(アポトーシス抑制剤)
 本発明のアポトーシス抑制剤は、関節軟骨� ��おける軟骨細胞のアポトーシスを抑制する� ��めのアポトーシス抑制剤であり、破骨細胞� ��成抑制因子を有効成分として含み、更に必� ��に応じて適宜その他の成分を含んでいる。� ��お、前記アポトーシス抑制剤の好ましい態� ��は、変形性関節症における関節軟骨の変性� ��治療又は予防するための医薬であり、その� ��ましい投与態様は、被検体の関節内への直� ��投与である。

<破骨細胞形成抑制因子>
 本発明において、前記破骨細胞形成抑制因� ��としては、OCIF/OPGそのものの他、その類縁� �若しくはその変異体、又はそれらの修飾体� �挙げることができる。

 前記OCIF/OPGは、当初、破骨細胞形成抑制活� �を指標として単離されたものであり、破骨� �胞の分化/成熟を抑制する活性を有するタン� ��ク質である(国際公開第96/26217号及び米国特� ��第6,855,808号)。具体的には、OCIF/OPGは、下記� ��(a)~(d)に記載の物理化学的性質を有し、且つ 、破骨細胞の分化及び/又は成熟抑制活性を� �するタンパク質を意味する(国際公開第96/2621 7号及び米国特許第6,855,808号)。
(a) 分子量(SDS-PAGEによる):約60kD(還元条件下)� �約60kD及び約120kD(非還元条件下)。
(b) 親和性:陽イオン交換体及びヘパリンに親 和性を有する。
(c) 熱安定性:70℃、10分間又は56℃、30分間の� ��熱処理により、破骨細胞の分化・成熟抑制� ��性が低下し、90℃、10分間の加熱処理により 破骨細胞の分化・成熟抑制活性が失われる。
(d) 内部アミノ酸配列:配列番号1~3記載のアミ ノ酸配列を内部アミノ酸配列として有する。
 なお、配列番号1~3記載のアミノ酸配列にお� ��て、Xaaは任意のアミノ酸を取りうるが、好� ��しくは、配列番号1において1位のXaaはThrで� �り、配列番号2において1位のXaaはArgであり、 5位のXaaはSerであり、13位のXaaはLeuであり、配 列番号3において1位のXaaはThrである。
 ここで、本件実施例(後述)においては、OCIF/ OPGが、関節軟骨のアポトーシスを直接抑制す ることが見出された。従って、本発明におけ るOCIF/OPGは、関節軟骨のアポトーシスを直接� ��制する活性を有するものである。
 上記(a)の物理化学的性質から判るように、O CIF/OPGは、一量体と二量体の形態をとりうる(� ��際公開第96/26217号及び米国特許第6,855,808号)� ��OCIF/OPGを発現する細胞(例えば、天然にはヒ� ��胎児肺線維芽細胞IMR-90(ATCC寄託-受託番号CCL1 86))を含む培養液等には、当該一量体と二量� �とが通常混在する。そこで、通常の分離方� �によりいずれか一方の形態のOCIF/OPGを精製し 、本発明において使用してもよい。
 ヒトOCIF/OPGは、シグナルペプチドを含む前� �体(cDNA:配列番号4及びアミノ酸配列:配列番号 5)として合成され、シグナルペプチドが切断� ��れ、成熟型タンパク質(配列番号5に示すア� �ノ酸配列において、シグナルペプチド(第1番 目~第21番目のアミノ酸配列)を除くアミノ酸� �列)となる。本発明において、OCIF/OPGは、上� �のヒト由来のシグナルペプチドを含む前駆� �及び成熟型タンパク質のいずれをも含むが� �成熟型タンパク質が好ましい。

 前記OCIF/OPG類縁体とは、OCIF/OPGをコードする 塩基配列と相補的な塩基配列から成るDNAとハ イブリダイズするDNAによりコードされ、且つ 関節軟骨のアポトーシスを抑制するタンパク 質を意味し、その中でも、更に活性物質とし て用いられる場合、関節軟骨の変性改善作用 を有するものが本発明の医薬の活性物質とし て使用される。OCIF/OPG類縁体は、例えば、動� ��細胞、体液又は組織由来のcDNAライブラリー を鋳型として、ヒトOCIF/OPGのcDNA(配列番号4)と 相補的な塩基配列から成るDNAをプローブとし 、ストリンジェントな条件下でハイブリダイ ズするDNAによりコードされる、関節軟骨のア ポトーシス抑制活性を有するタンパク質であ る。ここで、ストリンジェントな条件とは、 いわゆる特異的なハイブリッドが形成される 条件をいう。このようなストリンジェントな 条件は、当業者には周知であり、例えばCurren t Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N. Y.(1989),6.3.1-6.3.6に見出すことができる。スト� ��ンジェントなハイブリダイゼーション条件� ��好ましい非制限的例としては、約45℃の6×� �化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)にお� �るハイブリダイゼーション後、50~65℃の0.2×S SC、0.1%SDSで1回以上洗浄するものが挙げられ� �。
 具体的なOCIF/OPG類縁体としては、例えば、� �際公開第96/26217号及び米国特許第6,855,808号に 開示のOCIF2(cDNA:配列番号6及びアミノ酸配列:� �列番号7)、OCIF3(cDNA:配列番号8及びアミノ酸配 列:配列番号9)、OCIF4(cDNA:配列番号10及びアミ� �酸配列:配列番号11)、及びOCIF5(cDNA:配列番号12 及びアミノ酸配列:配列番号13)が挙げられる� �なお、OCIF2~5におけるシグナルペプチドのア� ��ノ酸配列及び成熟型タンパク質のアミノ酸� ��列は、以下の表1に示す通りである。

 また、前記OCIF/OPG変異体とは、上述のOCIF/OPG 又はOCIF/OPG類縁体において、1又は複数のアミ ノ酸が置換、欠失、挿入及び/又は付加され� �アミノ酸配列から成り、且つ関節軟骨のア� �トーシス抑制活性を有するタンパク質を意� �し、その中で、更に関節軟骨の変性改善作� �を有するものが本発明の医薬の活性物質と� �て使用される。OCIF/OPG変異体において、上記 複数のアミノ酸は、数個(例えば、1~10個、好� ��しくは1~5個、特に好ましくは1~3個)であって もよい。なお、ヒトOCIF/OPG(配列番号5記載の� �ミノ酸配列)においては、C末端から204アミノ 酸までを欠失させたC末端欠失変異体におい� �も、破骨細胞分化及び/又は成熟抑制活性が� ��認されており、生物活性は主にN末端側のド メインによるものと考えられている(国際公� �第96/26217号、米国特許第6,855,808号及びYamaguchi  K.ら,The Journal of Biological Chemistry(1998),Vol.27 3,No.9,pp.5117-5123)。このようなC末端欠失変異体 も、本発明における関節軟骨のアポトーシス 抑制目的において使用することが考えられる 。
 OCIF/OPG変異体の好適な態様としては、ヒトOC IF/OPG(配列番号5記載のアミノ酸配列)において 数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び/又� �付加したアミノ酸配列からなり、且つ関節� �骨のアポトーシス抑制活性、並びに関節軟� �変性改善作用を有するタンパク質、及びヒ� �OCIF/OPG(配列番号5記載のアミノ酸配列)におい て第22番目のGluをN末端とし、第197番目~第400� �目のいずれかのアミノ酸をC末端とするタン� ��ク質であって、関節軟骨のアポトーシス抑� ��活性並びに関節軟骨変性の改善作用を有す� ��タンパク質が挙げられる。
 更に、OCIF/OPG変異体には、上述のOCIF/OPG又は OCIF/OPG類縁体をコードするヌクレオチド配列� ��、少なくとも約60~65%、好ましくは約70~75%、� ��に好ましくは約80~85%、特に好ましくは約90~9 5%以上同一であるヌクレオチド配列によりコ� ��ドされ、且つ関節軟骨のアポトーシス抑制� ��性並びに関節軟骨変性改善作用を有するタ� ��パク質が含まれる。

 前記OCIF/OPG修飾体とは、例えば、上述したOC IF/OPG、その類縁体又は変異体のペプチドや糖 鎖の酵素的又は化学的修飾体、或いはポリマ ー等の高分子化合物や多糖類の修飾体を意味 する。OCIF/OPG修飾体としては、例えばタンパ� ��質の翻訳後修飾(例えば、糖の付加、プロテ インキナーゼによるリン酸化やホスファター ゼによる脱リン酸化)、水溶性ポリマー(ポリ� ��チレングリコール、エチレングリコール/プ ロピレングリコール共ポリマー、カルボキシ メチルセルロース、ポリビニルアルコール、 PolyPEG(copolymer of poly(ethyleneglycol)allylmethylether� �and maleamic acid sodium salt)、ヘパリン、デキ� ��トラン硫酸等)等による化学修飾等の修飾が なされたOCIF/OPG、その類縁体又は変異体が挙� ��られる。更に、例えば、OCIF/OPG、その類縁� �又は変異体とFc(IgG等の免疫グロブリン由来� �Fc領域)やアルブミン等のペプチドやタンパ� �質との融合タンパク質;OCIF/OPG、その類縁体� �は変異体と多糖類(ヘパリン、デキストラン� ��酸等)との複合体;及びOCIF/OPG、その類縁体又 は変異体とPolyPEGとの複合体も、OCIF/OPG修飾体 に含まれる。
 具体的には、OCIF/OPG、その類縁体又は変異� �のポリエチレングリコールによる修飾体は� �例えば、国際公開第97/23614号に記載の方法に より製造できる。また、OCIF/OPG、その類縁体� ��は変異体の多糖類による修飾体において、� ��糖類としてはデキストラン硫酸、特にデキ� ��トラン硫酸ナトリウム5(DS5)が好ましく、こ� ��ような修飾体は、例えば、特開2003-160601号� �米国特許出願公開第2003-0045456号に記載の方� �により製造できる。更に、OCIF/OPG、その類縁 体又は変異体のPolyPEGによる修飾体は、例え� �、特開2005-206569号や米国特許出願公開第2006-0 062754号に記載の方法により製造できる。

 なお、ヒト以外の動物(例えば、ラット、 マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、 ヒツジ、ヤギ等の哺乳動物、並びにニワトリ 、ガチョウ、シチメンチョウ等の鳥類)由来� �OCIF/OPGも、上述の定義の範囲内にあれば、前 記OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体、又は� ��飾体に含まれる。

 OCIF/OPG、その類縁体若しくは変異体、又は� �れらの修飾体(以下、「OCIF/OPG物質」という)� ��、動物の組織や体液等から、又は動物細胞� ��培養物等からタンパク質として抽出、精製� ��れた天然型のタンパク質として、或いは、� ��れらOCIF/OPG物質をコードするDNA断片又は当� �DNA断片を含有するベクターで動物細胞や大� �菌等の宿主を形質転換し、生産される遺伝� �組換え型(以下では、ヒト遺伝子組換えタン� ��ク質について「rh」という場合がある)タン� ��ク質として、更にはこれらの修飾体として� ��取得することができる。例えば、国際公開� ��96/26217号(及び米国特許第6,855,808号)に開示の OCIF/OPGの製造方法に準じて、OCIF/OPG物質をOCIF/ OPG物質産生細胞より単離・精製することがで きる。具体的には、OCIF/OPG物質産生細胞を培� ��し、培養液をヘパリンカラム(ヘパリン-セ� �ァロースCL-6B、ファルマシア社)に供し、2M N aClを含む10mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)で溶出する。 次いで、得られたヘパリン吸着性OCIF/OPG物質� ��分をQ・陰イオン交換カラム(HiLoad-Q/FF、ファ ルマシア社)に供し、その非吸着画分を集め� �。このようして、ヘパリン吸着性によりヘ� �リン親和性のOCIF/OPG物質画分を得ることがで きる。得られたOCIF/OPG物質活性画分をS・陽イ オン交換カラム(HiLoad-S/HP、ファルマシア社)� �ヘパリンカラム(ヘパリン-5PW、トーソー社)� �シバクロンブルーカラム(ブルー-5PW、トーソ ー社)、逆相カラム(BU-300 C4、パーキンエルマ ー社)に供することにより、OCIF/OPG物質を単離 ・精製することができる。
 また、このように製造されるOCIF/OPG物質の� �節軟骨変性改善作用は、例えば、後述する� �施例に記載の方法により測定することがで� �る。
 なお、OCIF/OPG物質中、本発明の医薬の活性� �質としては、好適にはOCIF/OPG又はその修飾体 であり、より好適にはOCIF/OPGである。

<その他の成分>
 前記その他の成分としては、特に制限はな� ��、本発明の効果を損なわない範囲内で目的� ��応じて適宜選択することができる。例えば� ��前記破骨細胞形成抑制因子の関節への注入� ��に、ヒアルロン酸ナトリウムを同時に投与� ��ることができる。また、前記アポトーシス� ��制剤中の前記その他の成分の含有量として� ��、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択� ��ることができる。

<剤型>
 前記アポトーシス抑制剤の医薬としての剤� ��には、特に制限はなく、目的に応じて適宜� ��択することができるが、中でも、前記医薬� ��被検体の関節内に投与されることを特徴と� ��ることから、前記関節内への直接投与が可� ��な、注射剤であることが好ましい。前記注� ��剤としては、例えば、水性注射剤、懸濁性� ��射剤、用時溶解用固形注射剤などが挙げら� ��る。
 前記注射剤は、例えば、前記破骨細胞形成� ��制因子に、pH調節剤、緩衝剤、安定化剤、� �張化剤、局所麻酔剤等の医薬用の添加剤を� �加することにより、製造することができる� �
 前記pH調節剤及び前記緩衝剤としては、例� �ば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム� �リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記� �定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナト� �ウム、EDTA、チオグリコール酸、チオ乳酸な� ��が挙げられる。前記等張化剤としては、例� ��ば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げ� ��れる。前記局所麻酔剤としては、例えば、� ��酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げ� ��れる。

<適用>
 前記医薬は、例えば、変形性関節症におけ� ��関節軟骨の変性の治療又は予防に好適であ� ��。
 ここで、前記「関節軟骨」としては、特に� ��限はなく、全身の関節における軟骨の中か� ��目的に応じて適宜選択することができ、例� ��ば、膝関節、肩関節、股関節、顎関節等の� ��骨などが挙げられる。これらの中でも、前� ��「関節軟骨」としては、膝関節、股関節の� ��骨が好ましい。
 なお、前記関節軟骨の「変性」とは、前記� ��節軟骨が正常でない無い状態を指すものと� ��、その状態としては、特に制限はなく、目� ��に応じて適宜選択することができ、例えば� ��前記関節軟骨の磨耗、分解、破壊、消失、� ��形などが挙げられる。

<投与>
 好ましい投与態様においては、前記医薬は� ��被検体の関節内に直接投与されることによ� ��使用される。中でも、前記被検体としては� ��変形性関節症患者が好適であり、中でも、� ��期から進行期までの変形性膝関節症患者が� ��に好適である。また、前記被検体としては� ��炎症を伴わない変形性関節症患者であるこ� ��が好ましい。前記医薬は、関節内に投与さ� ��ることから、経口投与が困難な被検体への� ��用にも好適である。なお、前記被検体の生� ��種としては、前記医薬の投与対象となり得� ��生物であれば特に制限はなく、目的に応じ� ��適宜選択することができ、例えば、ヒト、� ��ウス、ラット、ウシ、ウマ、イヌ、ブタ、� ��ルなどが挙げられる。好適にはヒト、ウマ� ��又はイヌであり、より好適にはヒトである� ��
 前記医薬の投与方法の好ましい態様は、関� ��内投与である。前記関節内投与の手法とし� ��は、特に制限はなく、公知の手法の中から� ��的に応じて適宜選択することができ、例え� ��、前記注射剤の剤型として製造した前記医� ��を、目的の関節腔内に注射器等を用いて注� ��することにより行うことができる。
 前記医薬の投与量としては、特に制限はな� ��、前記被検体の年齢、体重、所望の効果の� ��度等に応じて適宜選択することができるが� ��例えば、成人への1回の投与あたり、有効成 分である前記破骨細胞形成抑制因子の量とし ては、好適には0.1~8000μg、より好適には1~2000� �g、更に好ましくは3~600μgである。
 前記医薬の投与時期としては、特に制限は� ��く、目的に応じて適宜選択することができ� ��前記関節軟骨の変性に対し、予防的に投与� ��れてもよいし、治療的に投与されてもよい� ��また、前記したように、変形性関節症の発� ��・進行過程は、1)関節軟骨の変性、2)病的肥 大軟骨細胞の出現、3)骨硬化と骨棘の形成、� ��3段階に大きく分類されることが知られてい るが、前記医薬を前記変形性関節症の患者に 適用する場合には、前記医薬は前記変形性関 節症の初期段階、即ち、1)関節軟骨の変性段� ��で投与されることが好ましい。

(方法)
 本発明の方法は、変形性関節症等における� ��節軟骨の変性に際し、関節軟骨のアポトー� ��スを抑制するための方法であり、破骨細胞� ��成抑制因子を投与することを含み、更に必� ��に応じて適宜その他の工程を含む。好まし� ��投与態様は、被検体の関節内への直接投与� ��ある。本方法において、「関節軟骨の変性� ��、「破骨細胞形成抑制因子」、「被検体」� ��「関節内に投与」とは、前記した通りであ� ��。また、「その他の工程」としては、特に� ��限はなく、目的に応じて適宜選択すること� ��でき、例えば、前記破骨細胞形成抑制因子� ��関節内投与のため、前記破骨細胞形成抑制� ��子を含む注射剤を製造する製造工程などが� ��げられる。

[効果]
 前記アポトーシス抑制剤及び方法は、その� ��ましい態様において破骨細胞形成抑制因子� ��関節内に直接投与することを特徴とするた� ��、破骨細胞形成抑制因子を関節内の軟骨細� ��に直接的、かつ効果的に作用させることが� ��き、そのため、関節軟骨のアポトーシスを� ��果的に抑制し、変形性関節症に伴う関節軟� ��の変性を効果的に治療又は予防することが� ��きる。