La présente invention concerne des compositions pour l'administration par voie orale d'un anticorps anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa).

ARRIERE-PLAN TECHNOLOGIQUE

Le TNF alpha (ou TNFa) est une cytokine pro-inflammatoire qui est sécrétée par et interagit avec les cellules du système immunitaire. Le TNFa a été montré comme étant impliqué dans de nombreuses maladies humaines, notamment des maladies inflammatoires chroniques comme l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, la colite ulcéreuse, ou encore la sclérose en plaques. Plusieurs anticorps anti-TNFa sont actuellement en développement. Deux anticorps sont déjà commercialisés : l'infliximab (Remicade®), et l'adalimumab (Humira®), sous formes injectables par voie sous-cutanée ou intraveineuse.

Plusieurs études ont néanmoins rapporté que la thérapie par anticorps anti-TNFa, notamment par voie systémique, pouvait présenter des effets secondaires indésirables, notamment la survenue d'infections bactériennes telles que la tuberculose (Jarequi- Amezaga et al., Journal of Crohn's and colitis, 2013, 7(3), pages 208-212), ou d'infections par la Listeria (Abreu et al., Journal of Crohn's and colitis, 2013, 7(2), pages 175-182) ou par Candida (Huang et al., Journal of paediatric gastroentology and nutrition, 2013, 56(4), pages 23-6).

C'est pourquoi des formulations d'anticorps anti-TNFa pour une administration par voie orale sont actuellement en développement. Toutefois aucune n'est commercialisée et il existe encore un besoin de mettre à disposition des compositions permettant d'améliorer l'efficacité et/ou l'innocuité des anticorps anti-TNFa administrés par voie orale. La présente invention a donc pour objet une composition pharmaceutique pour administration orale, comprenant un anticorps anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa) et au moins un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables choisis dans le groupe comprenant : un carboxyméthyle-dextran, un chitosan, une cyclodextrine ou une combinaison de ceux-ci. Au sens de la présente invention, on entend par « anticorps anti-TNF alpha » ou « anticorps anti-TNFa», tout anticorps se liant spécifiquement au TNFa humain. Avantageusement, l'anticorps se dissocie du TNFa humain selon les constantes suivantes: Kd inférieur à 1 x10 ^{" 8} M (avantageusement inférieur à 1 x10 ^"9 M, plus avantageusement inférieur à 1 x10 ^"10 M, encore plus avantageusement inférieur à 1x10 ^"11 M) et Koff de 1 x10 ^"3 s ^"1 ou moins, toutes deux déterminées par un test de résonance des plasmons de surface (« surface plasmon résonance »). De préférence l'anticorps est neutralisant. En particulier, il neutralise la fonction biologique du TNFa en bloquant son interaction avec les récepteurs du TNF p55 et p75 situés à la surface cellulaire. La capacité de neutralisation de l'anticorps peut être testée par un test standard, notamment en mesurant la capacité de l'anticorps à neutraliser la cytotoxicité du TNFa humain sur des cellules de fibroblastes humains (L929), avec une CI50 de 1x10 ^"7 M ou moins, avantageusement inférieure à 1 x10 ^"8 M, plus avantageusement inférieure à 1 x10 ^"9 M, ou encore plus avantageusement inférieure à 1 x10 ^"10 M.

Dans un mode de réalisation avantageux, l'anticorps anti-TNF alpha est un anticorps monoclonal. L'anticorps anti-TNF alpha selon l'invention peut être un anticorps d'un mammifère tel qu'une souris, ou peut-être humanisé, ou encore entièrement humain. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'anticorps anti-TNF alpha est un anticorps monoclonal humain.

Dans un mode de réalisation avantageux, l'anticorps anti-TNF alpha selon l'invention possède une chaîne lourde comprenant la SEQ ID No.1 et une chaîne légère comprenant la SEQ ID No.2. SEQ ID NO: 1

MEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYA MHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMN SLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 2

MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLA WYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYN RAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'anticorps anti-TNF alpha peut être l'adalimumab, l'infliximab ou le golimumab. Dans un mode de réalisation encore plus avantageux de l'invention, l'anticorps anti-TNF alpha est l'adalimumab. L'adalimumab est une immunoglobuline G (IgG) composée de deux chaînes légères kappa et de deux chaînes lourdes lgG1 .

L'anticorps utilisé dans la présente invention peut être produit par toute technique bien connue de l'homme du métier. Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est un anticorps recombinant.

Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps peut être produit par recombinaison dans une cellule hôte, transformée avec un ou des vecteur(s) qui permettent l'expression et/ou la sécrétion des séquences nucléotidiques codant pour la chaîne lourde et/ou la chaîne légère de l'anticorps. Le vecteur comporte généralement un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il est maintenu de façon stable dans la cellule hôte et peut éventuellement posséder des signaux particuliers qui spécifient la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents éléments sont choisis et optimisés par l'homme du métier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. De tels vecteurs sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que la lipofection, l'électroporation, l'utilisation d'agents polycationiques, le choc thermique, ou des méthodes chimiques. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple des cellules bactériennes mais également des cellules de levure ou des cellules animales, en particulier des cellules de mammifères non-humain. Les cellules de mammifère préférées pour la production de l'anticorps monoclonal sont la lignée de rat YB2/0, la lignée de hamster CHO, en particulier les lignées CHO dhfr- et CHO Lecl3, PER.C6TM (Crucell), 293, K562, NSO, SP2/0, BHK ou COS. On peut également utiliser des cellules d'insectes. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'anticorps anti-TNF alpha est produit dans des cellules épithéliales mammaires de mammifère non-humain. Un autre mode de production est l'expression de l'anticorps recombinant dans des organismes transgéniques, par exemple dans des plantes (Ayala M Et al., Methods Mol Biol., 2009;483, pages 103-34.) ou dans le lait d'animaux transgéniques tels que la lapine, la chèvre ou le porc (Pollock, D.P et al. Journal of Immunological Methods, 1999, 231 , pages 147-157). Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'anticorps anti- TNF alpha est produit dans le lait d'un mammifère transgénique non-humain.

Selon un mode de réalisation préféré, l'anticorps est produit dans le lait de mammifères transgéniques non humains, modifiés génétiquement pour produire cette glycoprotéine. Le mammifère peut être par exemple une chèvre, brebis, les femelles du bison, buffle, chameau, lama, souris, rat, ou encore une vache, truie, lapine, ou jument. Avantageusement, l'anticorps est produit dans du lait de chèvre transgénique.

La sécrétion de l'anticorps par les glandes mammaires, permettant sa présence dans le lait du mammifère transgénique, implique le contrôle de l'expression de l'anticorps de manière tissu-dépendante. De telles méthodes de contrôle sont bien connues de l'homme du métier. Le contrôle de l'expression est effectué grâce à des séquences permettant l'expression de la glycoprotéine dans un tissu particulier de l'animal. Il s'agit notamment des séquences promotrices de type « WAP », « β-caséine », « β-lactoglobuline » et éventuellement des séquences de type peptide signal. Avantageusement, on produit l'anticorps dans les glandes mammaires d'une chèvre transgénique, en utilisant un vecteur d'expression comprenant la séquence des deux chaînes, sous le contrôle d'un promoteur 5' β-caséine. Un procédé d'extraction de protéines d'intérêt à partir du lait d'animaux transgénique est décrit dans le brevet EP 0 264 166. De manière avantageuse, il est produit plus de 4 grammes d'anticorps par litre de lait, de manière avantageuse plus de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 grammes par litre, de manière encore plus avantageuse jusqu'à 70 grammes par litre.

De manière avantageuse, l'anticorps produit par transgénèse animale, en particulier dans les glandes mammaires d'une chèvre transgénique, est sous la forme d'une population d'anticorps anti-TNFa qui présentent une glycosylation avec un taux de galactosylation élevé, par exemple supérieur à 60%, de préférence supérieur 70%, de préférence encore d'au moins 80%. Selon un autre aspect particulier de l'invention, le taux de fucosylation de l'ensemble des anticorps de la population est d'au moins 50%, et notamment d'au moins 60%.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la population d'anticorps anti-TNFa comprend des anticorps qui comprennent des N-glycannes mono-galactosylés. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la population d'anticorps anti- TNFa comprend des anticorps qui comprennent des N-glycannes bi-galactosylés.

Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le rapport du taux de galactosylation des anticorps de la population et du taux de fucosylation des anticorps de la population est compris entre 1 ,0 à 1 ,4. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, au moins 35% des anticorps dans la population comprend des N-glycannes bi- galactosylés et au moins 25% des anticorps dans la population comprend des N-glycannes mono-galactosylés. Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, le taux de sialylation des anticorps est d'au moins 50%, de préférence d'au moins 70%, ou encore d'au moins 90%.

Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, les anticorps sont totalement sialylés.

La biosynthèse des N-glycannes n'est pas régulée par une codification, comme cela est le cas avec les protéines, mais est principalement dépendante de l'expression et de l'activité des glycosyltransférases spécifiques dans une cellule. Ainsi, une glycoprotéine, tel le fragment Fc d'un anticorps, existe normalement comme une population hétérogène de glycoformes qui portent différents glycannes sur le même squelette de protéines.

Une population d'anticorps hautement galactosylés, est une population d'anticorps dans laquelle le taux de galactosylation de l'ensemble des anticorps de la population est d'au moins 50%, d'au moins 60%, d'au moins 70%, d'au moins 80%, d'au moins 90%, jusqu'à 100% de galactosylation.

Selon un mode particulier de la population d'anticorps hautement galactosylés, le taux de galactosylation de l'ensemble des anticorps de la population est d'au moins 60%. Le taux de galactosylation peut être déterminé avec la formule suivante :

(nombre de galactose) _x (% _S urface relative)

(Nombre de A) dans laquelle

« n » représente le nombre de pics N-glycannes analysés sur un chromatogramme, par exemple d'un spectre de chromatographie en phase liquide à haute performance en phase normale (NP HPLC),

« Nombre de Galactose » représente le nombre de galactoses sur l'antenne du glycanne correspondant au pic, « Nombre de A » représente le nombre de motifs N-acétyl-glucosamine sur l'antenne de la forme glycannique correspondant au pic (à l'exclusion des deux motifs N-acétyl- glucosamine de la structure charpente commun des glycannes), et

« % surface relative » correspond au pourcentage de l'aire sous le pic correspondant. Le taux de galactosylation des anticorps de la population d'anticorps peut être déterminé, par exemple, en libérant les N-glycannes des anticorps, en résolvant les N-glycannes sur un chromatogramme, en identifiant le motif d'oligosaccharide du N-glycanne qui correspond à un pic spécifique, en déterminant l'intensité du pic et en appliquant les données à la formule mentionnée ci-dessus. Des anticorps qui sont galactosylés incluent des anticorps qui ont des N-glycannes mono- galactosylés et des N-glycannes bi-galactosylés.

Dans un mode de réalisation particulier, la population d'anticorps hautement galactosylés comprend des anticorps qui comprennent des N-glycannes mono-galactosylés, qui peuvent ou non être sialylés. Selon un aspect particulier de la population d'anticorps hautement galactosylés, au moins 1 %, au moins 5%, au moins 10%, au moins 15%, au moins 20%, au moins 25%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 70%, au moins 80%, au moins 90%, jusqu'à 100% des N-glycannes des anticorps comprennent des N-glycannes mono-galactosylés. Selon encore un mode particulier de l'invention, dans la population d'anticorps hautement galactosylés, au moins 25% des anticorps comprennent des N-glycannes mono-galactosylés.

Selon un aspect particulier de la population d'anticorps hautement galactosylés, la population comprend des anticorps qui comprennent des N-glycannes bi-galactosylés, qui peuvent ou non être sialylés. Selon un aspect particulier de la population d'anticorps hautement galactosylés, au moins 1 %, au moins 5%, au moins 10%, au moins 15%, au moins 20%, au moins 25%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 70%, au moins 80%, au moins 90%, jusqu'à 100% des N-glycannes des anticorps comprennent des N-glycannes bi-galactosylés. Selon encore un mode particulier de l'invention, dans la population d'anticorps hautement galactosylés, au moins 35% des anticorps comprennent des N-glycannes bi-galactosylés. Selon encore un autre aspect de la population d'anticorps hautement galactosylés, la population comprend des anticorps qui comprennent des N-glycannes mono-galactosylés, qui peuvent ou non être sialylés, et des anticorps qui comprennent des N-glycannes bi- galactosylés, qui peuvent ou non être sialylés. Selon un aspect particulier de la population d'anticorps hautement galactosylés, au moins 1 %, au moins 5%, au moins 10%, au moins 15%, au moins 20%, au moins 25%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 70%, au moins 80%, au moins 90%, jusqu'à 99% des N-glycannes des anticorps comprennent des N-glycannes mono-galactosylés, et au moins 1 %, au moins 5%, au moins 10%, au moins 15%, au moins 20%, au moins 25%, au moins 30%, au moins 40%, au moins 50%, au moins 60%, au moins 70%, au moins 80%, au moins 90%, jusqu'à 99% des N-glycannes des anticorps comprennent des N-glycannes bi-galactosylés.

Selon un autre aspect particulier de la population d'anticorps hautement galactosylés, au moins 25% des anticorps comprennent des N-glycannes mono-galactosylés, et au moins 35% des anticorps comprennent des N-glycannes bi-galactosylés.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'anticorps anti-TNFa est produit par les cellules épithéliales mammaires d'un mammifère transgénique non humain et est produit dans la glande mammaire de manière exogène. Les anticorps thérapeutiques produits ainsi présentent un taux de galactosylation élevé, et éventuellement des taux augmentés de liaisons terminales d'acide sialique alpha-2,6 sur leurs résidus glycanes liés au fragment Fc.

Dans certains modes de réalisation, l'anticorps présente un profil de glycosylation à teneur élevée en mannose. Tel qu'utilisé ici, un « profil de glycosylation à forte teneur en mannose » désigne un anticorps qui contient au moins un oligomannose ou une composition d'anticorps dans laquelle au moins 30% de l'anticorps contient au moins un oligomannose. Dans certains modes de réalisation au moins 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou plus des sucres des anticorps sont des oligomannoses non fucosylés. Dans d'autres modes de réalisation moins de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou moins des sucres des anticorps contiennent du fucose. Dans un autre mode de réalisation, les anticorps ont une faible teneur en fucose et une forte teneur en oligomannose. Ainsi, dans d'autres modes de réalisation, au moins 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% ou plus des sucres des anticorps sont de oligomannose et moins de 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 5% des sucres des anticorps contiennent du fucose. Ainsi, dans un autre mode de réalisation au moins 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% ou plus des sucres des anticorps sont de oligomannose non fucosylé et moins de 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 5% des sucres des anticorps contiennent du fucose.

Selon un aspect particulier, les oligosaccharides contenant du mannose peuvent contenir avantageusement de 5 à 9 mannoses. Un oligosaccharide contenant Y mannoses est décrits par le terme ManY. Par exemple, des oligosaccharides contenant du mannose peuvent inclure Man5, Man6, Man7, Man8 et Man9. Dans certains modes de réalisation, l'anticorps, tel que l'Adalimumab produit de manière transgénique présente une haute teneur en Man6. Dans certains modes de réalisation, le sucre majeur est le Man5. Dans certains modes de réalisation, au moins 10%, 15%, ou plus des sucres sont du Man5. Avantageusement, au moins 20% des sucres sont du Man5. Dans d'autres modes de réalisation, le sucre majeur est le Man6. Dans certains modes de réalisation, au moins 10%, 15%, ou plus des sucres de l'anticorps produit de manière transgénique sont du Man6. Avantageusement, au moins 20% des sucres sont du Man6. Dans d'autres modes de réalisation, le sucre majeur est le Man7. Dans certains modes de réalisation, au moins 10%, 15% ou plus des sucres sont du Man7. Avantageusement, au moins 20% des sucres sont du Man7.

Sont particulièrement avantageux les anticorps qui présentent un profil à fort taux de galactose ou mannose, comme décrits ci-dessus, en ce qu'ils présentent une forte affinité pour le récepteur FcYRIIIa (CD16). Par forte affinité, on désigne une affinité au moins égale à 2x10 ⁶ M ^"1 , de préférence au moins égale à 2x10 ⁷ M ^"1 , 2x10 ⁸ M ^"1 ou 2x10 ⁹ M ^"1 , telle que déterminée par l'analyse Scatchard ou la technologie BIAcore (Label-free surface plasmon résonance based technology). Ce récepteur est trouvé sur de nombreuses cellules immunitaires, parmi lesquelles les cellules tueuses naturelles, les macrophages, les neutrophiles, et les cellules mastocytaires.

Cette affinité pour le CD 16 permet une amélioration des activités de cytotoxicité dépendante du complément (CDC), ou à médiation cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) ou encore des phénomènes de phagocytose des cellules cibles, par rapport à des anticorps non hautement galactosylés ou non hautement mannosylés. Dans certains modes de réalisation, les populations d'anticorps anti-TNFa produites dans des cellules épithéliales de glandes mammaires sont supérieures, en termes de liaison au TNFa soluble, aux anticorps produits dans des cellules qui ne sont pas des cellules épithéliales de glandes mammaires. Dans certains modes de réalisation, les populations d'anticorps anti-TNFa produites dans des cellules de glandes mammaires sont supérieures, en termes de liaison au TNFa transmembranaire, aux anticorps produits dans des cellules qui ne sont pas des cellules épithéliales de glandes mammaires. Les tests pour déterminer le niveau de liaison au TNFa soluble ou au TNFa transmembranaire sont bien établis (voir par exemple Horiuchi et al.,Rheumatology et al. 49, page 1215). Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'anticorps anti-TNFa peut être l'anticorps décrit dans la demande internationale WO2014/125374.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique de l'invention telle que définie précédemment est dépourvue d'au moins un des excipients suivants : d'acide caprylique ou d'un sel de caprylate, de glucose, de fructose, de galactose, de mannose, de sorbose, de saccharose, de ribose, de désoxyribose, de sucrose, de maltitol, d'inuline, de lécithine, de tréhalose, de lactose, de maltose, de raffinose, de mannitol, de sorbitol, de glycérol, d'arabitol, de lactitol, de xylitol, de polypropylène glycol, de polyéthylène glycol, d'ester d'acides gras de sorbitane polyoxyéthylène, de polysorbate 20, de polysorbate 80, de poloxamers, d'éthers d'alkyles de polyoxyéthylène, d'éthers d'alkylphènylpolyoxyéthylène, de copolymère de polyoxyéthylène-polyoxypropylène, de dodécylsulphate de sodium, de succinate de sodium, de chlorure de sodium, de citrate de sodium, d'acide citrique monohydraté, de phosphate de sodium dibasique dihydraté, de phosphate de sodium monobasique dihydraté, de phosphate de sodium monobasique monohydraté ou d'EDTA.

Au sens de la présente invention, le terme « dépourvue » signifie que la composition de l'invention ne contient pas d'acide caprylique ou de sel de caprylate, de glucose, de fructose, de galactose, de mannose, de sorbose, de saccharose, de ribose, de désoxyribose, de sucrose, de maltitol, d'inuline, de lécithine, de tréhalose, de lactose, de maltose, de raffinose, de mannitol, de sorbitol, de glycérol, d'arabitol, de lactitol, de xylitol, de polypropylène glycol, de polyéthylène glycol, d'ester d'acides gras de sorbitane polyoxyéthylène, de polysorbate 20, de polysorbate 80, de poloxamers, d'éthers d'alkyles de polyoxyéthylène, d'éthers d'alkylphènylpolyoxyéthylène, de copolymère de polyoxyéthylène-polyoxypropylène, de dodécylsulphate de sodium, de succinate de sodium, de chlorure de sodium, de citrate de sodium, d'acide citrique monohydraté, de phosphate de sodium dibasique dihydraté, de phosphate de sodium monobasique dihydraté, de phosphate de sodium monobasique monohydraté ou d'EDTA ou qu'ils sont présents en une quantité négligeable, en particulier une quantité inférieure à 0,001 % (m/m). Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la composition pharmaceutique de l'invention telle que définie précédemment est dépourvue de molécule à effet anticoagulant, en particulier d'EDTA. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, la composition pharmaceutique de l'invention telle que définie précédemment est dépourvue de tensioactif, en particulier de polysorbate 20, de polysorbate 80 ou de poloxamer.

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, la composition pharmaceutique de l'invention telle que définie précédemment est dépourvue de molécule à effet laxatif, en particulier de mannitol, de sorbitol, de glycérol, de lactitol ou de xylitol.

Les excipients mentionnés ci-dessus ont notamment été écartés du fait de leur activité anticoagulante comme notamment l'EDTA, ou du fait qu'ils présenteraient un risque de développer une maladie de Crohn lorsqu'ils sont ingérés, comme notamment le polysorbate 20, le polysorbate 80 ou le poloxamer, ou du fait que ces excipients peuvent avoir un effet laxatif, comme notamment le mannitol, le maltitol, le lactitol, le xylitol ou le sorbitol.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale comprend : un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha), comme principe actif, et

du carboxyméthyle-dextran (CMD), comme excipient pharmaceutiquement acceptable.

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale comprend : - un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha), comme principe actif, et

du chitosan, comme excipient pharmaceutiquement acceptable.

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale comprend : - un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha), comme principe actif, et

une cyclodextrine, comme excipient pharmaceutiquement acceptable.

Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, la cyclodextrine peut être choisie parmi Γα-cyclodextrine, la β-cyclodextrine, la γ-cyclodextrine, un de leurs dérivés, comme notamment un dérivé hydroxypropyle, hydroxyéthyle, éthyle ou méthyle, une cyclodextrine béta éther sulfobutyle, une cyclodextrine branchée, un polymère à base de cyclodextrine ou un mélange de ceux-ci. Avantageusement, la cyclodextrine peut être Γ hydroxypropyl-β- cyclodextrine (ou HPBCD).

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale comprend : un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif, et

Γ hydroxypropyl-3-cyclodextrine (HPBCD), comme excipient pharmaceutiquement acceptable.

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale comprend : un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif, et

une combinaison de carboxyméthyle-dextran (CMD), et de cyclodextrine, notamment de Γ hydroxypropyl-3-cyclodextrine (HPBCD), comme excipient pharmaceutiquement acceptable.

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale comprend : un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif, et

une combinaison de carboxyméthyle-dextran (CMD) et de chitosan, comme excipient pharmaceutiquement acceptable.

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale comprend : un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif, et

une combinaison d'une cyclodextrine, notamment de Γ hydroxypropyl-β- cyclodextrine (HPBCD) et de chitosan, comme excipient pharmaceutiquement acceptable.

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale comprend : un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif, et

une combinaison de carboxyméthyle-dextran (CMD), de cyclodextrine, notamment de Γ hydroxypropyl-3-cyclodextrine (HPBCD) et de chitosan, comme excipient pharmaceutiquement acceptable.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale peut comprendre en outre au moins un acide aminé. Au sens de la présente invention, l'acide aminé peut être choisi parmi l'arginine, la glycine, la lysine, l'histidine, le glutamate, la glutamine, l'asparagine, l'isoleucine, la leucine, l'alanine, la phénylalanine, la thréonine, la tyrosine, le tryptophane, la méthionine, la sérine, la proline, la cystéine, la sélénocystéine, la proline, la valine, un de leurs sels dérivés, comme notamment un chlorhydrate ou un phosphate, ou un mélange de ceux-ci. Avantageusement, l'acide aminé est choisi parmi les acides aminés hydrophiles. Dans un mode de réalisation avantageux, l'acide aminé est la glycine ou un de ces sels dérivés, comme le chlorhydrate de glycine. Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'acide aminé est l'arginine ou un de ces sels dérivés, comme le chlorhydrate d'arginine.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale comprend : - un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif,

du carboxyméthyle-dextran (CMD), comme excipient pharmaceutiquement acceptable, et

un acide aminé, en particulier la glycine, éventuellement sous sa forme chlorhydrate.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale comprend : un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif,

- du chitosan, comme excipient pharmaceutiquement acceptable, et

un acide aminé, en particulier la glycine, éventuellement sous sa forme chlorhydrate. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale comprend : un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif,

- une cyclodextrine, en particulier l'hydroxypropyl-3-cyclodextrine (HPBCD), comme excipient pharmaceutiquement acceptable,

un acide aminé, en particulier la glycine, éventuellement sous sa forme chlorhydrate.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale comprend : un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif,

une combinaison de carboxyméthyle-dextran (CMD) et une cyclodextrine, en particulier l'hydroxypropyl-3-cyclodextrine (HPBCD), comme excipient

pharmaceutiquement acceptable, et

un acide aminé, en particulier la glycine, éventuellement sous sa forme chlorhydrate.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale comprend : - un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif,

une combinaison de carboxyméthyle-dextran (CMD) et du chitosan, comme excipient pharmaceutiquement acceptable, et

un acide aminé, en particulier la glycine, éventuellement sous sa forme chlorhydrate.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale comprend : un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif,

- une combinaison d'une cyclodextrine, notamment de Γ hydroxypropyl-β- cyclodextrine (HPBCD) et de chitosan, comme excipient pharmaceutiquement acceptable et un acide aminé, en particulier la glycine, éventuellement sous sa forme chlorhydrate.

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale consiste en : un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif, et

du carboxyméthyle-dextran (CMD), comme excipient pharmaceutiquement acceptable.

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale consiste en : un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif,

du carboxyméthyle-dextran (CMD), et

une cyclodextrine, en particulier l'hydroxypropyl-3-cyclodextrine (HPBCD).

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale consiste en : un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif,

une combinaison de carboxyméthyle-dextran (CMD) et de cyclodextrine, en particulier l'hydroxypropyl-3-cyclodextrine (HPBCD), comme excipient pharmaceutiquement acceptable,

un acide aminé, en particulier la glycine, éventuellement sous sa forme chlorhydrate.

Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la composition pharmaceutique pour administration orale consiste en : un anticorps monoclonal anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-alpha) comme principe actif, et

du chitosan, comme excipient pharmaceutiquement acceptable.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la composition pharmaceutique selon l'invention est sous forme solide. La composition pharmaceutique sous forme solide peut être obtenue par toute technique bien connue de l'homme du métier. Avantageusement, la composition pharmaceutique sous forme solide peut être obtenue par lyophilisation, atomisation de séchage ou par séchage par vaporisation.

Les compositions de la présente invention peuvent se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées pour une administration orale, notamment sous forme de comprimés, de gélules, de capsules, des tablettes, de poudre, de sirop ou de toute forme pour préparation orale solide ou sous toute forme de préparation buvable.

Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, la composition se présente sous la forme d'une formulation à libération prolongée et/ou retardée. Au sens de la présente invention, on entend par « formulation à libération prolongée et/ou retardée », une forme galénique adaptée à une libération ciblée au niveau du tractus gastro-intestinal, et en particulier de l'intestin. Par « intestin » on entend ici toutes les parties de l'intestin, en particulier le côlon. De telles compositions sont particulièrement utiles dans le traitement des maladies inflammatoires de l'intestin, car elles permettent une action locale au site de l'infection (notamment intestin grêle ou côlon). Elles limitent en outre le passage des anticorps dans la circulation sanguine, limitant les effets secondaires liés aux anticorps anti- TNFa.

Plusieurs stratégies existent pour préparer des médicaments administrés par voie orale, dont le ou les principes actifs ne sont libérés qu'au niveau de l'intestin, de préférence qu'au niveau du côlon. Certaines stratégies comprennent la liaison covalente du médicament avec un support. Peuvent aussi être utilisés des excipients et véhicules qui sont dégradés par les bactéries du côlon. Toutes ces stratégies sont bien connues de la personne du métier.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique sous la forme d'une formulation à libération prolongée et/ou retardée comprenant l'anticorps anti-TNFa et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tel que décrit ci-dessus peut être formulée sous des formes posologiques solides, comme des comprimés ou gélules. Avantageusement, la composition pharmaceutique sous la forme d'une formulation à libération prolongée et/ou retardée comprenant l'anticorps anti-TNFa et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tel que décrit ci-dessus peut comprendre en outre au moins un agent d'enrobage. L'agent d'enrobage, de par sa résistance au pH acide de l'estomac (compris entre 1 et 3) permet notamment de protéger la composition comprenant l'anticorps anti-TNFa et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable du pH acide de l'estomac et leur libération dans l'intestin grêle et le côlon où les valeurs de pH sont proches de 7. Avantageusement, l'agent d'enrobage peut être un agent filmogène, de préférence gastro-soluble ou un agent de dragéification. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'agent d'enrobage peut être choisi dans le groupe comprenant : dérivés d'acides acryliques, dérivés d'acides méthacryliques, dérivés d'acrylate d'éthyl, dérivés d'hydroxypropylméthylcellulose, dérivés de polyvinylacétate phatlates; poly(acrylate de méthyle -co- méthacrylate de méthyl -co- acide méthacrylique, poly(acide méthacrylate -co- méthacrylate de méthyle), notamment commercialisé sous les noms Eudragit ^® S100 Eudragit ^® FS30D, Eudragit ^® L100, Eudragit ^® L12,5, Eudragit ^® L30D- 55, Eudragit ^® , L100-55, Eudragit ^® S12,5, hydroxypropylméthylcellulose (HPMCP), succinyl acétate d'hydroxypropylméthylcellulose, également appelé HPMCAS et commercialisé sous le nom AQOAT ^® , Shellac ou un mélange de ceux-ci.

Dans un mode de réalisation particulier, la composition pharmaceutique sous la forme d'une formulation à libération prolongée et/ou retardée comprenant l'anticorps anti-TNFa et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable tel que décrit ci-dessus peut comprendre une monocouche d'un seul agent d'enrobage, une monocouche constituée d'un mélange de plusieurs agents d'enrobage, une multicouche constituée d'un seul agent d'enrobage; une multicouche constituée d'un mélange de plusieurs agents d'enrobage différents ou une superposition de plusieurs monocouches constituées d'un seul agent d'enrobage.

Dans un autre mode de réalisation, on peut utiliser des formulations qui sont revêtues avec des polymères dégradables par les micro-organismes du côlon (plus particulièrement par les enzymes bactériennes comme des azoréductases et glycosidases), par exemple des polymères azoïques ayant un degré élevé d'hydrophilie. Des gels et hydrogels peuvent également être utilisés, notamment des hydrogels à base de polysaccharides.

Les compositions de l'invention peuvent comprendre ou être associées à d'autres agents thérapeutiques utiles dans le traitement des maladies inflammatoires ou des maladies auto- immunes.

Un autre aspect de l'invention concerne un procédé de préparation d'une composition pharmaceutique à libération prolongée et/ou retardée, ledit procédé comprenant : a) Une étape de mélange de l'anticorps anti-TNF alpha avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables choisis dans le groupe comprenant : un carboxyméthyle- dextran, un chitosan, une cyclodextrine ou une combinaison de ceux-ci. b) Une étape de séchage, particulièrement par atomisation, de la composition obtenue à l'étape a), c) Une étape d'enrobage.

Avantageusement, l'étape c) d'enrobage peut être réalisée par toute technique bien connue de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape c) d'enrobage peut être réalisée par dragéification, par pelliculage, notamment par l'ajout d'agent filmogènes, par atomisation (« spraying »), par enrobage entérique en lit fluidisé, par enrobage à sec, par enrobage effeuillable. Par « enrobage à sec », on entend tout procédé sans solvant utilisant une action mécanique pour recouvrir une forme pharmaceutique solide d'une couche discrète ou continue de poudres inertes ou actives. Il permet par exemple l'obtention de particules composites comportant plusieurs couches de compositions différentes.

Dans un mode de réalisation particulier, l'étape c) d'enrobage peut être réalisée avec un ou plusieurs agents d'enrobage en appliquant : une monocouche constituée d'un seul agent d'enrobage, ou

une monocouche constituée d'un mélange de plusieurs agents d'enrobages, ou - une multicouche constituée d'un seul agent d'enrobage, c'est-à-dire une superposition de plusieurs monocouches constituées du même agent d'enrobage, ou

une multicouche constituée d'un mélange de plusieurs d'agents d'enrobages, ou une superposition de plusieurs monocouches constituées d'un seul agent d'enrobage, chacune des monocouches ayant un agent d'enrobage différent.

Un autre aspect de l'invention concerne une composition pharmaceutique à libération prolongée et/ou retardée comprenant un anticorps anti-facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa) et au moins un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables choisis dans le groupe comprenant : un carboxyméthyle-dextran, un chitosan, une cyclodextrine ou une combinaison de ceux-ci, pour son utilisation dans le traitement des maladies inflammatoires ou des maladies auto-immunes.

Un autre aspect de l'invention est une méthode de traitement des maladies inflammatoires ou des maladies auto-immunes comprenant l'administration à un patient qui en a besoin d'une composition pharmaceutique à libération prolongée comprenant un anticorps anti- facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa) et au moins un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables choisis dans le groupe comprenant : un carboxyméthyle- dextran, un chitosan, une cyclodextrine ou une combinaison de ceux-ci. FIGURES

Figure 1 : Résultats du test fonctionnel à T0, T+2 heures et T+5 heures après passage dans le système SHI ME®.

Dans cette figure, les 10 formulations sont présentées dans l'ordre suivant (de gauche à droite) : 1/ sans excipients, 21 HPBCD, 3/ CMD, 4/ HPBCD + CMD, 5/ HPCD + EDTA, 6/ Polysorbate 20 + EDTA + Tréhalose, 7/ Poloxamer 188 + EDTA + Tréhalose, 8/ CMD + Polysorbate 20 + Arginine, 9/ CMD + Polysorbate 20 + Glycine, 10/ Chitosan.

Figure 2 : Caractéristiques des différentes formulations testées dans l'exemple 4.

Les exemples suivant illustrent l'invention sans en limiter la portée.

EXEMPLES

Dans les exemples ci-dessous, et sauf mention contraire, les anticorps anti-TNFa utilisés sont ceux décrits dans la demande internationale WO2014/125374 de la Demanderesse.

Exemple 1 : présélection d'excipients par test de compatibilité

Un 1 ^er essai a été conduit afin de présélectionner plusieurs excipients sur la base de leur bonne compatibilité avec les anticorps anti-TNFa à 1 mg/mL en tampon acétate 10mM à pH 5,5. Les excipients testés sont récapitulés dans le tableau suivant :

Excipients

Albumine humaine sérique 1 .25 mg/mL

Arginine 1 .25 mg/mL

Carbopol 971 P 1 .25 mg/mL

Carbopol 974P 1 .25 mg/mL

Carboxymethyl-Dextran 20 mg/mL

Chitosan 1 .25 mg/mL

Glycine 1 .25 mg/mL

Hydroxypropyl- beta-cyclodextrine (HPBCD) 20 mg/mL

Inuline 20 mg/mL

Lécithine 1 .25 mg/mL

Maltitol 20 mg/mL

Mannitol 20 mg/mL

Na2 EDTA 1 .25 mg/mL

Pluronic F127 1 .25 mg/mL

Poloxamer 188 1 .25 mg/mL

Polysorbate 20 1 .25 mg/mL

Sodium lauryl sulfate (SLS) 1 .25 mg/mL

Sorbitol 20 mg/mL

Tableau 1 : formulations testées en essai de compatibilité

Les formulations d'anticorps anti-TNFa en présence des différents excipients sont mises en stabilité à 5, 40 et 50°C pendant 3, 7 et 14 jours. A chaque étape, les formulations font l'objet des analyses suivantes :

• SEC (Size Exclusion Chromatography) permettant l'analyse des formes monomères, formes de haut poids moléculaire et formes dégradées de l'anticorps anti-TNFa. Cette analyse montre la capacité de la formulation à conserver la protéine dans sa forme d'intérêt (forme active monomère) ainsi que la formation de formes polymérisées et/ou agrégats (formes de haut poids moléculaire pouvant être responsable d'effets secondaires lors de l'administration au patient) et/ou la formation de formes dégradées non actives.

Protocole simplifié : les échantillons de formulation d'anticorps anti-TNFa sont dilués à 2 mg/mL dans un tampon PBS (10mM Na ₂ HP0 ₄ + 1 .8 mM KH ₂ P0 ₄ + 2.7 mM KCI + 137 mM NaCI) puis centrifugés pendant 5 min à 15 000g. Les surnageants sont transférés dans des flacons, déposés en gel de chromatographie pour séparation puis chaque pic est détecté par mesure d'absorbance à 280 nm.

DLS (Dynamic Light Scattering ou Diffusion dynamique de la lumière) permettant le suivi de l'agrégation d'une formulation. Cette analyse montre la capacité de la formulation à conserver la protéine dans sa forme d'intérêt (forme active monomère) ainsi que la formation d'agrégats (formes de haut poids moléculaire pouvant être responsables d'effet secondaires lors de l'administration au patient ou de perte d'efficacité)

Protocole simplifié : Les échantillons sont dilués à 2mg/mL en eau ultrapure puis analysés par DLS.

Test fonctionnel : Le test d'activité fonctionnelle consiste en un test de liaison de l'anticorps à des protéines TNFa membranaires avec détection par cytométrie en flux, permettant de déterminer la conservation de l'activité de liaison de l'anticorps à sa cible.

Protocole simplifié : 2 x 10 ⁵ cellules Jurkat transfectées pour exprimer le TFNa membranaire sont incubées avec 100 μΙ d'anticorps anti-TNF à différentes concentrations (0 à 100 μΙ/ml, concentration finale) à 4°C pendant 30 minutes. Après lavage l'anticorps anti-Fc IgG de chèvre couplé à la phycoérythrine (100 μΙ d'une dilution au 1 :100) est ajouté à 4°C pendant 30 minutes. Les cellules sont lavées et l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) mesurée par cytométrie en flux. Une courbe de réponse est établie avec l'anticorps référence (anticorps anti-TNFa en tampon PBS) pour définir la concentration minimale d'anticorps donnant le plateau. Tous les échantillons sont testés à 0,125μg ml. Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à une référence et normalisés comme suit :

Activité conservée = 80-100% de l'activité initiale

Activité légèrement diminuée : 50-80% de l'activité initiale

Perte d'activité : <50% de l'activité initiale Les résultats sont les suivants : Résultats de SEC:

Les résultats de SEC sont présentés dans le tableau 2 :

Excipient Résultats de l'analyse SEC - 14 Résultats de l'analyse jours à 5°C SEC - 14 jours à 50°C

Albumine 1 ,25 mg/mL Moyen Moyen

humaine sérique

Arginine 1 ,25 mg/mL Bon Bon

Carbopol 971 P 1 ,25 mg/mL NA - précipitation de la protéine NA - précipitation de la protéine

Carbopol 974P 1 ,25 mg/mL NA - précipitation de la protéine NA - précipitation de la protéine

Carboxymethyl- 20 mg/mL Bon Bon

Dextran (CMD)

Chitosan 1 ,25 mg/mL NA - conditions analytiques non NA - conditions analytiques adaptées (pH optimum) non adaptées (pH optimum)

Glycine 1 ,25 mg/mL Bon Bon

Hydroxypropyl- 20 mg/mL Bon Bon

beta-

Inuline 20 mg/mL Précipitation de la protéine Précipitation de la protéine

Lécithine 1 ,25 mg/mL Précipitation de la protéine Précipitation de la protéine

Maltitol 20 mg/mL Légère précipitation de la protéine Légère précipitation de la protéine

Mannitol 20 mg/mL Bon Bon

Na2 EDTA 1 ,25 mg/mL Bon Bon Pluronic F127 1 ,25 mg/mL Bon Bon

Poloxamer 188 1 ,25 mg/mL Bon Bon

Polysorbate 20 1 ,25 mg/mL Bon Bon

Sodium lauryl 1 ,25 mg/mL Précipitation de la protéine Précipitation de la protéine sulfate (SLS)

Sorbitol 20 mg/mL Bon Bon

Tableau 2 : Résultats de l'analyse en SEC

Les résultats considérés comme bons permettent de préserver à la fois la quantité et la qualité de la protéine, notamment après stress à 50°C pendant 14 jours (conservation de la quantité de protéines et conservation du profil de distribution des formes de la protéine).

Le taux de protéines total diminue significativement pour les formulations comprenant du carbopol, de la lécithine, du SLS, de l'albumine, de l'inuline, et du maltitol, indiquant la formation de protéines insolubles qui ont été enlevées par centrifugation.

En général, aucune variation de la quantité de protéine et de la distribution des différentes formes de la protéine n'est observée pour les autres formulations testées, montrant que ces formulations sont compatibles avec l'anticorps anti-TNFa.

Résultats de DLS:

Les résultats de DLS sont présentés dans le tableau 3 :

Résultats de distribution d'intensité

Taille moyenne

Intensité (%)

Excipient (diamètre en nm)

Pic 1

Pic 1 : Pic 2 Pic 3 Pic 2 Pic 3 monomères (autres) (autres) Monomères (autres) (autres)

Albumine humaine

sérique 12,5 292,7 0,0 93,8 6,2 0,0

Arginine 12,9 498,6 5131 ,0 81 ,3 16,9 1 ,8

Carbopol® 974P NA - précipitation de la protéine

Carbopol® 971 P NA - précipitation de la protéine

Carboxymethyl- Dextran (CMD) 20,0 2,4 0,0 91 ,0 9,0 0,0

Chitosan 14,5 725,9 0,0 73,2 26,8 0,0

Glycine 14,2 0,0 0,0 100,0 0,0 0,0

Hydroxypropyl- beta-cyclodextrine

(HPBCD) 14,3 2,1 5093,0 87,9 9,0 3,1

Inuline NA - précipitation de la protéine

Lécithine NA - précipitation de la protéine

Maltitol NA - précipitation de la protéine

Mannitol 13,6 5277,0 0,0 98,0 2,0 0,0

Na2 EDTA 13,4 726,0 419,9 92,4 2,9 2,6 Pluronic F127 12,3 349,8 71 ,7 72,3 20,1 7,6

Poloxamer 188 1 1 ,4 171 ,1 0,0 97,2 2,8 0,0

Polysorbate 20

1 1 ,7 0,0 0,0 100,0 0,0 0,0 (Tween 20)

Sodium lauryl

sulfate (SLS) 12,0 0,0 0,0 100,0 0,0 0,0

Sorbitol 14,2 4969,0 0,0 98,0 2,0 0,0

Contrôle (protéine

seule) 13,4 4273,0 723,9 95,1 4,3 0,6

Tableau 3 : Résultats de l'analyse en SEC - résultats de distribution d'intensité à

5°C au jour 5

Les résultats en DLS confirment que les formulations comprenant du Carbopol (971 P et 974P), de l'inuline, de la lécithine, du maltitol, ne permettent pas de maintenir la stabilité de l'anticorps anti-TNFa.

Les autres formulations montrent une bonne conservation de la protéine, particulièrement en présence des excipients CMD, chitosan, glycine ou HPBCD.

Résultats du test fonctionnel

Les formulations considérées comme compatibles (bons résultats uniquement) en SEC et en DLS, sont ensuite testées en activité fonctionnelle.

Les résultats du test fonctionnel sont indiqués dans le tableau 4 ci-dessous :

Conclusion

A T0, dès l'ajout de l'anticorps anti-TNFa, les formulations comprenant les excipients Carbopol 971 P, Carbopol 974P, lécithine, inuline et maltitol sont déterminées comme incompatibles avec l'anticorps anti-TNFa, à cause de la formation de flocons blanc (floculations de la formulation), indiquant que la protéine d'intérêt et/ou la protéine et son excipient ont précipité.

L'analyse des résultats de SEC, de SLS et d'activité combinés démontre la compatibilité de l'anticorps anti-TNFa avec les excipients arginine, CMD, chitosan, glycine, HPBCD, mannitol, Na EDTA, Pluronic® F127 et, qui sont donc adaptés à la formulation de l'anticorps.

Exemple 2 : Atomisation de séchage Afin d'obtenir une formulation sous forme sèche, différentes formulations sont soumises à un essai d'atomisation de séchage. Les formulations testées sont récapitulées dans le tableau :

Tableau 5 : Formulations testées en atomisation de séchage

L'essai permet d'évaluer la formation de poudre sèche et le besoin éventuel d'addition de protectants (surfactants et/ou acides aminés) pendant l'étape de séchage. L'atomisation de séchage des solutions placebo (sans ajout de l'anticorps anti-TNFa) a été optimisée sur un atomiseur de séchage à échelle laboratoire type B-290 (Buchi, Flawil, Suisse).

L'essai est ensuite réalisé avec les excipients et avec ajout d'anticorps anti-TNFa. Les particules séchées par atomisation de séchage sont collectées dans un réservoir attaché à un cyclone. Après le procédé, la poudre est refroidie à température ambiante et transférée en flacon verre.

Les paramètres du procédé sont les suivants :

• Température d'arrivée du gaz séchant : 100-150°C

· Température de sortie du gaz séchant: 50-80°C

• Débit d'alimentation : 1 -50 g/min

• Aspiration : 100%

• Gaz : air ou azote

Analyse des poudres reconstituées :

Les poudres obtenues présentent une teneur en humidité résiduelle inférieure à 15% en poids.

Les poudres sont ensuite reconstituées en tampon acétate (500μί pour 5 mg de poudre) afin de contrôler l'impact négatif éventuel de l'étape de séchage par atomisation. Toutes les poudres présentent une bonne conservation de la quantité et de la qualité de la protéine anticorps anti-TNFa.

L'objectif étant d'administrer la composition comprenant les excipients et la protéine d'intérêt par voie orale, avec libération de préférence dans le tractus gastro-intestinal, l'évaluation de la remise en solution des poudres atomisées n'a pas été considérée comme un critère pertinent. Exemple 3 : Formulations adaptées à l'administration par voie orale

Les 10 formulations de l'exemple 2, sélectionnées précédemment comme assurant la stabilité de l'anticorps anti-TNFa et séchées, sont ensuite testées pour l'administration par voie orale. En particulier, un essai a été réalisé dans un modèle mimant le colon ascendant (Système SHIME® de la société ProDigest) afin d'étudier l'effet de chaque formulation.

Les échantillons, après passage dans le système SHIME®, sont soumis à un test d'activité fonctionnel selon le protocole suivant :

2 x 10 ⁵ cellules Jurkat transfectées pour exprimer le TFNa membranaire sont incubées avec100 μΙ d'anticorps anti-TNF à différentes concentrations (0 à 100 μΙ/ml, concentration finale) à 4°C pendant 30 minutes. Après lavage de l'anticorps anti-Fc IgG de chèvre couplé à la phycoérythrine (100 μΙ d'une dilution au 1 : 100) est ajouté à 4°C pendant 30 minutes.

Les cellules sont lavées et l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) mesurée par cytométrie en flux. Une courbe de réponse est établie avec l'anticorps référence (anticorps anti-TNFa en tampon PBS) pour définir la concentration minimale d'anticorps donnant le plateau. Tous les échantillons sont testés à 0,125μg ml. Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à une référence et normalisés.

Résultats: Les résultats du test fonctionnel à T0, T+2 heures et T+5 heures de l'incubation dans le côlon ascendant sont présentés dans la figure 1 .

Tous les échantillons conservent leur capacité à lier le TNFa membranaire. Les résultats confirment que l'absence d'excipients est délétère pour la conservation de l'activité fonctionnelle de l'anticorps anti-TNFa. De plus, les formulations comprenant du CMD, de l'HPBCD + CMD, de l'HPBCD + EDTA, du CMD + Polysorbate20 + Glycine ou du chitosan montrent un bon effet protecteur de l'activité fonctionnelle de l'anticorps anti- TNFa.

L'essai confirme donc que des formulations comprenant l'anticorps anti-TNFa en présence des excipients CMD, chitosan, EDTA, glycine, HPBCD ou polysorbate20, seuls ou en combinaison, sont donc adaptées à la formulation de l'anticorps pour son administration par voie orale. Exemple 4 : Confirmation des formulations d'intérêt

Les formulations de l'exemple 2 et 3 sont ensuite évaluées au regard de leurs capacités à préserver l'intégrité de l'anticorps et leur inocuité pour l'administration.

Les formulations suivantes sont écartées du fait de leurs effets secondaires potentiels lors de l'administration par voie orale avec libération ciblée dans le tractus gastro-intestinal : les formulations comprenant des tensioactifs (polysorbate 20 ou Poloxamer 188) car ceux-ci, bien que parfaitement tolérés en administration intra-veineuse ou sous- cutanée, sont suspectés d'être responsables, lorsqu'ils sont ingérés, d'une augmentation du risque de développer une maladie inflammatoire de l'intestin telle que la maladie de Crohn. les formulations comprenant des molécules à effet anticoagulant, tel que l'EDTA les formulations comprenant des polyols, en particulier du mannitol, maltitol, sorbitol, glycérol, lactitol, ou du xylitol qui peuvent avoir un effet laxatif.

Les caractéristiques des différentes formulations testées sont présentées dans le tableau de la figure 2.

Les lignes grisées dans le tableau de la figure 2 représentent les formulations non retenues pour une administration par voie orale de l'anticorps anti-TNFa.

Les essais confirment donc que des formulations comprenant l'anticorps anti-TNFa en présence des excipients CMD, chitosan, HPBCD ou glycine, seuls ou en combinaison, sont donc adaptées à la formulation de l'anticorps pour son administration par voie orale.

Exemple 5 : Formulation par voie orale avec libération dans le tractus gastrointestinal Les formulations suivantes :

- anticorps anti-TNFa + CMD

- anticorps anti-TNFa + CMD + HPBCD -

- anticorps anti-TNFa + CMD + HPBCD + Glycine anticorps anti-TNFa + Chitosan

sont ensuite soumises à une étape d'enrobage.

Différents essais sont réalisés afin de tester différents enrobages :

- monocouche d'un agent d'enrobage,

monocouche d'un mélange d'agents d'enrobage,

multicouche d'un agent d'enrobage,

multicouche de plusieurs agents d'enrobage différents,

multicouche d'un mélange d'agents d'enrobage.

Les agents d'enrobage testés sont préférentiellement des enrobages entériques du fait de la sensibilité acide de l'anticorps, notamment des dérivés d'acides acryliques, dérivés d'acides méthacryliques, dérivés d'acrylate d'éthyl, dérivés d'hydroxypropylméthylcellulose, dérivés de polyvinylacétate phatlates ; en particulier Eudragit® FS30D, Eudragit® S100, Eudragit® L100, Eudragit®L12,5, Eudragit® L30D-55, Eudragit® L100-55, Eudragit® S12,5, HPMC AS (AQOAT®), HPMCP®, Shellac.

Les résultats obtenus confirment la bonne libération de l'anticorps anti-TNFa.