Verbindungen, die eine anticancerogene Wirksamkeit aufweisen, sind zahlreich bekannt. In der Klasse der 1, 2, 4-Triazine sind cancerostatische Wirksamkeiten von 3-Amino-und 3-Alkyl- 1, 2, 4-benzotriazin-1, 4-dioxiden beschrieben. So haben z. B.

Monge, Antonio et al. in J. Med. Chem. ; EN, 38, 10, 1995 ; 1786-1792 und in J. Med. Chem. ; EN ; 38, 22, 1995 ; 4488-4494 cytotoxische Untersuchungen mit 3-Amino-1, 2, 4-benzotriazin- 1, 4-dioxid an V-79 Zellen (Chinesische Hamster- Lungenfibroblasten) dargestellt. Die Synthese und antitumorale Aktivität weiterer neuer Analoga wurde von Tracy, M. auf einem Workshop der British Association of Cancer in Oxford, England (17.-19. September 1992) gezeigt.

Die antitumorale Wirksamkeit von 3-Alkyl-1, 2, 4-benzotriazin- 1, 4-dioxiden war Gegenstand auf dem VIII. Meeting über chemische Modifikatoren zur Krebsbehandlung in Kyoto, Japan vom 16-19. 06. 1993. Desweiteren ist auch eine cancerostatische Wirksamkeit von 4-Amino-3-hydrazino-6-methyl-4 (H)-1, 2, 4- triazin-5-on bekannt (Borrell, J. I. et al. ANQUEX ; An. Quim. ; EN ; 91 ; 3-4 : 1995 ; 243-252).

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, weitere neue cytostatisch wirksame Verbindungen zu synthetisieren, die in die Zelle eingeschleust werden können sowie die Proliferation von Tumorzellen hemmen und damit zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe von Tumorerkrankungen geeignet sind. Aufgabe der Erfindung war es außerdem, ein Verfahren zu deren Herstellung zu entwickeln,

das hinsichtlich Reaktionsführung einfach ist und die Verbindungen in guten Ausbeuten zur Verfügung stellt.

Die Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen gelöst. Gegenstand der Erfindung sind neue 3-substituierte 1, 2, 4-Benzotriazine der allgemeinen Formel I bedeutet, Ri einen geradkettigen oder verzweigten, gesättigten oder ein-oder mehrfach ungesättigten, unsubstituierten oder ein-oder mehrfach durch Halogen, Sauerstoff, Hydroxy, Amino, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Morpholino und/oder durch Alkylamino substituierten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 22 C-Atomen, einen unsubstituierten oder substituierten Aryl-sowie einen heterocyclischen Rest darstellt und R2, R3, R4, R gleich oder verschieden voneinander Wasserstoff, Halogen, NO2, NH2, OH oder einen Alkoxy bzw. einen Alkylrest mit 1-6 C-Atomen bedeuten.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind biologisch aktiv und besitzen eine ausgeprägte Antitumorwirksamkeit.

Insbesondere lassen sie sich somit vorteilhaft zur

Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und Prophylaxe von Tumorerkrankungen einsetzen.

Bevorzugte Verbindungen mit antitumoraler Wirksamkeit sind 1, 2, 4-Benzotriazine, in denen und R1 einen Alkyl-oder Alkyl-COO-Alkyl-Rest, einen mit Hydroxygruppen substituierten bzw. einen mit Hydroxygruppen und-COO-Alkylgruppen substituierten Alkyl-Rest (Polyolyl-Rest), einen Alkyl-CO-NH-Alkylrest oder einen durch Morpholin-4- yl-CO-substituierten Polyolylrest bedeutet, wobei Alkyl jeweils fur einen Rest mit einer Kettenlänge von 1 bis 6 C-Atomen steht.

Insbesondere bevorzugt sind Verbindungen, in denen Rl-CH3,-CH2-COO-CH3,-CH2-COO-CH3,-CH2-COO-CH3,<BR> -CH2-COO-C2H5, D-arabino- (CHOH) 3-CH20H,<BR> D-ribo- (CHOH) 3-CH20H, D-galacto- (CHOH) 4-CH20H, D-galacto-(CHOH)4-COO-C2H5, D-arabino-(CHOH)3-CH2OH, -CH2-CO-NH-CH (CH3) 2, L-arabino- (CHOH) 4-CO-N O bedeutet und R2, R3, R4 R gleich oder verschieden voneinander H, Cl, Br und NH2 bedeuten.

Ganz bevorzugte Verbindungen sind : a) 3-Methyl-1, 2, 4-benzotriazin (R1 =-CH3, R2, R3, R4, R5 H), b) 3- (Methoxy-carbonylmethyl)-6-chlor-benzo-1, 2, 4-triazin (R1 = -CH2-CO-OCH3, R2, R3, R5 = H und R4 = C1), c) 3-(Methoxy-carbonylmethyl)-5-chlor-benzo-1, 2, 4-triazin (Rl =-CH2-CO-OCH3, R2, R4, R5 = H und R3 = Cl) ,

d) 3- (Methoxy-carbonylmethyl) -5-amino-6-chlor-benzo-1, 2, 4- triazin (R1 = -CH2-CO-OCH3, R3 = NH2, R4 = Cl, R2, R5 = H), e) 3- (Methoxy-carbonylmethyl)-1, 2, 4-benzotriazin (Rl =-CH2-CO-OCH3 und R, R3, R4, R5 = H) , f) 3- (Ethoxy-carbonylmethyl)-1, 2, 4-benzotriazin (Rl =-CH2-CO-OC2H5 und R2, R3, R4, R5 = H), g) 3 - (Ethoxy-carbonylmethyl) -6-brom-benzo-1, 2, 4-triazin (R1 = -CH2-CO-OC2H5, R2, R3, R5 = H, R4 = Br), h) 3- (D-arabino-Tetritol-1-yl)-1, 2, 4-benzotriazin (Rl = D-arabino- (CHOH) 3-CH20H, R, R3, R4, R = H), i) 3- (D-galacto-Tetritol-1-yl)-1, 2, 4-benzotriazin (Rl D-galacto- (CHOH) 4-CH20H, R2, R3, R4, R5 = H), j) 3- (Ethoxycarbonyl-D-galacto-tetritol-1-yl-)-1, 2, 4- benzotriazin (R1 = D-galacto-(CHOH)4-CO-OC2H5, R2, R3, R4, R5 = H) , k) 3- (D-arabino-Tetritol-1-yl)-6-chlor-benzo-1, 2, 4-triazin (R1 = D-arabino- (CHOH) 3-CH20H, R2, R3, R = H, R = Cl), 1) 3- (Isopropylamino-carbonylmethyl)-1, 2, 4-benzotriazin (R1 = -CH2-CO-NH-CH (CH3) 2, R 2, , R3, R4, R5 = H) , m) 3- (D-ribo-Tetritol-1-yl)-1, 2, 4-benzotriazin (Rl = D-ribo- (CHOH) 3-CH20H, R2, R3 , R4, R5 = H), n) 3- (Morpholin-4-yl-carbonyl-L-arabino-tetritol-1-yl)-1 , 2, 4- benzotriazin (Rl = L-arabino-(CHOH) 4-CO-N 9 R2 R3 R4 R5 H) Diese neuen Verbindungen der allgemeinen Formel I können nach an sich bekannten Verfahren synthetisiert werden (z. B.

Jerschel, D. und W. Edler in Chem. Ber. 88 (1955) 1284 ; Fusco, R. und G. Bianchetti, Gazz. Chim. Ital. 90 (1960) 1113 oder Kwee, S. und H. Lund, Acta Chem. Scand. 23 (1969) 2711), indem 2-Nitrophenylhydrazone einer Carbonylverbindung oder die tautomeren Azoverbindungen reduziert werden.

Erfindungsgemäß werden sie durch Umsetzung eines entsprechenden 2-Nitrophenylhydrazins mit einer entsprechenden 2-Oxocarbonsäure oder dessen Salz gemäß dem

folgenden Formelschema unter Entstehen des 2- Nitrophenylhydrazons erhalten. Das entstandene 2- Nitrophenylhydrazon wird anschließend mittels Wasserstoff katalytisch zu einer Zielverbindung der allgemeinen Formel I reduziert.

Formelschema : wobei R1 bis R5 die o. g. Bedeutung besitzen.

In einer weiteren Ausführungsvariante der Erfindung werden die als Zwischenstufe gebildeten 1, 4-Dihydro-1, 2, 4- benzotriazine isoliert, indem man das 1, 4-Dihydro-1, 2, 4- benzotriazin unter Inertgasatmosphäre nach beendeter Wasserstoffaufnahme vom Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel abdestilliert. Durch Acetylierung mit Acetanhydrid vzw. bei 20°C erhält man die Monoacetylderivate der allgemeinen Formel I.

Bevorzugte Monoacetylverbindungen mit antitumoraler Wirksamkeit sind solche, in denen bedeutet, und R1-CH2-CO-OC2HS darstellt. Insbesondere bevorzugt ist die Verbindung o) mit R2 R3, R4, R5 = H

Die eingesetzten substituierten oder unsubstituierten 2- Nitrophenylhydrazine sind an sich bekannt und werden durch Reduktion von Diazoniumverbindungen hergestellt (Mangini, Deliddo in Gazz. Chim. Ital. 63, 612, 1933) oder durch Umsetzung von 2-Nitro-halogenbenzenen mit Hydrazinhydrat (Albini, Angelo et al. in Heterocycles 597, 1995).

In einer bevorzugten Ausführungsvariante des Verfahrens werden für die Synthese der 2-Nitrophenylhydrazone direkt Fermentationslösungen eingesetzt, die eine entsprechende 2- Oxocarbonsäure enthalten. Das gilt bevorzugt für Fermentationslösungen, die 2-Oxoglutarsäure oder 2- Oxogluconsäure enthalten.

Der für eine Umsetzung notwendige Gehalt einer 2- Oxocarbonsäure in der Fermentationslösung beträgt in der Regel ca. 15%, vorzugsweise >20%.

Das umzusetzende 2-Nitrophenylhydrazin wird dabei in einem organischen Lösungsmittel bzw.-gemisch, ggf. unter Erwärmen, gelöst und einer die entsprechende 2-Oxocarbonsaure enthaltenden Fermentationslösung bei einer Temperatur von 20 bis 80°C, vorzugsweise bei 45-55°C zugegeben. Das entstandene 2-Nitrophenylhydrazon wird ggf. aufgearbeitet.

Durch katalytische Reduktion werden anschließend unter Cyclisierung, Decarboxylierung und Oxidation die Zielverbindungen der allgemeinen Formel I mit hohen Ausbeuten > 30%, vorzugsweise > 50 % erhalten.

Dieses Verfahren hat den großen Vorteil, dass es in einer Eintopfreaktion ablaufen kann und somit hinsichtlich Reaktionsführung und auch hinsichtlich der erzielten Ausbeuten den bekannten Synthesewegen, deren Ausbeuten in der Regel unter 30 % liegen, überlegen ist.

Antitumoral wirksame Verbindungen der allgemeinen Formel I sind bevorzugt weiterhin 1, 2, 4-Benzotriazine, in denen

darstellt und R1 = NH2 bedeutet. Als besonders wirksam hat sich dabei die Verbindung p) mit R2, R3, R4, R5 = H erwiesen.

Diese Verbindungen werden nach an sich bekannten Verfahren nach Suzuki, H. und T. Kawakami, Synthesis 1997, 855-857 hergestellt. 2-Fluornitrobenzol und Guanidin werden in THF bei 60°C für ca. 4 Stunden gerührt, anschließend wird tert.- BuOK zugegeben und weitere 2 Stunden gerührt. Das ausgefallene Produkt wird isoliert.

Anschließend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen näher erlautert.

Beispiel 1 3-Methyl-1, 2, 4-benzotriazine 0, 01 mol Natriumpyruvat und 0, 01 mol des entsprechenden 2- Nitrophenylhydrazins werden in einer Lösung von 10 ml Ethanol und 10 ml 35 proz. Perchlorsäure unter Rühren zur Reaktion gebracht. Der nach kurzer Zeit anfallende gelbe Niederschlag wird abgesaugt, mit Wasser neutral gewaschen, getrocknet und anschließend aus Ethanol umkristallisiert.

Ausbeuten : 90-95% der Theorie 3 mmol der so erhaltenen 2-Nitrophenylhydrazone werden in 50 ml Ethanol gelöst und über Platinoxid bei Raumtemperatur und Normaldruck bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme hydriert.

Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilleirt. Die verbleibenden 3-Methyl-1, 2, 4- benzotriazine werden aus Petrolether umkristallisiert.

Ausbeuten : 55-70% der Theorie.

Beispiel 2 3- (D-arabino-Tetritol-1-yl)-1, 2, 4-benzotriazin 10 mmol 2-Nitrophenylhydrazin werden in 30 ml Methanol und 0, 5 ml Essigsäure unter Erwärmen gelöst. Die Lösung wird bei 50°C unter Rühren zu einer Fermentationslösung getropft, die einen Gehalt von 24% 2-Oxo-D-gluconsäure aufweist. Die Reaktionsmischung wird eine weitere Stunde gerührt. Der orange Niederschlag wird abgesaugt, gewaschen und aus Wasser umkristallisiert.

Ausbeuten : 90% der Theorie.

Eine Suspension von 6 mmol des so erhaltenen 2- Nitrophenylhydrazons in 60 ml Tetrahydrofuran wird über Pt/C unter Normaldruck bei Raumtemperatur bis zur berechneten Wasserstoffaufnahme hydriert. Das Reaktonsgemisch wird 3 Tage an der Luft gerührt. Danach wird das Lösungsmittel abgetrennt und das Produkt durch Extraktion mit Methanol vom Katalysator getrennt.

Ausbeuten : 30% der Theorie ; gelbe Kristalle F 173-175°C.

Beispiel 3 Hemmung des Zellwachstums durch die erfindungsgemäßen Verbindungen Zu je 1 ml einer entsprechenden Zellstammlösung werden die zu testenden Substanzen in wäßriger steriler Lösung in Konzentrationsschritten von je 2-50 Ag gespritzt. Die Testkammern werden anschließend zusammen mit einer unbehandelten Referenzkammer bei 37°C drei Tage entwickelt.

Die Auswertung erfolgt mittels Mikroskop. Es werden Zellvermehrung bzw. Zellzerstörung (Zustand der Zellmembran sowie des Zellkern) mit unbehandelten Referenzzellen verglichen.

Tabelle : ICs0-Wert (50%ige Hemmung des Zellwachstums in yg/ml) ausgewählter Substanzen der Formel I Substanz Hep2 HeLa Peritoneal Pleuro- carcinom carcinom Verbindung b 120 160 150 500 Verbindung c 16 8-16 12 Verbindung d 500 50 25-30 500 Verbindung e 100 180 350 500 Verbindung f 190-200 378 180 500 Verbindung g 8-16 8-16 35 Verbindung h 150 150 Verbindung i 400 Verbindung j Verbindung k 250 Verbindung 1 100 86 170 (100%) Verbindung o 12 12 Verbindung p 25 30 Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen sämtlich das Zellwachstum von permanenten Zellkulturen wie z. B. von HeLa-, Hep2-Zellen, von Peritonealcarcinom-sowie von Pleurocarcinomzellen.

Wie der obigen Tabelle zu entnehmen ist, sind alle Vebindungen wirksam, bevorzugte Wirksamkeit besitzen die Verbindungen c, g, 1, o und p.

Es zeigte sich eine selektive Antitumorwirkung in vitro, d. h. das Wachstum von Normalzellen wird im vergleichbaren Konzentrationsbereich weit weniger gehemmt als das Tumorwachstum.