultado, han identificado un nuevo compuesto capaz de frenar el crecimiento tumoral in vivo a partir del hongo Macrocybe titans.

El género Macrocybe agrupa siete especies distribuidas por áreas tropicales y subtropicales del globo que producen carpóforos de gran tamaño, pudiendo llegar a alcanzar hasta un metro de diámetro y 18 Kg de peso (Pegler DN, Lodge Dj, Nakasone KK. The pantropical genus Macrocybe gen. nov. Mycologia 1998;90:494- 504). La especie Macrocybe titans es la única de este género que se encuentra en el continente americano ( Ramírez NA, Niveiro N, Michlig A, Popoff OF. First record of Macrocybe titans (Tricholomataceae, Basidiomycota) in Argentina. Check List 2017;13:153-8). A pesar de que son especies comestibles (Razaq A, Nawaz R, Khalid AN. An Asían edible mushroom, Macrocybe gigantea: its distríbution and ITS- rDNA based phylogeny. Mycosphere 2016;7:525-30), su uso como hongos terapéuticos no está descrito en la bibliografía. Solo se ha sugerido que algunos polisacáridos de Macrocybe titans pueden inhibir la migración de células de melanoma ( Milhorini SDS, Smiderle FR, Biscaia SMP, Rosado FR, Trindade ES, lacomini M. Fucogalactan from the giant mushroom Macrocybe titans inhibits melanoma cells migration. Carbohydr Polym 2018;190:50-6) y que el cuerpo fructífero de Macrocybe gigantea contiene compuestos antimicrobianos ( Gaur T, Rao PB. Analysis of Antibacterial Activity and Bioactive Compounds of the Giant Mushroom, Macrocybe gigantea (Agaricomycetes), from India. Int J Med Mushrooms 2017;19:1083-92).

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Análisis de toxicidad en las líneas A549 (tumoral) y NL20 (no tumoral) con el extracto inicial de M. titans. IC ₅₀ para la línea tumoral < 0.1 mg/ml; IC ₅₀ para la línea no tumoral = 0.5 mg/ml.

Figura 2. Espectro de ¹ H-RMN del extracto purificado. Se indican los protones característicos del glicerol, los de grupos alquílicos y olefínicos Figura 3. Espectro de ¹³ C-RMN del extracto purificado. Se indican los carbonos característicos del glicerol, los de grupos alquílicos, olefínicos y carbonilos.

Figura 4. Células A549 y NL20 teñidas con falacidina fluorescente que marca las fibras de actina (en verde), antes (Control) y después de ser tratadas (Treated) con el TG10.

Figura 5. Evolución del volumen de los tumores en el experimento de xenotrasplante. Tumores inyectados con vehículo (Control, rombos) o con TG10 (TG, cuadrados). Se representa la media de los volúmenes para cada grupo a lo largo del tiempo (d = días a partir de la inyección de las células tumorales). Descripción detallada de la invención

Los autores de la presente invención han identificado a partir de un extracto del hongo Macrocybe titans un nuevo compuesto capaz de frenar el crecimiento tumoral in vivo.

En un aspecto principal de la invención se contempla dicho compuesto, que es un triglicérido de fórmula 2R-TG (C18:2, 9z,12z; C16:0; C18: 1 , 9z), de aquí en adelante TG10, representado por el siguiente esquema:

Este compuesto actúa como modificador de la respuesta biológica ( biological response modifier, BRM) ya que altera específicamente el citoesqueleto de actina. Por lo tanto tiene aplicaciones directas en todos aquellos fenómenos regulados por este componente del citoesqueleto, incluyendo de manera no exclusiva: i) cambios de morfología celular, ii) motilidad celular (incluyendo la metástasis), iii) contracción muscular, iv) modificación de las uniones célula-célula, v) regulación de la endocitosis y la fagocitosis, vi) embriogénesis, vii) control de la expresión génica, viii) regulación del sistema inmune, ix) defensa frente a patógenos (bacterias, hongos, virus, parásitos, etc) y x) regulación de la apoptosis, entre otros.

Debido a sus propiedades, en un segundo aspecto de la invención se contempla el triglicérido TG10 de la invención para su uso como medicamento.

El triglicérido TG10 influye positivamente en todas aquellas enfermedades relacionadas con el citoesqueleto de actina. Así, en otro aspecto de la invención se contempla el uso del triglicérido en el tratamiento de enfermedades reguladas por el citoesqueleto de actina tales como, pero sin limitarse a, amiloidosis, retinitis pigmentosa, enfermedades infecciosas, enfermedades del riñón y síndrome de sordera congénita. El triglicérido de la invención ha demostrado su eficacia para reducir el tamaño de tumores humanos. Así, otro aspecto principal de la invención contempla el empleo del triglicérido TG10 en el tratamiento de enfermedades cancerosas, tanto en animales como en pacientes humanos, por sí mismo o en combinación con otras terapias (radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia, etc).

Además, los autores de la presente invención han demostrado que el triglicérido se une de forma preferente a las células tumorales, por lo tanto, unido a un trazador (fluorescente, radiactivo, etc) permite localizar tumores en un organismo vivo, tanto en un animal como en un paciente humano, en el contexto de dispositivos de imagen diagnóstica (PET, fluorescencia, etc). Dicha afinidad del triglicérido por las células tumorales también permite dirigir fármacos o nanopartículas hacia las células tumorales, como tratamientos terapéuticos.

En otro aspecto principal de la invención se contempla una composición farmacéutica que comprende el triglicérido de la invención.

Como se ha mencionado anteriormente, los autores de la presente invención obtuvieron el triglicérido a partir de un extracto de Macrocybe titans. Así, otro aspecto principal de la invención contempla el procedimiento para la obtención de un extracto de Macrocybe titans que comprende los siguientes pasos: a. Someter una muestra de un hongo Macrocybe titans a una extracción en etanol 95%, b. Tratar el extracto obtenido en a) con ultrasonidos durante 30-60 minutos, preferiblemente 30 min, c. Mantener el extracto tratado en b) a una temperatura comprendida entre -20 y -80 °C, preferiblemente -20°C, durante 24-48 horas, preferiblemente 24 horas, d. Obtener la fase precipitada del extracto así tratado, y e. A partir de la fase precipitada del extracto obtenida en d) llevar a cabo una separación alcaloidal seguida por una cromatografía de columna con resina polimérica utilizando una fase móvil IP:CH2L2 8:2 a un pH 12, dando lugar a una fracción del extracto que comprende el triglicérido de fórmula 2R-TG (C18:2, 9z,12z; C16:0; C18:1, 9z).

Una vez identificado el triglicérido de la invención, y determinada su fórmula, también es posible obtenerlo mediante su síntesis química, en lugar de extraerlo de la fuente original, lo cual presenta ventajas desde un punto de vista económico, de reproducibilidad y de seguridad farmacológica.

Ejemplos

Ejemplos 1. Cribado iterativo mediante análisis de toxicidad y separación de nuevas fracciones por cromatografía

Se obtuvieron extractos (acuosos, etílicos, ácidos) a partir de 9 especies de macrohongos recogidos por INBio en las selvas costarricenses. Todos ellos fueron sometidos a un test de citotoxicidad con dos líneas celulares humanas: A549 (adenocarcinoma de pulmón) y NL20 (línea inmortalizada, no tumoral, obtenida del epitelio pulmonar). Las células se sembraron en placas de 96 pocilios con densidades de 2.000 (A549) o 10.000 (NL20) células por pocilio. Una vez que las células se pegaron al fondo se añadieron concentraciones seriadas de cada extracto y se incubaron a 37°C durante 5 días en atmósfera humidificada (85% humedad relativa) y conteniendo 5% CO2. Se estudiaron 8 repeticiones (pocilios) para cada concentración. Al final del proceso de incubación se añadieron 20 pl de Cell Titer (Promega) por pocilio y se esperó durante 4 h para permitir la formación de las sales coloreadas de formazán. La cuantificación colorimétrica se realizó con un lector de placas (POLARstar Omega) utilizando una longitud de onda de 490 nm, siguiendo protocolos ya publicados (Coderch C, Díaz de CM, Zapico JM, Pelaez R, Larrayoz IM, Ramos A, et al. In silico Identification and in vivo characterization of small molecule thera eutic hypothermia mimetics. Bioorg Med Chem 2017;25:6597-604). El criterio de selección de los extractos consistía en elegir aquellos que presentaban toxicidad para las células tumorales incluso a concentraciones bajas mientras que respetaban la integridad de las células no tumorales, o al menos proporcionaban una amplia ventana terapéutica entre ambas líneas celulares. Los extractos seleccionados en la primera ronda fueron fraccionados con diferentes columnas y protocolos de cromatografía. Cada nuevo pico fue separado y sometido de nuevo al análisis de toxicidad. Este proceso se repitió todas las veces necesarias para obtener al final una fracción suficientemente pura cuyo compuesto mayoritario pudiera ser identificado por métodos de química analítica.

Resultados: De entre todos los extractos analizados en la primera ronda, el correspondiente a la especie M. titans fue el que presentaba una ventana terapéutica más amplia ya que las células A549 fueron destruidas a todas las concentraciones, incluso a 0.1 mg/ml, mientras que las células NL20 sobrevivieron sin problemas incluso a concentraciones de 0.42 mg/ml (Figura 1). Entre los diferentes extractos de esta especie, el más efectivo fue el que se había obtenido por extracción en 95% etanol, tratado con ultrasonidos por 30 min, mantenido a -20°C durante 24h y, en concreto, la fase precipitada después de este tratamiento. Debido a la naturaleza lipídica de este extracto se decidió realizar una separación alcaloidal seguida por una cromatografía de columna con resina polimérica (HP20-SS) utilizando distintas fases móviles. Todas las fracciones obtenidas fueron sometidas de nuevo a los ensayos de toxicidad. La fracción que mantenía la mejor ventana terapéutica correspondía a aquella que fue obtenida a pH 12 y una fase móvil IPA FhCL 8:2.

Ejemplo 2. Caracterización química de la molécula responsable de la actividad antitumoral.

La fracción obtenida en el experimento anterior se utilizó para elucidar la estructura química del producto antitumoral. Para ello se realizaron análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) con ¹ H, ¹³ C y DEPT-135, espectroscopia de masas (Q- TOF) y los experimentos bidimensionales HMQC y COSY.

Resultados: El estudio con ¹ H-RMN indicó que el producto contenía muchos protones alquílicos, una serie de protones en a a alcoholes, y varios protones olefínicos. La distribución de los protones indicaba que el extracto natural contenía un triglicérido (TG) mezclado con varios de sus ácidos grasos componentes. Un triplete a 2.77 ppm reconocía dos protones de un metileno situado entre dos dobles enlaces, indicando una doble insaturación en uno de los ácidos grasos (Figura 2). Los experimentos de ¹³ C y DEPT-135 permitieron asignar los carbonos del producto (Figura 3). Los experimentos bidi ensionales confirmaron la asignación de carbonos y protones en el TG. Por otro lado, la determinación de masas exactas (MS-QTOF) permitió identificar los ácidos grasos que componían el TG. Todo ello llevó a sugerir que el TG contenía tres ácidos grasos distintos: oleico (C18:1, 9z), palmítico (C16:0), y un ácido graso doblemente insaturado de 18 o 20 carbonos. Sin embargo, ya que la muestra no era pura y era difícil asignar exactamente el orden y el tamaño de los ácidos grasos, se decidió sintetizar una serie de TGs similares para determinar empíricamente la actividad antitumoral de cada uno. Para algunos TGs que presentaban actividad óptica se sintetizaron los dos enantiómeros (Tabla 1). Los ensayos de toxicidad indicaron que, de todos los TGs sintetizados, únicamente el

TG10 [2R-TG (C18:2, 9z,12z; C16:0; C18:1, 9z)] (Figura 4) presentaba actividad antitumoral frente a A549 y no era tóxico para las células normales (NL20). Los demás TGs no tenían ninguna actividad apreciable sobre las células. Conviene hacer notar que el enantiómero S (TG9) del TG activo (TG10) tampoco tenía ningún efecto sobre las células, indicando un alto grado de especificidad para esta actividad.

Tabla 1. Triglicéridos (TG) sintetizados para comprobar su actividad antitumoral Ejemplo 3. Ensayos in vitro : modulación del citoesqueleto de actina.

Muchas sustancias antitumorales ejercen sus efectos modulando el citoesqueleto de las células tumorales, ya sea actuando sobre los microtúbulos o sobre los filamentos de actina (Zhang S, Menche D, ZahlerS, VollmarAM, Liebl J, ForsterF. In vitro anti- cancer effects of the actin-binding natural compound rhizopodin. Pharmazie 2015;70:610-5.). Para comprobar si el compuesto TG10 tiene un mecanismo de acción similar al de otros fármacos antitumorales, se sometieron las células tumorales (A549) y no tumorales (NL20) a un tratamiento de 24 h con 0.03 mg/ml de TG10. Al cabo de este tiempo, las células fueron fijadas con formaldehído al 10% por 10 min, permeabilizadas con 0.1% Tritón X-100 por 10 min y expuestas a 1:200 Bodipy-falacidina y 1:1000 DAPI (Molecular Probes) durante 1 h. Las imágenes se obtuvieron con un microscopio láser confocal (TCS SP5, Leica).

Resultados: Como era de esperar, tanto las células A549 como las NL20 presentan fibras de estrés (compuestas por filamentos de actina) características en su citoplasma antes del tratamiento. Después del tratamiento con TG10 las células A549 perdieron completamente las fibras de actina polimerizada y ésta pasó a la periferia celular, donde se formaron pequeños filopodios. En contraste, las células NL20 (no tumorales) mantuvieron la estructura filamentosa de la actina incluso después del tratamiento con TG10 (Figura 4). Estos resultados confirmaron que el TG10 actúa sobre el citoesqueleto de actina de las células tumorales.

Ejemplo 4. Ensayos in vivo· xenotrasplantes de cáncer de pulmón humano en ratones inmunodeprimidos.

El método habitual de demostrar que un nuevo fármaco antitumoral funciona in vivo es efectuar un experimento de xenotransplante usando células tumorales humanas inyectadas en ratones inmunodeficientes ( Zitvogel L, Pitt JM, Daillere R, Smyth MJ, Kroemer G. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cáncer 2016;16:759-73). En este caso se utilizaron 20 ratones macho de la estirpe NOD scid gamma (NSG, Stock No. 005557, The Jackson Laboratory). Todos ellos fueron inyectados subcutáneamente con 10 millones de células A549 y se esperó 2 semanas hasta que los tumores adquirieron un tamaño medible. Se hicieron al azar dos grupos de 10 ratones cada uno y se marcaron como grupo control (rombos) y grupo tratado con TG10 (cuadrados). A partir de este punto se aplicaron inyecciones intratumorales con 100 pl de PBS (grupo control) o de 0.1 mg/ml de TG10 en PBS (grupo tratado), 3 veces por semana. Antes de cada inyección se midieron los volúmenes tumorales con un calibre. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron un tamaño incompatible con el bienestar animal.

Resultados: Las inyecciones del TG10 comenzaron el día 15 después de la inyección inicial de células tumorales. A partir de este punto el tamaño de los tumores inyectados con PBS siguió creciendo paulatinamente hasta alcanzar el tamaño máximo permitido (por cuestiones de ética y bienestar animal) el día 48. Por otro lado, los tumores inyectados con TG10 siguieron creciendo, pero a un ritmo más lento que el de los tumores del grupo control (Figura 5). Al final del experimento los tumores del grupo control tenían un volumen medio de 2900 mm ³ mientras que los tratados tenían un volumen medio de 1600 mm ³ . Se hizo un análisis de varianza (ANOVA) de dos vías que demostró que existe una diferencia significativa entre el volumen de los tumores tratados y de los controles (p<0.05) debida al tratamiento.