Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se à seleção, caracterização e síntese de peptídeos recombinantes que mimetizam proteínas antigênicas de Mycobacteríum tuberculosís ligantes a IgA de fluidos corporais, por exemplo da saliva, de indivíduos com tuberculose, aptâmeros e anticorpo recombinante ou fragmento deste, ligantes a proteínas de M. tuberculosís. Os peptídeos recombinantes (TBC10 e TB2C10) sintetizados quimicamente com base na sequencia de doze aminoácidos fusionados ao fago CIO, selecionado de uma biblioteca comercial PhD-12 por phage display, demonstraram ser aplicáveis em métodos de diagnostico ou plataformas diagnósticas para tuberculose. Aptâmeros de DNA (Ll, L2, L3 e L4) e o anticorpo recombinante monoclonal ou fragmento deste 4B ligantes de TBC10 e TB2C10 selecionados, respectivamente, por SELEX e phage display também demonstraram ser aplicáveis em métodos diagnósticos ou plataformas para diagnosticar a tuberculose através de amostras biológicas de um indivíduo, como por exemplo de flúidos corporais de pacientes com tuberculose. Fundamentos da Invenção

[002] A tuberculose (TB) é uma doença contagiosa, causada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis, que afeta tipicamente os pulmões, mas pode também afetar outros órgãos e sítios. A forma mais comum de infecção do M. tuberculosis se dá por via aerógena, pela inalação de gotículas contendo a bactéria, quando o doente com TB de pulmão (em fase bacilífera) espirra ou tosse (FLYNN e CHAN, 2001).

[003] O M. tuberculosis é um bacilo intracelular que tem capacidade de escapar da resposta imunológica de seu hospedeiro, e permanecer em latência no interior de macrófagos por períodos prolongados, caracterizando assim a infecção latente (LTBI). Esta condição pode ser alterada por um estresse imunológico, capaz de reativar a infecção originando a doença ativa, fase em que o doente libera o bacilo através de perdigotos quando espirra ou tosse transmitindo a outros indivíduos (FLYNN e CHAN, 2001). Indivíduos com LTBI não transmitem a doença, contudo controlar esta infecção e impedir o desenvolvimento da doença ativa são medidas válidas e promissoras para redução da incidência .

[004] A variedade de manifestações clínicas é decorrente dos diversos mecanismos de escape e fatores de virulência da bactéria, além da heterogeneidade da resposta imunológica dos indivíduos. A forma como a infecção se estabelece e a reativação da doença pode ser definida pela ação de proteínas secretadas pelo M. tuberculosis que interferem na regulação da resposta imune do hospedeiro, assim como um conjunto de fatores como ambiente, hospedeiro, patógeno, coinfecção por HIV, má nutrição e outras imunodeficiências (O'GARRA et al., 2013; GOLDBERG et al., 2014; BEHAR et al. 2010.

[005] O grau de comprometimento do órgão afetado e magnitude das manifestações clinicas, e principalmente das formas subclinicas, associadas às limitações diagnósticas são fatores cruciais para a assertividade do tratamento e contenção da doença (PAI et al., 2016; CADENA et al., 2017). [006] A principal caracteristica da TB em humanos é a formação do granuloma, importante para contenção da bactéria e onde a bactéria consegue sobreviver por longos períodos e proliferar. A resposta imunológica ao M. tuberculosis depende de como será organizada e de sua manutenção para contenção e eliminação do bacilo e envolve células fagocíticas e subpopulações de linfócitos T e é mediada por citocinas e quimiocinas(O'GARRA et al., 2013; PORCELLI et al., 2014; PIETERS, 2008).

[007] A capacidade do bacilo de sobreviver no interior de macrófagos do hospedeiro se dá pela interação de proteínas secretadas ou presentes na parede celular da micobactéria com a célula fagocítica. A secreção de proteínas pelo M. tuberculosis garante sua evasão da ação deletéria das células de defesa. Proteínas como, lipoproteínas, lipoarabinomanana

(LAM), cultura filtrada de protína - lOkDa (culture filtrate protein-10 kDa - CFP-10), alvo antigênico precocemente secretado-6 kDa (early secreted antigenic target-6kDa ESAT-6), proteína imunogênica MPT64, Ag85A, B e C, e as hsp60, são capazes de impedir a fusão do fago-lisossomo, inativar caminhos autofágicos intracelulares e inibir vias de reconhecimento, limitando as respostas imunes inatas e o desenvolvimento da resposta imune adaptativa (ROSEMBERG, 2001; PAI et al., 2016; GRÕSCHEL et al., 2016) 9-11.

[008] As proteínas de choque térmico (hsp - Heat Shock

Proteins) são uma classe de proteínas com expressão aumentada em decorrência de estresse térmico ou químico, e são agrupadas em famílias de acordo com suas sequências de aminoácidos (a.a) e pesos moleculares (CASTRO et al., 2013). Hickey e colaboradores (2009) observaram que uma proteína recombinante de hsp65, tinha habilidade para inibir a associação do bacilo com macrófago, demonstrando a funcionalidade de adesina da chaperonina 60.2 em relação à interação com macrófagos. Essas e outras proteínas, como ESAT-6, CFP-10, MPT64, Ag85, com papel importante na virulência bacteriana, são potenciais biomarcadores para o diagnóstico de TB (GOLDBERG et al., 2014; XU, 2007; RENSHAW et al., 2005; GAO et al., 2005).

[009] Segundo dados publicados pela Organização Mundial de Saúde OMS (WHO em inglês) no Relatório Global de

Tuberculose - 2019, estima-se que 10 milhões de pessoas adoeceram em 2018, um número que tem sido relativamente estável nos últimos anos mas que continua impactando as pessoas. O ónus da doença varia enormemente entre os países, variando de menos de 5 casos a mais de 500 novos casos por 100 mil habitantes por ano, com média global em torno de 130 novos casos por 100 mil habitantes por ano. Estima-se ainda que cerca 1.2 milhões de pessoas, HIV negativas, e cerca de 251 mil pessoas HIV positivas, morreram de tuberculose em 2018.

[010] Apesar dos aumentos nas notificações de TB observadas pela OMS, ainda existe uma grande lacuna entre o número de novos casos relatados, cerca de 7 milhões, e o que é estimado, cerca de 10 milhões de casos em 2018 (WHO, 2019). Essa diferença se deve a combinação de subnotificação de casos detectados e subdiagnóstico. As pessoas com TB não acessam assistência médica ou não são diagnosticadas quando o fazem.

[011] À medida que se intensificam os esforços para melhorar o diagnóstico e o tratamento da TB e fechar as brechas entre incidência e notificações, a proporção de casos notificados confirmados bacteriologicamente precisa ser monitorada, para garantir que as pessoas sejam corretamente diagnosticadas e iniciem, o mais cedo possível, o regime de tratamento mais eficaz. O objetivo deve ser aumentar a porcentagem de casos confirmados bacteriologicamente, aumentando o uso dos diagnósticos recomendados (por exemplo, testes moleculares rápidos) que são mais sensíveis que a microscopia de esfregaço (WHO, 2019).

[012] Além de um problema de saúde pública, a facilidade de propagação e dificuldade de contenção das vias de transmissão faz com que a TB seja um grave problema social, relacionada às más condições económicas, de moradias e nutrição deficiente, e fatores relacionados ao sistema imunológico, o que torna as populações vulneráveis mais susceptíveis a desenvolver a doença (BRASIL - MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011).

[013] A TB é curável desde que o tratamento seja realizado, com associação apropriada de drogas antituberculose, dose e tempo de tratamento adequado (WHO, 2019). O diagnóstico precoce é indispensável para contenção e controle da doença.

[014] Os achados bacteriológicos e radiológicos são os principais métodos de diagnósticos, e em algumas regiões também são usados testes imunoenzimáticos. Contudo, os métodos diagnósticos utilizados são limitados, por não agregarem, em um único teste, especificidade, sensibilidade e agilidade, que são essenciais para o início efetivo do tratamento e contenção da propagação do bacilo (BENTO et al., 2011).

[015] A radiografia por raios-X requer equipamento especializado, porém é útil como método auxiliar em infecções paucibacilares e exclusão de outras patologias que exigem tratamento concomitante (FERRI et al., 2014). A bacterioscopia, pesquisa de bacilos álcool-ácido resistente - coloração de Ziehl Neelsen, é o método mais utilizado para diagnóstico de casos novos e também monitoramento da redução da carga bacilar durante o tratamento, é barato, tem ótima especificidade, porém é pouco sensível, observador dependente e limitado pela representatividade e qualidade da amostra clínica. A cultura do bacilo, considerada padrão- ouro, é altamente específica, indicada para a confirmação dos casos novos e monitoramento do tratamento, permite determinar suscetibilidade à drogas, contudo demanda tempo, é semi-quantitativa, e também requer infra-estrutura adequada e especializada (CHEE et al., 2013). O teste da tuberculina, também conhecido como PPD (Proteína Purificada Derivada) feito a partir da aplicação intradérmica de proteína purificada derivada Rt23, é útil para provar a infecção, mas não necessariamente a doença, a positividade indica somente a exposição prévia ao antígeno, mas não implica em infecção ativa. A detecção de ácidos nucléicos, mais recentemente GeneXpert MTB/RIF é altamente específico e sensível, porém, além do alto custo, não pode diferenciar doença ativa de infecção tratada, não é capaz de detectar micobacterioses atípicas e não é aplicável ao diagnóstico de recidivas nem ao monitoramento do tratamento. Quanto à sorologia, é o método mais prático, mas os antigenos atuais não permitem distinguir a tuberculose ativa da infecção latente, não sendo aplicáveis a áreas endémicas (CAILLEAUX- CEZAR, 2012). O exame bioquímico ADA - Adenosina Deaminase - é aplicável para o diagnóstico de tuberculose pleural, mas de baixa acurácia a infecções micobacterianas de outros sítios. Os testes diagnósticos atualmente utilizados deixam a desejar, o que dificulta o rastreamento do doente e o monitoramento da evolução clínica (BRASIL - MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2011; GOLETTI et al., 2016; WHO, 2006; GUTLAPALLI et al., 2016).

[016] O desafio é o desenvolvimento de um método diagnóstico para a tuberculose ativa de baixo custo efetivo e fácil utilização em campo (point-of-care) e que viabilize mais agilidade no diagnóstico e início de tratamento, que apresente boa sensibilidade e especificidade, acurácia, e que permita melhor atender a população mais vulnerável, classes menos favorecidas e países ou regiões com menos recursos.

[017] Apesar de predominantemente utilizado em testes diagnósticos, a representatividade do escarro como espécime clinico é diretamente influenciada por fatores diversos como, horário e qualidade da coleta, expectoração e outros fatores relacionados à condição física do doente, e coopera para a baixa sensibilidade do exame bacterioscópico. Embora o soro seja uma amostra clínica com boa representatividade do estado do organismo, e utilizada amplamente em diversos diagnósticos, não oferece possibilidades satisfatórias para o diagnóstico de TB em virtude da heterogeneidade da infecção (POTTUMARTHY et ai., 2000). O fluido salivar apresenta excelente potencial diagnóstico por conter numerosas proteínas, fragmentos proteicos e anticorpos, que conferem a este fluido importante valor analítico (TABAK, 2001; LAWRENCE 2002; STRECKFUS e BIGLER, 2002; RIBEIRO et ai., 2010; LARREA et al., 2006). Cerca de 85% dos anticorpos presentes na saliva são imunoglobulinas A (IgA) que geralmente desempenham papel protetor, se ligando às bactérias bloqueando estruturas de ligação inibindo a aderência das mesmas (VAN NIEUW AMERONGEN, 2004). A saliva, portanto, é uma alternativa amostrai promissora tanto para o diagnóstico de doenças infecciosas quanto para o monitoramento da evolução do tratamento por sua produção contínua, evidenciando mais precisamente o estado atual do organismo e agrega a vantagem de coleta indolor e não invasiva.

[018] Os produtos celulares e metabólitos de

Mycobacterium tuberculosis podem ser detectados diretamente no sangue, saliva, urina e outros espécimes clínicos. Alguns destes componentes celulares têm sido propostos como biomarcadores para diagnóstico de TB, tais como fragmentos de DNA, proteínas da parede celular, lipoarabinomanan (LAM), complexos proteicos secretados (CFP-10/ESAT-6) e antígenos Ag85, MPT64, hsp60 e outros (BORGSTRÕM et al., 2011; FLINT et al., 2004; CHATTERJEE et al., 2011; WIKER e HARBOE, 1992; SINGH et al., 2005).

[019] Uma técnica que pode ser utilizada para desenvolver novas moléculas com potencial é o Phage display. Essa é uma técnica eficiente para identificar peptídeos ou proteínas que se ligam a outras moléculas com diversas finalidades, como mapeamento de epítopos reconhecidos por anticorpos. A tecnologia é baseada no princípio de que polipeptídeos podem ser expressos na superfície de bacteriófagos filamentosos pela inserção de um segmento de DNA codificante no genoma dos mesmos, de modo que o peptídeo ou proteína expressado fique exposto na superfície da partícula virai fusionado a uma proteína virai naturalmente expressa no bacteriófago (SMITH, 1985).

[020] A possibilidade de expressão de uma proteína de fusão no capsídeo de bacteriófagos, de maneira acessível ao reconhecimento por um ligante, demonstrada em 1985 por Smith, abriu caminho para a construção de bibliotecas conformacionais apresentadas na superfície destas partículas virais (SMITH, 1985).

[021] A seleção de sequências baseada na afinidade de ligação do fago a uma molécula alvo é feita por um processo de seleção in vitro denominado bíopanníng. O biopanning consiste na incubação da biblioteca de peptideos expostos em fagos contra o alvo. Os fagos não ligantes ou menos específicos são eliminados por lavagens sucessivas e os fagos específicos permanecem ligados para posterior eluição. O pool de fagos específicos é amplificado para os ciclos posteriores de seleção. Após três ou quatro ciclos de seleção os clones individuais são caracterizados por sequenciamento de DNA, Western Blotting ou ELISA (SMITH, 1985).

[022] Bibliotecas de peptideos geradas por phage display são extensivamente aplicadas na descoberta de uma grande variedade de polipeptídeos incluindo anticorpos, receptores e enzimas (ARAP, 2005) . Epítopos ou determinantes antigênicos, regiões de reconhecimento do antígeno pelos anticorpos, podem também ser identificados através desta metodologia de apresentação de peptideos em fagos, a qual tem sido extremamente importante para a identificação e caracterização de novos ligantes de alta afinidade e seus receptores de uma infinidade de doenças, incluindo câncer, doenças infecciosas, cardiovasculares e autoimunes

(STERNBERG e HOESS, 1995; MULLEN et al., 2006).

[023] Esta técnica também permite a seleção de fragmentos de anticorpos expressos na superfície de bacteriófagos . Fragmentos de cadeia única das regiões variáveis de anticorpos (single-chain variable fragment, scFv) representa o menor domínio funcional de cadeias leve e pesada (VL e VH) de um anticorpo necessário à ligação específica ao seu antígeno. A expressão desses fragmentos é realizada na forma de fragmentos recombinantes de anticorpos, através da fusão das regiões codificadoras da porção variável do anticorpo (Fv) ao gene III do fago M13, sendo capaz de codificar e expressar o scFv na proteína PIII do fago (HOOGENBOOM, 2005). Os anticorpos recombinantes selecionados podem ser expressos em larga escala e serem utilizados em ensaios químicos, fisiológicos e imunológicos. [024] Outra técnica que pode ser utilizada é a SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment). Essa é uma técnica in vitro desenvolvida e descrita a partir da década de 1990 (ELINGTON e SZOSTAK, 1998; TUERK e GOLD, 1990; AQUINO-JARQUIN e TOSCANO-GARIBAY, 2011) para seleção de pequenas moléculas sintéticas de ácidos nucleicos (RNA e DNA de cadeia simples - ssDNA) por PCR.

[025] As moléculas selecionadas por esta técnica são denominadas aptâmeros. Esta técnica é usada como ferramenta biotecnológica com objetivos específicos nas pesquisas com aplicações diagnósticas e terapêuticas. Os aptâmeros são capazes de se ligar a pequenas moléculas, como receptores de moléculas alvo, para detecção de fármacos, metabólitos e toxinas em fluidos corporais, sinalização celular, usados como sondas em marcações celulares para exames de imagens, ou carreadores de nanoparticulas terapêuticas e procedimentos biomoleculares de laboratório (ACQUAH et al., 2015; DARMOSTUK et al., 2014; RADOM et al., 2013). O arranjo molecular dos aptâmeros é resultado de um processo termodinamicamente favorável e confere estabilidade à estrutura secundária e à conformação. São ligantes altamente sensíveis e específicos, com vantagens em relação aos outros ligantes como produção química mais rápida e fácil, menos propensa a contaminação virai ou bacteriana, estocáveis e não imunogênicos (ESPOSITO et al., 2015; SHANNON PENDERGRAST et al., 2005; GOPINATH et al.,2006; AMAYA-GONZÁLEZ et al., 2013; ZHU et al., 2014).

[026] Desta forma, existe uma necessidade de desenvolver novos métodos de diagnóstico molecular de TB ativa que sejam mais eficientes, rápidos e de melhor custo-benefício. Uma das formas é o de desenvolver novos biomarcadores mais baratos, estáveis e de alta sensibilidade para detecção de proteínas alvo em fluídos corporais como a saliva, salgue, amostras de fluído cervical, urina, dentre outros. Em uma das modalidades aqui descritas, propomos novas moléculas biomarcadores que foram sintetizadas para uso em um método de diagnóstico molecular do TB baseado em ensaios imunológicos ou utilizando plataformas de diagnóstico para na detecção de anticorpos IgA a partir de amostras de fluido corporal, particularmente, em amostras de saliva.

Breve descrição da invenção

[027] O presente pedido de patente descreve dois novos peptideos sintéticos. O primeiro peptideo o TBC10 (com 24 aminoácidos - SEQ ID No: 01), sintetizado a partir de uma sequencia de 12 aminoácidos fusionado a um fago, CIO, obtida previamente por phage display contra IgA de saliva de indivíduos com tuberculose. A síntese peptídica foi projetada com base no motivo proteico, acrescentando um espaçador proteico e parte da proteína PIII do fago, com amidação na região C-terminal e acoplado a BSA na região N- terminal. O segundo peptideo TB2C10 (com 32 aminoácidos - SEQ ID No: 02) sintetizado a partir da duplicação do motivo proteico dos 12 aminoácidos, separados por dois espaçadores, e a inclusão de um espaçador após a segunda sequencia com amidação na região C-terminal e acoplado a BSA na região N- terminal. Os peptideos TBC10 e TB2C10 foram capazes de detectar IgA específica de M. tuberculosis em amostras de fluído corporal. Mostrando uma sensibilidade em ensaios imunológicos de 94,12% e especificidade superior a 76%, e são aplicáveis, por exemplo, na utilização em biossensores para detecção de IgA de TB em amostras de fluído corporal, mais particularmente em amostras de saliva. [028] Em outra modalidade do presente pedido de patente se descreve um fragmento de anticorpo recombinante do tipo scFv compreendendo a sequência SEQ ID No: 03 ou as sequências SEQ IDs No: 04 e 05, 4B, ligante do phago CIO, selecionado por phage display que foi capaz de reconhecer as proteínas de M. tuberculosís em ensaios bem como foi capaz de reconhecer os peptídeos sintéticos TBC10 e TB2C10 aqui descritos.

[029] Em ainda outra modalidade do presente pedido de patente descreve-se o desenvolvimento de quatro aptâmeros (Ll, L2, L3 e L4) os quais compreendem as sequências SEQ ID No: 06, SEQ ID No: 07, SEQ ID No: 08 SEQ ID No: 9, respectivamente, e que também foram capazes de ligar e reconhecer as proteínas de M. tuberculosís bem como ao pepetídeo sintético TBC10 POR SELEX.

[030] Em outra modalidade do presente pedido de patente descreve-se o uso de ao menos um dos peptídeos sintéticos TBC10 e TB2C10, da fração de anticorpo scFv (4B) e dos aptâmeros Ll, L2, L3 e L4, em um método de diagnóstico de Tuberculose, bem como o referido método de diagnóstico em si e um sistema de detação utilizando um bioeletrodo.

Breve descrição das figuras

[031] A presente invenção será melhor compreendida com base na descrição, a seguir, tomada em conjunto com as figuras anexas, nas quais: [032] As FIGURAS la-c descrevem um esquema representativo e um bacteriófago filamentoso. (a) fago filamentoso tipo selvagem ilustrando as proteínas do capsideo virai: pIX, pVII, pVIII, pVI e pIII; (b) peptideo fusionado à pIII do fago; e (c) peptideo fusionado à pVIII do fago.

[033] A FIGURA 2 mostra uma representação sequencial e a estrutura molecular dos peptideos TBC10 e TB2C10.

[034] A FIGURA 3 mostra a correlação da afinidade do Fago CIO (descrito como Linear) com os peptideos TBC10 e TB2C10, frente a IgA de saliva.

[035] A FIGURA 4 mostra a representação do percentual de IgA alvo-específdica em relação à IgA total na saliva de indivíduos, representado entre os grupos fago CIO, Peptideos TBC10 e TB2C10.

[036] A FIGURA 5 mostra uma avaliação em teste imunoenzimático por ELISA entre a reatividade do fago CIO e dos peptideos TBC10 e TB2C10 frente a IgA na saliva de indivíduos.

[037] A Figura 6 mostra a detecção por voltametria de pulso diferencial da ligação IgA em TBC10 e TBC2C10 imobilizados em eletrodo de grafite.

[038] As FIGURAS 7 A, B e C mostram a reatividade dos fragmentos scFv em ensaios imunobiológicos.

[039] As FIGURAS 8 A, B e C mostram o peso molecular, e a estrutura tridimensional dos fragmentos de scFv em contato com mycobacterium tuberculosis, para caracterização molecular.

[040] A Figura 9 mostra as estruturas secundárias dos aptâmenros Ll, L2, L3 e L4.

[041] A Figura 10 demonstra a reatividade dos Aptâmeros Ll, L2, L3 e L4 em ensaio imunoenzimático por elisa .

[042] A Figura 11 mostra um esquema representativo das etapas de sensibilização do eletrodo com rodamina e estabilizados com pulso de luz e adsorção do peptideo no sensor com posterior leitura da amostra de saliva.

[043] A Figura 12 demonstra testes com o eletrodo e qual a melhor concentração do peptideo para o mesmo. Foram testadas 3 concentrações diferentes do peptideo TBC10 (lug/ul, 500ng/ul e 100ng/ul) a fim de determinar qual a melhor concentração a ser utilizada nos testes.

[044] A Figura 13 teve o objetivo de otimizar o tempo do teste. Foram testados outros tipos de adsorção da amostra. Como relatado anteriormente, o eletrodo era modificado e o peptideo adsorvido, posteriormente as amostras de saliva foram diluídas 1:5 em tampão eletrolítico Ferro-ferricianeto de potássio e aplicadas diretamente no sensor, diminuindo uma etapa de adsorção e lavagem, acarretando menor tempo no diagnóstico .

[045] A Figura 14 demonstra a diferenciação entre amostras de saliva negativas para tuberculose e amostras de saliva positivas oriundas de pacientes com tuberculose.

[046] A Figura 15 demonstra a especificidade e sensibilidade do peptídeo TBC10 frente a amostras positivas para Hanseníase (Doença causada pelo mesmo gênero da Tuberculose) e amostras de saliva negativas para Hanseníase e também para a Tuberculose.

[047] As Figuras 16A, 16B e 16C demonstram um espectro médio infravermelho de um pool de amostras de saliva de indivíduos saudáveis (Sal Neg), saliva de indivíduos com tuberculose (Sal Pos), Peptídeo TBC10, associação da Saliva de indivíduo saudável com o referido peptídeo (TBC10+Sal Neg)e associação da Saliva de indivíduo com tuberculose com o referido peptídeo (TBC10+Sal Pos).

As figuras 17A, 17B e 17C demonstram um espectro infravermelho médio de um pool de amostras de saliva de indivíduos saudáveis (Sal Neg), saliva de indivíduos com tuberculose (Sal Pos), Peptídeo TB2C10, associação da Saliva de indivíduo saudável com o referido peptídeo (TB2C10+Sal Neg)e associação da Saliva de indivíduo com tuberculose com o referido peptídeo (TB2C10+Sal Pos).

Objetivo da invenção

[048] O presente pedido de patente teve como objetivo identificar e sintetizar novos peptídeos recombinantes que mimetizam proteínas antigênicas de Mycobacterium tuberculosis ligantes a IgA de indivíduos com tuberculose, aptâmeros e um fragmento de anticorpo recombinante ligantes a proteínas de M. tuberculosis, que tivessem capacidade melhorada de serem usados em um método de diagnóstico do TB.

Descrição detalhada da invenção [049] O presente pedido de patente descreve à seleção, caracterização e síntese de peptídeos recombinantes que mimetizam proteínas antigênicas de Mycobacteríum tuberculosis ligantes a IgA de indivíduos com tuberculose, além de aptâmeros e um fragmento de anticorpo recombinante ligantes a proteínas de M. tuberculosis, bem como um método de diagnóstico de TB e o uso dos referidos peptídeos, do fragmento de anticorpo e aptâmeros no diagnóstico de TB.

Exemplo 1 - Síntese de novos peptídeos [050] Em uma modalidade do presente pedido de patente são descritos dois novos peptídeos sintéticos. Uma seleção prévia por phage display permitiu obtenção e caracterização do fago M13 com peptideo de 12 aminoácidos (CIO), mimético de proteínas de Mycobacteríum tuberculosis, ligante de IgA de saliva de indivíduos com diagnóstico de TB.

[051] A Figura 01 mostra um esquema representativo de um bacteriófago filamentoso em que: a Figura 01 (a) mostra um esquema de um fago filamentoso tipo selvagem ilustrando as proteínas do capsídeo virai: pIX, pVII, pVIII, pVI e pIII; a Figura 01 (b) mostra um esquema de um peptideo fusionado à proteína do capsídeo virai pIII do fago; e a Figura 01 (c) mostra um peptídeo fusionado à proteína do capsídeo virai pVIII do fago.

[052] O primeiro peptídeo, o TBC10 (com 24 aminoácidos

- SEQ ID No: 01 - NH _3- EYNTASIHSYRKGGGSAETVESCL-CONH ₂ ), foi sintetizado a partir da referida sequencia de 12 aminoácidos fusionada ao fago, CIO, obtido previamente por phage display contra IgA de saliva de indivíduos com tuberculose.A síntese peptídica foi projetada com base no motivo proteico, acrescentando um espaçador proteico e parte da proteína PIII do fago, com amidação na região C-terminal e acoplado a BSA na região N-terminal.

[053] O segundo peptídeo, o TB2C10 (com 36 aminoácidos

- SEQ ID No: 02 - NH _3- EYNTASIHSYRKGGGSGGGSEYNTASIHSYRKGGGS- CONH ₂₎ , foi sintetizado a partir da duplicação do motivo proteico dos 12 aminoácidos, separados por dois espaçadores, e a inclusão de um espaçador após a segunda sequencia com amidação na região C-terminal e acoplado a BSA na região N- terminal.

[054] Os motivos proteicos e a estrutura molecular 3D dos novos peptídeos sintetizados TBC10 e TB2C10 estão representados na Figura 02. O peptídeo TBC10 está representado com o motivo proteico de 12 aminoácidos em verde, espaçador e parte da PIII do fago em amarelo. O peptideo TB2C10 está representado com o motivo proteico de 12 aminoácidos em verde, motivo proteico duplicado em verde limão e espaçador em amarelo.

Exemplo 2 - Imunorreatividade

[055] Os novos peptideos TBC10 e TB2C10 foram capazes de detectar IgA especifica de M. tuberculosis em amostras de fluido corporal. O fago CIO e os peptideos TBC10 e TB2C10 apresentaram sensibilidade de 94,12% para discriminar positivos de negativos, e especifidade maior que 76,9%. As curvas ROC apresentaram área maior que 0,9367, com valores de p< 0,001 (Figura 05). A análise de correlação entre os alvos apresentou valor igual a 0,94, indicando que a resposta dos peptideos sintéticos foi similar à do peptideo de origem CIO (Figura 03).

[056] A Figura 04 mostra uma representação do percentual de IgA alvo-especifica em relação à IgA total na saliva de cada indivíduo nos grupos positivos para TB sem tratamento (PNT), positivos para TB em curso de tratamento (PT), controles negativos para TB não reativos ao PPD (NP-) e controles negativos para TB reativos ao PPD (NP+). O percentual de IgA alvo-específica em relação à IgA total foi maior para o grupo positivo no início do tratamento (PNT) em relação aos demais, com discreto aumento pra os indivíduos controles positivos para o teste tuberculínico (NP+).

[057] Para detecção de IgA específica, os peptideos (0,5 pg/poço) e o fago CIO (1010 partículas virais/poço) foram imobilizados com tampão Bicarbonato (0.06 M, pH 9.6) em placas de microtitulação (Nunc Immuno MaxiSorp, Roche Diagnostics) e incubadas a 4°C overnight. As placas foram lavadas com tampão PBS acrescido de 0,05% de Tween (PBST 0,05%), bloqueados com PBS-BSA 5%, tampão PBS acrescido de 5% de BSA, por 1 hora a 37°C. Lavadas com PBST 0,1% e acrescentou-se 50 pL de saliva diluída 1:10 em PBS-BSA 5%, incubou-se a 37°C por 01 hora, (para detecção de IgA total, 50 pL de saliva diluída 1:10 em tampão bicarbonato foram usados para sensibilizar, seguindo o mesmo protocolo de ELISA) lavou-se por 6 vezes com PBST 0,05%. Com a adição de anti-IgA/humana HRP(peroxidase humana), 01 hora a 37°C. Novamente lavadas 6 vezes com PBST 0,05%. A reação foi revelada pela adição de OPD (orthophenylenediamine) diluído em tampão citrato-fosfato (0,1 M, pH 5.0) e 3% de H202. A reação foi interrompida pela adição de 25 pL ácido sulfúrico 2,0 N. A leitura da absorbância foi realizada a 492 nm em leitor de microplacas (Multiskan Go/Thermo Scientific,Finland) .

[058] Os indicativos diagnósticos estão apresentados na Figura 05 que mostra uma avaliação em ELISA da reatividade de CIO, TBC10 e TB2C10 frente a IgA de saliva de indivíduos positivos para Tb no início do tratamento (PNT), de indivíduos positivos para Tb com tratamento em curso (PT), indivíduos sadios PPD+ (NP+) e indivíduos sadios PPD- (NP-). Representação das curvas ROC geradas a partir do

ELISA, com seus respectivos valores de sensibilidade (Se), especificidade (Sp), Odds Ratio (OR), Intervalo de confiança (IC), área da curva ROC (AUC) e valor de p. Como já descrito anteriormente, o fago CIO e os peptideos TBC10 e TB2C10 apresentaram sensibilidade de 94,12% para discriminar amostras positivas para tuberculose de amostras negativas para tuberculose, e especifidade maior que 76,9%. As curvas ROC apresentaram área maior que 0,9367, com valores de p< 0,001. Os resultados mostram que os peptideos TBC10 e TB2C10 podem ser usados em imunoensaios para o diagnóstico de Tuberculose .

Exemplo 3 - Plataforma de diagnóstico - Biossensor

[059] Os peptideos TBC10 e TB2C10, uma vez que demonstraram capacidade de identificar IgA de M. tuberculosís em amostras biológicas, foram então imobilizados em eletrodos de grafite (Ds dropsens Drp-110), a fim de testar uma plataforma de diagnóstico eficiente, fácil e de rápida resposta, mais particularmente uma plataforma de detecção eletroquimica. A Figura 06 mostra a detecção por voltometria de pulso diferencial da ligação de IgA em TBC10 e TB2C10 imobilizados em eletrodos de grafite. Em verde estão os valores da corrente em eletrodo vazio, azul os valores após imobilização do alvo e tratamento com pool de saliva negativa (NP-), vermelho os valores após imobilização do alvo e tratamento com pool de saliva positiva para tuberculose (PNT). A ligação de IgA nos alvos imobilizados aumentou a resistência com consequente queda da corrente, com mínimo deslocamento do potencial (TBC10: 0,07V; TB2C10: 0,03V).A interação do bioeletrodo na presença de IgA negativa e positiva apresentou valores de Aipa de 12,216mA para TBC10 e 9,299mA para TB2C10, o que indica que o sistema discrimina o alvo positivo do alvo negativo. Desta forma, os referidos peptideos também se mostraram eficientes para uso em uma plataforma de diagnóstico usando biosenssores, permitindo então discriminar amostras biológicas positivas para TB (PNT) de amostras biológicas negativas para TB (NP-).

[060] Uma vez que foi demonstrado a capacidade de identificar IgA de M. tuberculosís e com objetivo de confirmar os dados anteriores, nesse ensaio foi utilizado amostras de saliva de pacientes individuais, na diluição 1:5. O eletrodo de grafite foi preparado e sensibilizado com a Rodamina, cuja função é de ampliar o sinal da corrente no sistema e promover a ligação da amostra biológica no grafite do sensor, logo em seguida, foi estabilizado com pulso de luz e posteriormente o peptideo TBC10 foi imobilizado no eletrodo. Com isso demonstramos mais uma vez a capacidade de identificar IgA de M. tuberculosís em amostras salivares, representados pela figura 11 por meio desenho esquemático e pelas figuras 12, 13, 14 e 15, cujos resultados são descritos a seguir.

[061] A figura 12 Demonstra diferentes testes para determinar melhor concentração para o peptideo. Foram testadas 3 concentrações diferentes do peptideo TBC10 (lug/ul, 500ng/ul e 100ng/ul). A maior concentração, sendo de lug/ul foi a que demonstrou melhor reconhecimento pelo sensor, esse fato pode ser observado pela diminuição da corrente de oxidação e redução em voltametria cíclica.

[062] A Figura 13 Relata uma forma mais eficaz de adserver a amostra no eletrodo. As amostras de saliva foram diluídas 5x em tampão eletrolítico Ferro-ferricianeto de potássio e aplicadas diretamente no sensor, diminuindo uma etapa de adsorção e lavagem, acarretando menor tempo no diagnóstico. Pode-se observar que dessa maneira também houve reconhecimento do peptideo e diferenciação entre as amostras positivas e negativas.

[063] E com objetivo de confirmar a eficácia do sensor e do peptideo, a Figura 14 demonstra claramente a diferenciação entre amostras de saliva negativas para tuberculose e amostras de saliva de pacientes com tuberculose. O eletrodo foi modificado anteriormente como descrito, rodamina de 500mg e estabilizado com pulso de luz.

O peptideo TBC10 lug/ul foi adsorvido no eletrodo modificado e em seguida, amostras de saliva na diluição de 1:5 foram também adsorvidas a fim de serem reconhecidas. O reconhecimento desse peptideo com anticorpo especifico, diferente do que pode ser observado em outros tipos de reconhecimento, proporcionou livre passagem de corrente no sistema e com isso as corrente de oxidação e redução permaneceram mais altas. O não reconhecimento do peptideo fez com que proteínas das amostras negativas se ligassem mais fortemente ao sensor, resultando em uma passagem de corrente, principalmente na oxidação, menor.

[064] E mais uma vez, com objetivo de corroborar os achados encotrados nessa técnica, a Figura 15 destaca a sensibilidade e especificidade do peptideo TBC10 frente a amostras positivas para Hanseníase (Doença causada pelo mesmo gênero da Tuberculose) e amostras de saliva negativas para Hanseníase e também para a Tuberculose. No eletrodo modificado como anteriormente descrito, foi adsorvido o peptideo TBC10 lug/ul e em seguida aplicadas amostras de saliva diluídas 1:5, de pacientes com hanseníase e saliva de pacientes negativos tanto para hanseníase quanto para tuberculose. O objetivo do teste foi o de comprovar que, independente do tipo de doença, mesmo para uma patologia causada por uma bactéria do mesmo gênero (M. mycobacteríum), se a amostra não for positiva especificamente para a

Tuberculose, hão há diferenciação no sensor eletroquímico e a doença não pode ser confirmada. Nesse caso as amostras positivas para hanseniase e negativas tanto por hanseniase quanto tuberculose não foram capazes de se diferenciarem pela voltametria cíclica.

[065] As medidas foram realizadas utilizando um potenciostato portátil PalmSens conectado a um computador. Todas as medições foram realizadas à temperatura ambiente (25°C). Elétrodos de carbono Ds dropsens Drp-110 (DropSens, S.L. Oviedo,Espanha) foram utilizados para imobilizar 5 ng do peptídeo em 4 pL de tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, bloqueados com tampão fosfato acrescido de 0,5% de BSA. Após secagem completa, foi adicionado 4 pL de pool saliva diluída entre 1:10 a 1:5 em tampão fosfato, após um minuto de reação a superfície foi lavada por três vezes com água ultrapura. Após a secagem. A leitura foi realizada utilizando solução de ferro/ferricianeto de potássio 5,OmM com 0,1M de KC1.

Exemplo 4 - Espectofotometria infravermelho [066] As figuras 16A, 16B e 16C demonstram um espectro médio infravermelho de um pool de amostras de saliva de indivíduos saudáveis (Sal Neg), saliva de indivíduos com tuberculose (Sal Pos), Peptídeo TBC10, associação da Saliva de indivíduo saudável com o referido peptídeo (TBC10+Sal Neg)e associação da Saliva de indivíduo com tuberculose com o referido peptídeo (TBC10+Sal Pos). Os espectros no infravermelho de ATR-FTIR foram obtidos em espectofotômetro

Cary 630 e secos em temperatura ambiente por 5 minutos para obtenção do espectro que foram normalizados para Figura 16A ou avaliado em sistema de segunda derivada por Savitzky- Golay do fingerprint do espectro entre 1800-800 cm-1 para Figura 16B ou mais restrito entre 900-1200 cm-1 para melhor visualização na figura 16C. Considerando que o aumento do vale na saliva de indivíduos com tuberculose (2nd dev Sal Pos) em comparação com a mesma saliva associada com o referido peptídeo (2nd dev TBC10+Sal Pos) foi totalmente bloqueado ou teve redução evidente nos modos vibracionais 1044 cm-1, 1076 cm-1, 1118 cm-1 e 1155 cm-1 (indicado pelas setas) demonstra-se a capacidade de ligação especifica ou de maior afinidade com a biofluidos relacionados a detecção da tuberculose. Em conjunto, esses dados demonstram claramente o papel e possibilidade do uso destes peptídeos por interação molecular detectada por espectrometria infravermelho para o diagnóstico da tuberculose.

[067] De forma similar a figura anterior (Figura 16), as figuras 17A, 17B e 17C demonstram um espectro infravermelho médio de um pool de amostras de saliva de indivíduos saudáveis (Sal Neg), saliva de indivíduos com tuberculose (Sal Pos), Peptídeo TB2C10, associação da Saliva de indivíduo saudável com o referido peptídeo (TB2C10+Sal Neg)e associação da Saliva de indivíduo com tuberculose com o referido peptídeo (TB2C10+Sal Pos). Da mesma forma, os espectros no infravermelho foram obtidos em espectofotômetro ATR-FTIR Cary 630 e secos em temperatura ambiente por 5 minutos para obtenção do espectro que foram normalizados para Figura 17A ou avaliado em sistema de segunda derivada por Savitzky-Golay do fingerprint do espectro entre 1800-800 cm-1 para Figura 17B ou mais restrito entre 900-1200 cm-1 para melhor visualização na figura 15C. Tendo em vista que um aumento da profundidade do vale espectral na saliva de indivíduos com tuberculose (2nd dev Sal Pos) em comparação com a mesma saliva associada com o referido peptídeo (2nd dev TB2C10+Sal Pos) teve maior redução no modo vibracional 1076 cm-1 (indicado pelas setas)em amostras com tuberculose do que de pacientes saudáveis. Isto caracteriza que ocorre uma ligação de maior afinidade com a biofluidos relacionados a detecção da tuberculose.

[068] Em conjunto, os dados mostrados nos exemplos acima reforçam a capacidade dos peptídeos em serem utilizados no diagnóstico de Tuberculose, baseado na maior interação com componentes moleculares da saliva.

Exemplo 5 - Seleção e expressão de fragmento de anticorpo recombinante do tipo scFv

[069] Em outra modalidade do presente pedido de patente se descreve um novo fragmento de anticorpo recombinante monoclonal do tipo scFv, que compreende a SEQ ID No: 03

(ELTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSATGI PD

RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSHLSTFGQGSKVEIKGGSSRSSEVQ LV ESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGS IGYADSV

KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAK) ou compreende a cadeia leve (VL) da SEQ ID No: 04 (VL-ELTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSS SYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQ YGSHLSTFGQGSKVEIK) e a cadeia pesada (VH) da SEQ ID No: 05 (VH-EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNS GSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAK) , 4B, ligante do phago CIO, selecionado por phage display que foi capaz de reconhecer as proteínas de M. tuberculosis em ensaios bem como foi capaz de reconhecer os peptídeos sintéticos TBC10 e TB2C10 aqui descritos.

[070] Foi possível selecionar e expressar fragmentos de anticorpos do tipo scFv ligantes de proteínas de Mycobacteríum spp a partir do fago CIO. A seleção de clones de scFv frente ao fago CIO foi realizada utilizando uma biblioteca de fagos contendo aproximadamente 2xl0 ⁶ sequências combinatórias de scFv, desenvolvida no Laboratório de Nanobiotecnologia da UFU.

[071] Foram realizados dois ciclos de seleção, sendo precedidos pela reamplificação da biblioteca de scFv em Escherichia coli XLl-Blue competentes e infecção do fago auxiliar VCSM13 para a montagem e replicação das proteínas virais. Um poço de uma placa de microtitulação (Nunc MaxiSorpTM, eBioscience, San Diego, CA, EUA) foi sensibilizado com 10 ¹⁰ partículas virais em 50pL/poço em tampão carbonato-bicarbonato 0,1M (pH 8,6) e incubado por 18 horas a 4°C. O poço foi bloqueado com 250 pL de PBST 0,05%/BSA 5% durante 1 hora a 37°C, e lavado três vezes com PBS. Em seguida, 100 pL da biblioteca de fagos-scFv foram adicionados ao poço e a placa foi incubada por 1 hora a 37°C. Posteriormente, o poço foi lavado 10 vezes com PBST 0,1%. Os fagos ligados às proteínas totais foram eluidos com 100 pL de glicina-HCl lOOmM (pH 2,2) durante 30 minutos à temperatura ambiente (TA). A suspensão foi neutralizada com 16,5 pL de Tris 2M (pH 9,1). Os fagos resultantes desta primeira seleção foram amplificados em E. coli XLl-Blue. [072] Bactérias E. coli XLl-Blue infectadas a partir do

2 ^o ciclo de seleção foram utilizadas para extração do DNA plasmidial e posterior transformação em bactérias E. coli TOP10, uma linhagem não supressora.A extração DNA plasmidial foi realizada utilizando o QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden, DS, Germany), de acordo com as instruções do fabricante. O DNA plasmidial extraído foi quantificado (Nanodrop Spectrophotometer, (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA) e posteriormente analisado em gel de agarose a 0,8%. Bactérias E. coli TOP10 foram preparadas com CaCl2 para se tornarem quimiocompetentes. Aproximadamente 50 ng de DNA plasmidial foram adicionados cuidadosamente em 10 pL bactérias TOP10. A mistura foi mantida sob refrigeração em gelo durante 30 minutos e, em seguida, submetida a um choque térmico durante 90 segundos a 42°C e 60 segundos em banho de gelo. Posteriormente, 800 pL de meio SOC foram adicionados e a suspensão foi incubada a 37°C por 45 minutos. Aliquotas das células transformadas foram semeadas em placas de ágar Luria-Bertani (LB) contendo carbenicilina (100 pg/mL). As placas foram incubadas, overnight a 37°C, para o crescimento das colónias recombinantes que contêm o inserto. [073] Cada colónia foi transferida e cultivada em uma placa deep well contendo 1 mL de meio Superbroth (SB), carbenicilina (100 pg/mL) e 2% de glicose 2M (v/v). A placa foi coberta com filme plástico e incubada overnight sob agitação a 250 rpm e 37°C. Foram transferidos 50 pL de cada clone bacteriano para uma nova placa contendo 1 mL de meio SB/carbenicilina (100 pg/mL)/2% de glicose 2M (v/v) e incubados a 250 rpm a 37°C durante 4,5 horas. Após a incubação a placa foi centrifugada a 3.700 rpm durante 15 minutos a 4°C e o pellet foi ressuspenso em 1,5 mL de meio SB/carbenicilina (100 pg/mL). A expressão de scFv solúvel foi induzida com isopropil b-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG)

(Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, EUA) a uma concentração final de 2,5 mM, overnight sob agitação a 250 rpm e 30°C. A placa deep well foi centrifugada a 3.700 rpm durante 15 minutos a 4°C. O sobrenadante contendo o scFv solúvel foi transferido para outra placa de 96 poços e armazenado a 4°C. O volume remanescente da primeira placa foi centrifugado, e o pellet de cada clone de bactérias foi utilizado para a extração do DNA e posterior sequenciamento.

Exemplo 6 - Sequenciamento de DNA e análise de bioinformática

[074] Para a reação de sequenciamento foram utilizados os pellets de cada clone de bactéria previamente separado. As reações foram realizadas de acordo com o kit DyEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing (GE Healthcare Life Sciences, Waukesha, WI, EUA). Foram utilizados os seguintes primers: MMB4 (5'- GCT TCC GGC TCG TAT GTT GTG T-3' - SEQ ID No: 10) para a cadeia leve (VL), SEQ ID No: 04, e MMB5 (5'- CGT TTG CCA TCT TTT CAT AAT C-3' - SEQ ID No: 11) para a cadeia pesada (VH), SEQ ID No: 05, em um volume final de 10 pL. As amostras foram submetidas ao sequenciador MegaBaceTM 1000 Genetic Analyzer (Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA, EUA).

[075] As sequências foram analisadas pelo IgBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast) para identificação das cadeias leve e pesada das moléculas de scFv, assim como de suas regiões conservadas (framework regions, FRs) e variáveis (complementarity determining regions, CDRs). As sequências de aminoácidos deduzidas foram submetidas aos programas de bioinformática raptor-x (http://raptorx. uchicago.edu/) para obtenção da estrutura 3D da molécula de scFv, em formato pdb, e PyMOL (http://www.pymol.org/) para selecionar as regiões conservadas e variáveis do scFv. Para a identificação das possíveis regiões de ligação entre a proteína e o scFv realizou-se um docking (http://bioínfo3d. cs.tau.ac.il/PatchDock/). Após seleção da estrutura proteína-scFv mais estável, suas regiões foram selecionadas e delimitadas com o auxílio do programa PyMOL (http://www.pymol.org/).

Exemplo 7 - Reatividade dos fragmentos de scFv [076] A análise da capacidade de expressão dos fragmentos de anticorpos scFv e sua capacidade de reconhecimento do alvo (Figura 7 A e B) foi obtida para continuidade das análises. A Figura 7 (A) mostra um ensaio dot blot da expressão de clones scFv e a Figura (B) mostra um ensaio de ELISA para avaliação do padrão de expressão dos clones selecionados e sua capacidade de reconhecimento do alvo. Os clones scFv obtidos que foram capazes de reconhecer o alvo também foram triados quanto à reatividade cruzada frente a outros antígenos. 0 clone 4B foi o que apresentou maior afinidade e especificidade ao fago CIO, aos peptídeos TBC10 e TB2C10 e as proteínas de M. tuberculosis (PMt) que a proteínas de Strongyloides sp (PSs), Brucella sp (PBs), Candida sp (PCs) e Escherichia coli (PEc) (Figura 7 C). Desta forma, o clone 4B foi o que se mostrou mais seletivo e com maior afinidade na identificação de proteínas de M. tuberculosis, confirmando não somente o seu potencial de uso em imunoensaios para identificação de TB em amostras biológicas, bem como seu uso em plataformas de diagnóstico de TB. Além disso, o fragmento de anticorpo recombinante do tipo scFv (compreendendo a SEQ ID No: 03 ou a SEQ ID No: 04 e SEQ ID No: 05), 4B, também demonstrou afinidade pelo fago CIO e aos peptideos TBC10 e TB2C10, confirmando a capacidade dos peptideos TBC10 e TB2C10 de mimetizarem as proteínas antigênicas de Mycobacteríum tuberculosís ligantes a IgA de amostras biológicas obtidas de indivíduos com TB.

Exemplo 8- Imunocaptura e caracterização molecular de ligantes

[077] Para a Imunocaptura utilizou-se beads anti-His (mAb Mag Beads, GenScript Transforming Biology Research, Piscataway, NJ, EUA), que possuem anticorpos anti-histidina acoplados na sua superfície capazes de se ligarem a cauda de histidina (His) do scFv. O procedimento foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Após lavagens sucessivas, foram adicionados 100 pL de proteínas totais de M. tuberculosís (1 mg/mL) em tampão de ligação/lavagem e incubados por 1 hora a TA. Após três lavagens, foi realizada eluição ácida com 200pL de glicina (0,2M, pH 2,2) 15 minutos. O sobrenadante coletado foi neutralizado com 50pL de Tris- HC1 (1,0M, pH 9,1). Os ligantes foram eluídos das beads com a utilização de aparato magnético DynaMag-2 e o sobrenadante foi submetido em gel de SDS-PAGE 15%, em condições desnaturantes e não redutoras. As bandas proteicas foram visualizadas por coloração com Comassie Blue.

[078] A Figura 8 (A) mostra um gel de SDS-PAGE com bandas da moléculas scFv 4B, ~28kDa, fração proteica imunocaptura pelo scFv (MSPMT4B), ~65kDa, e extrato proteico de M. tuberculosis (PMTA), ~30kDa.

[079] A bandas visualizadas no gel de acrilamida referem-se a extratos resultantes da imunocaptura pelo scFv, próprio scFv4B, fração antigênica de ~65kDa de ligante de scFv (MSPMT4B), e PMTA, fração do extrato proteico de M. tuberculosis utilizado para captura. O não aparecimento de banda de ~65kDa na coluna referente ao extrato proteico (15pL do extrato total) deve-se à baixa concentração desta proteína no extrato total, que por ter sido concentrada na imunoprecipitação (15pL de um concentrado de 1,0 mL) aparece de forma discreta na segunda coluna à esquerda do marcador (MSPMT4B) (Figura 8 A).

[080] As Figuras 8 (BI - B2) mostram a predição da estrutura tridimensional da molécula do scFv 4B, com a identificação das suas cadeias leve (amarelo) e pesada (verde) e as regiões de CDR, (Bl) visão frontal da scFv 4B, (B2) visão apical da scFv 4B.

[081] A Figura 8 (C) mostra a interação entre o scFv 4B e a proteína chaperoninôO.2/hsp65 de M. tuberculosis com destaque pra os aminoácidos de ligação. Exemplo 9 - Seleção e expressão de aptâmeros

[082] Em ainda outra modalidade do presente pedido de patente se descreve o desenvolvimento de quatro aptâmeros: Ll, L2, L3 e L4, compreendendo as sequências SEQ ID No: 06 (ACGCTCGGATGCCACTACAGTTGGTGATTAAAGGTGCCGTCGGTGGTACGATTTGATC ATTCTAGCTCATGGACGTGCTGGTGAC ), SEQ ID No: 07 (CGCTCGGATGCCACT ACAGACGTTTACCGTGATTCTTATGAAACTTGTCAGAGGGGCTTTTCTGCTCATGGACG TGCTGGTGAC), SEQ ID No: 08 (ACGCTCGGATGCCACTACAGGAGCCTGAGCCC CCAACTGCTTAATATAATATGAGAAATGAACTAC TCATGGACGTGCTGGTGAC) e SEQ ID No: 9 (ACGCTCGGATGCCACTACAGTACGAGTTTTTCCTGGGAAGGGTCTG CCAGTAGGATAGCGGGTTCCTCATGGACGTGCTGGTGAC ), respectivamente, e que também foram capazes de se ligar as proteínas de M. tuberculosis bem como ao pepetideo sintético TBC10 POR SELEX. [083] O peptideo sintético TBC10, de 24 aminoácidos, mimético à proteína de M. tuberculosis, selecionado anteriormente pela técnica de phage display, foi utilizado como alvo para a seleção de aptâmeros de ssDNA, a partir de uma biblioteca comercial adquirida por Trilink Biotechnologies flanqueada por primers de 20 nucleotídeos (5'-ACGCTCGGATGCCACTACAG-45nt-CTCATGGACGTGCTGGTGAC3'). Os primers 5'-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3 ' (SEQ ID NO: 12) e o primer 5'-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3 ' (SEQ ID NO: 13) foram usados para amplificação em PCR assimétrica das fitas de ssDNA em cada ciclo de seleção do SELEX.

[084] A seleção foi realizada utilizando uma placa de microtitulação (Nunc MaxiSorpTM), onde 4 poços (1 poço por ciclo) foram sensibilizados com peptideo TBC10. Após desnaturação, 10 mM da biblioteca foi adicionado com tampão de ligação e soro albumina bovina (BSA) no primeiro poço e incubado por 60 minutos a temperatura ambiente. Os não ligantes foram lavados por duas vezes com tampão de lavagem. A eluição dos ligantes foi realizada a partir da desnaturação dos peptideos com proteinase K (lOmg/mL) diluída em tampão de ligação incubadas a 37°C por 20 minutos e precipitado com acetato de sódio 3M. O eluato resultante do primeiro ciclo foi amplificado por PCR assimétrica, para obtenção do ssDNA em maior quantidade para um novo ciclo, e assim sucessivamente .

[085] Após o 4 ^o ciclo de seleção, o pool de aptâmeros selecionados foi clonado em Escherichia coli DH5 competente. Após crescimento em placa, vinte clones foram coletados para extração do DNA plasmidial, os quais foram sequenciados usando Genomelab DTCS Quick Start kit (Beckamn Coulter, USA) de acordo com instruções do fabricante.

[086] Após o sequenciamento dos clones do último ciclo de seleção, as sequências válidas foram analisadas para predição de suas estruturas secundárias e seus valores mínimos de energia livre que foram obtidos pelo software

Sfold e estão apresentados na Figura 09.

Exemplo 10 - Imunorreatividade dos aptâmeros [087] O ensaio de reatividade dos quatro aptâmeros escolhidos (Ll, L2, L3 e L4), com estruturas secundárias divergentes foi realizado para verificar suas afinidades em relação ao peptídeo TBC10, ao bacilo inativo da M. tuberculosís (Mtb), à proteína de M. tuberculosís (PMt) e ao BSA. A reatividade medida em absorbância (450nm) está representada na Figura 10.

[088] Nos testes realizados, os aptâmeros apresentaram uma maior afinidade ao extrato proteico de Mycobacteríum tuberculosís (PMt) e ao peptídeo TBC10, que ao BSA (controle negativo). A baixa afinidade ao bacilo inativo (Mtb) sugerem que os aptâmeros se ligam especificamente a sítios intracelulares de proteínas de membrana ou proteínas secretadas pelo bacilo e que não estariam expostas na parede do bacilo íntegro.

[089] Desta forma, os aptâmeros (Ll, L2, L3 e L4) mostraram uma maior afinidade na identificação de proteínas de M. tuberculosís, confirmando não somente o seu potencial de uso em imunoensaios para identificação de TB em amostras biológicas, bem como seu uso em plataformas de diagnóstico de TB. Além disso, os aptâmeros confirmaram a capacidade dos peptídeos TBC10 e TB2C10 em mimetizarem as proteínas antigênicas de Mycobacteríum tuberculosís ligantes a

IgA.Portanto, o presente pedido de patente descreve peptideos sintéticos mimetopos de proteína antigênica de Mycobacterium tuberculosis para uso em um método de diagnóstico de tuberculose. Os referidos peptideos compreendem uma das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que consite de: SEQ ID N- 01 e SEQ ID N- 02, ou uma sequência tendo pelo menos 85% de identidade com umas das sequências de aminoácidos selecionada do grupo que consite de: SEQ ID N° 01 e SEQ ID N° 02.

[090] O presente pedido também descreve anticorpo recombinante ou fragmento deste para uso em um método de diagnóstico de tuberculose. O referido anticorpo ou fragmento compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID No: 03 ou uma cadeia leve (VL) tendo a sequência SEQ ID No: 04 e uma cadeia pesada (VH) tendo a SEQ ID No: 05, ou uma sequência tendo pelo menos 85% de identidade com a sequência SEQ ID No: 03 ou com as sequências SEQ ID No: 04 ou SEQ ID No: 05.

[091] O presente pedido também descreve aptâmeros para uso em um método de diagnóstico de tuberculose que compreendem ao menos umas das sequências de aminoácidos do grupo que consite de SEQ ID No: 06, SEQ ID No: 07, SEQ ID No: 08 e SEQ ID No: 09 ou uma sequência tendo pelo menos 85% de identidade com umas das sequências de aminoácidos do grupo que consite de SEQ ID No: 06, SEQ ID No: 07, SEQ ID No: 08 e SEQ ID No: 09.

[092] O presente pedido também descreve o uso dos peptideos (TBC10 e TB2C10), do anticorpo ou fragmento deste

(fragmento de anticorpo recombinante do tipo scFv) ou dos aptâmeros (Ll, L2, L3 e L4) em um método de diagnóstico de tuberculose .

[093] O presente pedido ainda descreve um método de diagnóstico de tuberculose que compreende as etapas de: preparar a amostra biológica, em que a amostra biológica é preferencialmente um fluido corporal de um indivíduo, mais preferencialmente uma amostra de saliva;

- colocar a amostra em contato com ao menos um dos peptideos (TBC10 e TB2C10), do anticorpo ou fragmento deste (fragmento de anticorpo recombinante do tipo scFv) ou ao menos um dos aptâmeros (Ll, L2, L3 e L4); ler o resultado por ensaio imunoenzimático, espectofotometria ou sensor eletroquímico.

[094] O referido método de diagnóstico compreende um imunoensaio por teste imunoenzimático ou por uma plataforma de diagnóstico, cuja plataforma se caracteriza por ser de detecção eletroquímica que compreende:

- preparação de um bioeletrodo em que compreende a adsorção, incorporação e/ou imobilização de ao menos um dos peptideos (TBC10 e TB2C10), do anticorpo ou fragmento deste (fragmento de anticorpo recombinante do tipo scFv) ou ao menos um dos aptâmeros (Ll, L2, L3 e L4); por em contato com o bioeletrodo preparado e sensibilizado com a Rodamina, cuja função é de ampliar o sinal da corrente no sistema e promover a ligação da amostra biológica no grafite do sensor. preparação para leitura do conjunto bioeletrodo preparado e amostra biológica;

- leitura do resultado.

[095] O eletrodo é um eletrodo selecionado do grupo que consiste de: eletrodo de grafite, de ouro, de platina, de carbono vítreo, de pasta de carbono, eletrodo com material polimérico e eletrodo modificado, mas particularmente um eletrodo de grafite.

[096] Portanto, a plataforma de diagnóstico de detecção eletroquimica compreende um bioeletrodo sensibilizado e estabilizado com Rodamina e pulso de luz, tendo adsorvido, incorporado ou imobilizado em sua superfície ao menos um dos peptídeos, anticorpo ou fragmento ou de ao menos um dos aptâmeros descritos na presente invenção, bem como compreende meios para leitura do resultado.

[097] Embora o presente pedido de patente tenha descrito a matéria objeto da presente invenção com um certo grau de detalhamento a título de ilustração e exemplificação para fins de clareza e compreensão, será evidente que certas alterações e modificações podem ser praticadas no escopo das reivindicações em anexo.

[098] Os exemplos descritos neste relatório não são limitativos, permitindo que um técnico no assunto altere alguns aspectos ou componentes da presente ivenção, equivalentes aos peptideos sintéticos, ao anticorpo recombinante ou fragmento deste, aos aptâmenros, aos usos destes e métodos de diagnósticos aqui descritos sem se distanciar do escopo da presente invenção.