[0001] 本发明涉及核苷酸类辅酶方法， 尤其涉及一种 β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法。

背景技术

[0002] β-烟酰胺单核苷酸 （ΝΜΝ) 是辅酶 I的合成底物， 在被烟酰胺核苷酸腺苷转移 酶腺苷化后即变成辅酶 I (NAD) 。 在生物体内 NMN的水平和烟酰胺核苷酸腺苷 转移酶 （NAMPT) 的活性直接影响到 NAD的浓度， 同吋 NMN直接参与体内腺 苷转移， 是体内重要的一种合成底物和功能调节物质。 在治疗应用方面， NMN 可以用于抗衰老、 治疗慢性病等， 同吋研究表明 NMN还对胰岛素的分泌起到调 节作用， 对 mRNA表达水平也有影响。 因此， NMN在医药治疗方面有着广泛的 应用前景， 同吋也作为一种反应底物在化工方面有着广泛 的市场前景。

[0003] NMN—般应用离子交换树脂进行纯化， 由于其与多种类似物如 NAD带电荷和 极性极为相近， 分离纯化有很大困难， 无法将其中的类似物杂质完全去除， 所 以离子交换法获得的产品纯度只有 60%左右， 收率只有 40%， 生产效率低下， 不 适合规模化生产。

[0004] 因此， 现有技术还有待于改进和发展。

技术问题

[0005] 鉴于上述现有技术的不足之处， 本发明的目的在于提供一种 β-烟酰胺单核苷酸 的纯化方法， 旨在解决 β-烟酰胺单核苷酸的纯化过程中其他电荷和极 性相近的类 似物难以除尽， 且产品纯度低、 收率低的问题。

问题的解决方案

技术解决方案

[0006] 为了达到上述目的， 本发明采取了以下技术方案：

[0007] 一种 β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法， 其中， 包括以下步骤：

[0008] a、 将经过预处理的 β-烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备先后进行 微滤和纳滤

， 收集浓缩的粗品溶液； [0009] b、 将获得的粗品溶液 pH值调至 3-7， 进样上反相高效液相色谱制备柱， 固定相 为十八烷基硅烷键合硅胶， 流动相 A为盐酸溶液配成的 pH3-7的溶液， 流动相 B为 乙醇， 进行梯度洗脱纯化， 得到纯化的样品溶液；

[0010] c、 将纯化的样品溶液用膜浓缩设备进行纳滤后， 用真空冷冻干燥机冻干， 获 得纯化的 β-烟酰胺单核苷酸。

[0011] 所述的 β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法， 其中 ， 所述步骤 a中用于微滤的微滤膜 孔径为 0.2-1 μηι。

[0012] 所述的 β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法， 其中， 所述步骤 a中用于纳滤的纳滤膜

， 其截留分子量为 200。

[0013] 所述的 β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法， 其中， 所述步骤 a中用于纳滤的纳滤膜 为中空纤维膜。

[0014] 所述的 β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法， 其中， 所述步骤 a中浓缩的粗品溶液的 浓度为 20-30g/L。

[0015] 所述的 β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法， 其中， 所述步骤 c中纯化的样品溶液用 膜浓缩设备进行纳滤后的浓度为 100~150g/L。

[0016] 所述的 β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法， 其中， 所述步骤 b中按体积比计， 流动 相 Α: 流动相 Β为 2: 98-1： 1之间。

[0017] 所述的 β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法， 其中， 所述步骤 c中用于纳滤的纳滤膜 为截留分子量为 200的中空纤维膜。

[0018] 所述的 β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法， 其中， 所述步骤 b中， 梯度洗脱吋的洗 脱吋间为 40min。

发明的有益效果

有益效果

[0019] 本发明应用十八烷基硅烷键合硅胶进行高效液 相制备， 对 β-烟酰胺单核苷酸进 行纯化， 使 β-烟酰胺单核苷酸的纯度可以达到 98%， 收率可以到达 80%以上， 生 产效率也比其他工艺提高了 2倍以上。 有效解决了 β-烟酰胺单核苷酸的纯化过程 中其他电荷和极性相近的类似物难以除尽的问 题。

实施该发明的最佳实施例 本发明的最佳实施方式

[0020] 本发明一种 β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法的较佳实施例， 其包括以下步骤：

[0021] S100、 将经过预处理的 β-烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备先后进行 微滤和纳 滤， 收集浓缩的粗品溶液；

[0022] S200、 将获得的粗品溶液 pH值调至 3-7， 进样上反相高效液相色谱制备柱， 固 定相为十八烷基硅烷键合硅胶， 流动相 A为盐酸溶液配成的 pH3-7的溶液， 流动 相 B为乙醇， 进行梯度洗脱纯化， 得到纯化的样品溶液；

[0023] S300、 将纯化的样品溶液用膜浓缩设备进行纳滤后， 用真空冷冻干燥机冻干， 获得纯化的 β-烟酰胺单核苷酸。

[0024] 本发明是采用反相高效液相色谱法对辅酶 I的合成底物 β-烟酰胺单核苷酸进行纯 化， 通过以固定相为十八烷基硅烷键合硅胶， 流动相为盐酸配制而成的溶液和 乙醇的色谱柱进行纯化， 再进一步浓缩及冻干， 获得纯化的 β-烟酰胺单核苷酸。 本发明所述的 β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法操作简单， 且能有效除去其他带电荷 和极性及其相似的类似物， 使所制备出的 β-烟酰胺单核苷酸纯度高、 收率大、 产 量大， 适用于大规模工业化生产。

[0025] 优选地， 所述步骤 S100中用于微滤的微滤膜孔径为 0.2-1μηι。 具体而言， 本发 明步骤 S100中用于微滤的微滤膜孔径为 0.5μηι。

[0026] 微滤的基本原理是筛分过程， 在静压差作用下滤除大于 ΙΟμηι的微粒， 操作压 力为 0.7-7bar,原料液在压差作用下， 其中溶剂透过膜上的微孔流到膜的低压侧， 大于膜孔的微粒被截留， 从而实现原料液中的微粒与溶剂的分离。 微滤过程对 微粒的截留机理是筛分作用， 决定膜的分离效果是膜的物理结构、 孔的形状和 大小。

[0027] 本发明实施例中微滤吋采用的微滤膜孔径为 0.5μηι， 能初步清除 β-烟酰胺单核 苷酸粗品溶液中较大的微生物及大颗粒分子， 微滤膜允许大分子和溶解性固体

(无机盐） 等通过， 但会截留住悬浮物、 细菌及大分子量胶体等物质， 对 β-烟酰 胺单核苷酸粗品溶液进行初步纯化。 微滤膜的孔径过大， 会使较大微生物和大 颗粒分子透过微滤膜， 影响初步过滤的效果； 孔径过小， 会导致 β-烟酰胺单核苷 酸也无法透过微滤膜， 造成产品的损失。 [0028] 另外， 本发明所述步骤 S100中用于纳滤的纳滤膜， 其截留分子量为 200。 进一 步地， 本发明较佳实施例中采用的纳滤膜孔径为 1.5nm， 能够截留分子量为 200 的物质。

[0029] 更优选地， 所述步骤 S100中用于纳滤的纳滤膜为中空纤维膜。

[0030] 纳滤是一种允许溶剂分子或某些低分子量溶质 或低价离子透过的过滤方法， 其 特点在于能在很低的压力下具有较高的除盐性 能和截留分子量为数百的物质。 本发明采用孔径为 1.5nm的滤膜， 其截留分子量为 200， 可以将分子量大于 200的 物质过滤出来， 初步过滤掉 β-烟酰胺单核苷酸中的杂质。 并且， 将中空纤维膜作 为纳滤膜， 中空纤维膜外表为纤维状， 其具有自支撑作用， 可以有效清除 β-烟酰 胺单核苷酸制备工艺中所产生的磷酸根残留和 其他小分子杂质， 使 β-烟酰胺单核 苷酸得到进一步纯化。

[0031] 经过微滤和纳滤后， 收集浓缩的粗品溶液， 其浓度为 20-30g/L。

[0032] 本发明较佳实施例中， 所述步骤 S200中磷酸溶液或盐酸溶液的质量浓度为 2%~

5% , 乙醇溶液的质量浓度为 S^ SOy^

[0033] 更优选地， 所述步骤 S200中磷酸溶液或盐酸溶液的体积用量为每毫� �样品溶液 加 5~20毫升磷酸溶液或盐酸溶液， 乙醇溶液的体积用量为每升流动相加 100~400 毫升乙醇溶液。

[0034] 具体而言， 磷酸溶液或盐酸溶液的质量浓度过高， 会导致在梯度洗脱吋洗出， 若质量浓度过低， 会影响物质的分离纯化效果， 本发明中采用质量浓度为 2%~5 %的磷酸溶液或盐酸溶液， 可以保证其在梯度洗脱吋不被析出的情况下达 到高度 纯化 β-烟酰胺单核苷酸的效果。

[0035] 另外， 改变酸的用量会影响峰形， 从而影响到检测效果。 本发明实施例中采用 体积用量为每毫升样品溶液加 5~20毫升的磷酸溶液或盐酸溶液， 体积用量为每 升流动相加 100~400毫升的乙醇溶液， 可以使峰形对称， 减少拖尾现象。

[0036] 本发明较佳实施例中， 所述步骤 S200用磷酸溶液或盐酸溶液将上一步骤所初步 纯化的 β-烟酰胺单核苷酸粗品溶液的 ρΗ值调至 3-7， 进样上反相高效液相色谱制 备柱， 其流动相 Α为盐酸溶液配成的 ρΗ3-7的溶液， 流动相 Β为乙醇。

[0037] 具体而言， 反相高效液相色谱法中一般用非极性固定相 （如 C18、 C8) ； 而其 流动相常为水或缓冲液， 常加入甲醇、 乙醇、 异丙醇、 丙酮、 四氢呋喃等与水 互溶的有机溶剂以调节保留吋间， 其适用于分离非极性和极性较弱的化合物， 并且 pH会影响样品存在的状态， 因而影响样品的保留吋间。 本发明实施例中采 用盐酸配成的 PH3-7的溶液和乙醇作为流动相， 可以有效调节样品的保留吋间， 使样品从进入色谱柱到流出色谱柱的吋间达到 最优化， 能使样品的分离效果良 好。 样品的保留吋间过长， 会使检测的灵敏度降低； 样品的保留吋间过短， 会 使 β-烟酰胺单核苷酸与杂质的分离效果降低， 影响 β-烟酰胺单核苷酸的纯化。

[0038] 流动相的 pH值应该控制在 2-8之间， pH值大于 8吋， 可使载体硅胶即固定相溶 解， pH小于 2吋， 与硅胶化学键合相易水解脱落。 本发明实施例中， pH值为 3-7 ， 此吋 β-烟酰胺单核苷酸能稳定存在， 其内部结构不会被破坏， 在此条件下， 可 以使样品的分离效果达到最优化。 更优选地， 本发明中的流动相的 pH值为 5， 此 吋样品的纯化效果最佳。

[0039] 本发明所述步骤 S200中采用磷酸溶液或盐酸溶液将获得的粗品� �液 pH值调至 3- 7， 是因为 β-烟酰胺单核苷酸粗品溶液中也含有磷酸根残 留， 且是采用盐酸配制 成的溶液作为流动相 Α， 本发明中采用磷酸溶液或盐酸溶液来调节粗品 溶液的 pH 值， 不会引进新的杂质， 并且可以在纯化过程中除去磷酸根等物质。

[0040] 优选地， 本发明实施例中步骤 S200中， 其流动相 Α相与流动相 Β相的体积比为 2 ： 98-1： 1之间。

[0041] 流动相的比例会对样品的检测效果和纯化效果 造成影响。 若提高盐酸溶液的用 量， 降低乙醇的用量， 则样品保留吋间会增长， 可以得到很好的分离， 但所测 的样品的峰变宽， 峰高降低， 影响检测的灵敏度； 而降低盐酸溶液的用量， 提 高乙醇的用量， 则样品的检测灵敏度较高， 但样品的分离效果不佳。 通过结合 本发明的样品性质和纯化条件， 选择按体积比计为 2: 98-1： 1之间的盐酸配制成 pH为 3-7的溶液与乙醇， 可以使样品在分离纯化效果良好的同吋提高样 品检测的 灵敏度。

[0042] 另外， 本发明较佳实施例中， 梯度洗脱吋的洗脱吋间为 40min。 具体可进行 2%

B〜12%B梯度洗脱纯化。

[0043] 采用梯度洗脱法比等度洗脱法能使出峰效果更 加对称无拖尾， 且能提高柱效， 改善检测的灵敏度。 另外将洗脱吋间控制为 40min可以使样品的保留吋间合适， β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化效果最佳。

[0044] 本发明首次采用反相高效液相色谱法对辅酶 I的合成底物 β-烟酰胺单核苷酸进行 纯化， 克服了传统的离子交换树脂法的纯化效率低， 无法分离与 β-烟酰胺单核苷 酸极性等性质相近的类似物， 且收率低的问题。

本发明的实施方式

[0045] 下列通过具体实施例对本发明进一步阐释：

[0046] 本发明包括以下规格色谱柱 （柱子直径 *长度） ： 5 cm*30cm、 15 cm*30

cm、 30 cm*30cm。

[0047] 柱温为室温。

[0048] 实施例一：

[0049] 1.粗品浓缩：

[0050] 将经过预处理的 β-烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备先后进行 微滤和纳滤， 微 滤除掉微生物， 纳滤采用截留分子量 200的中空纤维膜将粗品浓缩至 20-30g/L。

[0051] 2.纯化：

[0052] 纯化条件：

[0053] 色谱柱： 柱子直径和长度为 5 cm*30cm；

[0054] 固定相： 十八烷基硅烷键合硅胶；

[0055] 流动相： A相： pH为 3的盐酸溶液； B相： 乙醇；

[0056] 流速： 50-80 ml/min;

[0057] 检测波长： 260 nm;

[0058] 梯度： B<¾: 2<¾〜12<¾ (40 min) ；

[0059] 上样量为 8-10g。

[0060] 纯化过程： 将浓缩后的粗品溶液用磷酸溶液或盐酸溶液调 pH至 3-7， 将色谱柱 用 30%以上的乙醇冲洗干净后平衡上样， 上样量为 8-10g， 线性梯度洗脱 40min， 收集目的峰。

[0061] 3.浓缩及冻干： [0062] 将纯化后的样品溶液用膜浓缩设备 （截留分子量 200的中空纤维膜） 纳滤浓缩 至 100-150g/L， 然后用真空冷冻干燥机冻干， 得到纯度大于 98%的 β-烟酰胺单核 苷酸， 总收率可以达到 81.3%。

[0063] 实施例二：

[0064] 1.粗品浓缩：

[0065] 将经过预处理的 β-烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备进行微滤 和纳滤， 微滤除 掉微生物， 纳滤采用截留分子量 200的中空纤维膜将粗品浓缩至 20-30g/L。

[0066] 2.纯化：

[0067] 纯化条件：

[0068] 色谱柱： 柱子直径和长度为 15 cm*30cm;

[0069] 固定相： 十八烷基硅烷键合硅胶；

[0070] 流动相： A相： pH为 5的盐酸溶液； B相： 乙醇；

[0071] 流速： 400-500 ml/min;

[0072] 检测波长： 260nm;

[0073] 梯度： B<¾: 2<¾〜12<¾ (40 min) ；

[0074] 上样量为 60-80g。

[0075] 纯化过程： 将浓缩后的粗品溶液用磷酸溶液或盐酸溶液调 pH至 3-7， 将色谱柱 用 30%以上的乙醇冲洗干净后平衡上样， 上样量为 60-80g， 线性梯度洗脱 40min ， 收集目的峰。

[0076] 3.浓缩及冻干：

[0077] 将纯化后的样品溶液用膜浓缩设备 （截留分子量 200的中空纤维膜） 纳滤浓缩 至 100-150g/L， 然后用真空冷冻干燥机冻干， 得到纯度大于 98%的 β-烟酰胺单核 苷酸， 总收率可以达到 82.3%。

[0078] 实施例三：

[0079] 1.粗品浓缩：

[0080] 将经过预处理的 β-烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备进行微滤 和纳滤， 微滤除 掉微生物， 纳滤采用截留分子量 200的中空纤维膜将粗品浓缩至 20-30g/L。

[0081] 2.纯化： [0082] 纯化条件：

[0083] 色谱柱： 柱子直径和长度为 30 cm*30cm;

[0084] 固定相： 十八烷基硅烷键合硅胶；

[0085] 流动相： A相： pH为 7的盐酸溶液； B相： 乙醇；

[0086] 流速： 2500-3000 ml/min;

[0087] 检测波长： 260 nm;

[0088] 梯度： B<¾: 2<¾〜12<¾ (40 min) ；

[0089] 上样量为 350-400g。

[0090] 纯化过程： 将浓缩后的粗品溶液用磷酸溶液或盐酸溶液调 pH至 3-7， 将色谱柱 用 30%以上的乙醇冲洗干净后平衡上样， 上样量为 350-400g。 线性梯度洗脱 40mi n， 收集目的峰。

[0091] 3.浓缩及冻干：

[0092] 将纯化后的样品溶液用膜浓缩设备 （截留分子量 200的中空纤维膜） 纳滤浓缩 至 100-150g/L， 然后用真空冷冻干燥机冻干， 得到纯度大于 98%的 β-烟酰胺单核 苷酸， 总收率可以达到 80.9%。

[0093] 本发明中通过收集样品的目的峰， 当其达到标准吋， 则将其用膜浓缩设备进行 纳滤， 再用真空冷冻干燥机冻干， 获得纯化的 β-烟酰胺单核苷酸。 由本发明所述 方法制备的冻干产品 β-烟酰胺单核苷酸， 其纯度可达 98%， 总收率可达 80%以上 ， 另外由于本发明操作简单， 其生产效率也比其它工艺提高了 2倍以上， 有效解 决了现有技术中磷酸根残留不易解决和制备出 的产品纯度低、 收率低的问题。 本发明具有良好的市场前景， 适用于工业化生产纯化的 β-烟酰胺单核苷酸。

[0094] 应当理解的是， 本发明的应用不限于上述的举例， 对本领域普通技术人员来说 ， 可以根据上述说明加以改进或变换， 所有这些改进和变换都应属于本发明所 附权利要求的保护范围。