La présente invention concerne un procédé de préparation d'anticorps hyperhumanisés.

Les anticorps monoclonaux représentent une classe thérapeutique qui est en constant développement. L'essor récent et considérable des anticorps monoclonaux (Ac) recombinants est notamment dû à la bonne tolérance de ces molécules, qui ont évolué depuis les Ac murins vers les Ac humains, en passant par les générations intermédiaires constituées des Ac chimérisés et humanisés.

La logique de cette évolution a été de diminuer la taille des régions d'origine murine dans les domaines variables de ces Ac thérapeutiques, notamment dans les régions charpentes (Ac humanisés), pour aller finalement vers des anticorps totalement humains. L'amélioration de tolérance qui a pu ensuite être observée (notamment diminution de la fréquence d'apparition des Ac anti-Ac thérapeutiques et/ou augmentation de la durée de vie des Ac thérapeutiques) traduit la justesse de cette approche, même si la tolérance attendue des immunoglobulines humaines de type G (IgG) n'est pas parfaite, comme en témoignent les travaux antérieurs sur les réseaux idiotypiques par exemple (Behn U. Idiotypic Networks: Toward a Renaissance? Immunol Rev 2007;216: 142-52, and Sfikakis PP. The First Décade of Biologie Tnf Antagonists in Clinical Practice: Lessons Learned, Unresolved Issues and Future Directions. Curr Dir Autoimmun 2010;11 :180-210.)·

Les travaux de l'équipe de J. Foote (Hwang et al, Methods, Vol.36, Issue 1, May 2005, pages 35-42) et de P. Thullier (Pelât et al, J Mol Biol, 2008 Dec 31 ;384(5) : 1400-7) ont démontré la possibilité de « germinaliser » (« germline-humanize ») des Ac dans les régions charpentes (« framework » ou FR), respectivement d'origine murine ou provenant de macaques non humains. Selon Pelât et al, les régions charpentes des Ac de primates non-humains (PNH) ont été « germinalisées », c'est-à-dire que ces régions ont été mutées pour les rendre très proches des séquences codées par les gènes germinaux humains. L'intérêt de cette approche est que les séquences codées par les gènes germinaux humains font partie du « soi immunologique » humain, donc sont bien tolérées lors d'une utilisation thérapeutique humaine. Les séquences d'anticorps codées par les gènes germinaux humains codent les IgM mais pas les IgG, car les IgG subissent la maturation d'affinité, permise grâce à des mutations apportées aux gènes germinaux mais ces mutations peuvent être immunogènes. Les gènes germinaux mutés codant les IgG sont appelés gènes somatiques.

Les régions hypervariables (CDR), quant à elles, sont très exposées à la surface des Ac, de façon à interagir directement avec les antigènes. Elles sont donc très susceptibles de causer une réponse immunologique humorale, plus encore que les régions charpentes. Cependant, l'interaction de l'Ac avec l'antigène dépend étroitement des séquences des régions hypervariables, et toute mutation dans ces régions est hautement susceptible d'altérer l'affinité de l'Ac pour son antigène.

L'utilisation d'Ac dans un traitement donné pose toujours la question de

I ' immunogénicité .

II existe donc un besoin de disposer d'Ac ayant une bonne tolérance en usage clinique donc une faible immunogénicité chez l'homme, sans altérer significativement leur affinité pour l'antigène. Réduire, voire annuler, Γ immunogénicité des Ac lors de leur usage thérapeutique, tout en conservant leur affinité, est le but de l'invention.

La présente invention porte sur une stratégie visant à diminuer immunogénicité des anticorps en mutant les gènes somatiques codant les régions hypervariables d'anticorps recombinants pour les rapprocher de gènes germinaux humains codant ces régions.

Les inventeurs ont récemment découvert que, de façon surprenante, la mutation des régions CDR de façon à les rendre très proches des séquences codées par les gènes germinaux humains permet de répondre à ces attentes. En effet, lorsque les régions hypervariables d'Ac sont mutées pour être rendues le plus proche possible des séquences codées par les gènes germinaux humains, on évite ou on limite le problème de l'immunogénicité puisque les séquences ainsi mutées sont plus près du « soi immunologique » humain et, de façon surprenante, de telles mutations sont largement possibles tout en conservant une affinité de l'Ac pour son antigène comparable à l'affinité de l'Ac initial. L'amélioration de la tolérance chez l'homme est notamment corrélée à la diminution des réponses immunitaires dirigées contre l'anticorps ainsi modifié, du fait de sa plus grande proximité avec le « soi immunologique » humain par rapport à l'anticorps parental.

La présente invention a donc pour objet un procédé de préparation d'une région hypervariable germinalisée d'anticorps dirigé contre une cible, comprenant les étapes suivantes :

a) obtention de la séquence peptidique d'une région hypervariable d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps de Mammifère, à l'exception d'une IgM humaine, ledit Mammifère ayant une séquence homologue humaine, ledit anticorps ou fragment d'anticorps étant dirigé contre ladite cible ;

b) comparaison entre la séquence peptidique de la région hypervariable obtenue en a), et les séquences peptidiques codées par les gènes germinaux V, (D), J humains, afin d'identifier au moins un gène germinal V, (D) ou J humain codant la séquence peptidique la plus proche de la séquence peptidique de la région hypervariable obtenue en a) ;

c) pour chaque acide aminé différent entre la séquence peptidique obtenue en a) et la séquence peptidique la plus proche obtenue en b), substitution par mutagénèse dirigée in vitro de chaque acide aminé de la séquence peptidique de la région hypervariable obtenue en a), par l'acide aminé correspondant de la séquence peptidique codée par le gène germinal V, (D) ou J humain identifié en b), afin d'obtenir une série de régions hypervariables mutées de Mammifère, chaque séquence peptidique de région hypervariable comprenant au moins une mutation ;

d) sélection des régions hypervariables mutées obtenues en c) ayant une affinité pour ladite cible comparable ou supérieure à celle de la région hypervariable d'anticorps ou de fragment d'anticorps obtenue en a) ; et

e) éventuellement, préparation de la séquence peptidique de la région hypervariable d'anticorps ou de fragment d'anticorps dirigé contre ladite cible comprenant toutes ou partie des mutations présentes dans au moins une séquence peptidique de la sélection obtenue en d).

Les étapes a) et b) peuvent également consister à rechercher les séquences nucléotidiques les plus proches des séquences nucléotidiques codant les séquences peptidiques des régions hypervariables de l'anticorps de Mammifère. Aussi, la présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une région hypervariable germinalisée d'anticorps dirigé contre une cible (ci-après « procédé alternatif »), comprenant les étapes suivantes :

a) obtention de la séquence nucléotidique d'une région hypervariable d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps de Mammifère, à l'exception d'une IgM humaine, ledit Mammifère ayant une séquence homologue humaine, ledit anticorps ou fragment d'anticorps étant dirigé contre ladite cible ;

b) comparaison entre la séquence nucléotidique de la région hypervariable obtenue en a), et les séquences nucléotidiques codées par les gènes germinaux V, (D), J humains, afin d'identifier au moins un gène germinal V, (D) ou J humain codant la séquence nucléotidique la plus proche de la séquence nucléotidique de la région hypervariable obtenue en a) ;

c) pour chaque nucléotide différent entre la séquence nucléotidique obtenue en a) et la séquence nucléotidique la plus proche obtenue en b), substitution par mutagénèse dirigée in vitro de chaque nucléotide de la séquence nucléotidique de la région hypervariable obtenue en a), par le nucléotide correspondant de la séquence nucléotidique codée par le gène germinal V, (D) ou J humain identifié en b), afin d'obtenir une série de séquences nucléotidiques de régions hypervariables mutées de Mammifère, chaque séquence nucléotidique de région hypervariable comprenant au moins une mutation ;

d) traduction des séquences nucléotidiques de régions hypervariables mutées obtenues en c) et sélection des régions hypervariables mutées ayant une affinité pour ladite cible comparable ou supérieure à celle de la région hypervariable d'anticorps ou de fragment d'anticorps obtenue en a) ; et

e) éventuellement, préparation de la séquence peptidique de la région hypervariable d'anticorps ou de fragment d'anticorps dirigé contre ladite cible comprenant toutes ou partie des mutations présentes dans au moins une séquence peptidique de la sélection obtenue en d). Le procédé selon l'invention est un procédé in vitro ; il utilise les techniques de la biologie moléculaire. Ce procédé correspond à la germinalisation des régions hypervariables d'anticorps. Pour diminuer le plus possible l'immunogénicité, l'étape e) comprend de préférence la préparation de la séquence peptidique de la région hypervariable d'anticorps ou de fragment d'anticorps dirigé contre ladite cible, identique à la séquence la plus proche codée par au moins un gène germinal humain V, D ou J identifiée à l'étape b). Egalement, afin de diminuer le plus possible l'immunogénicité d'une région variable d'anticorps, la germinalisation est conduite simultanément dans les régions charpentes et dans les régions hypervariables, sans distinguer explicitement l'un ou l'autre type de régions. La présente invention a aussi pour objet une région hypervariable germinalisée d'anticorps susceptible d'être obtenue par ledit procédé. L'invention a également pour objet un anticorps ou fragment d'anticorps comprenant la région hypervariable germinalisée ainsi obtenue.

Un autre objet de l'invention est la séquence nucléique codant ladite région hypervariable germinalisée ou ledit anticorps ou ledit fragment d'anticorps. Cette séquence nucléique peut être comprise dans un vecteur.

Enfin, la présente invention a pour objet une composition comprenant ladite région hypervariable germinalisée ou ledit anticorps ou ledit fragment d'anticorps.

La présente invention a également pour objet l'utilisation de ladite région hypervariable germinalisée ou dudit anticorps ou dudit fragment d'anticorps en thérapie.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide des définitions suivantes.

Comme il est bien connu, seule une partie de l'anticorps, la région variable, est impliquée dans la liaison de l'anticorps à son épitope. Les régions constantes de l'anticorps activent les effecteurs immunitaires, phagocytes ou cellules tueuses, et le complément ; ces régions constantes ne sont pas impliquées dans la liaison à l'antigène. Les anticorps comprennent deux chaînes lourdes identiques associées à deux chaînes légères identiques, kappa ou lambda. Un anticorps dont la région constante (Fc) a été enzymatiquement clivée de façon à en préserver la région charnière est désigné comme un fragment F(ab')2 et conserve les deux sites de liaison à l'antigène.

De même, un anticorps dont la région constante, y compris la région charnière a été enzymatiquement clivée, ou qui a été produit sans cette région, est désigné comme un fragment Fab et conserve un des deux sites de liaison à l'antigène. Les fragments Fab consistent en une chaîne légère qui est liée de façon covalente à une portion de la chaîne lourde appelée Fd.

Dans la région variable, on trouve les régions déterminant la complémentarité (CDRs, complementary determining régions), ou régions hypervariables, qui interagissent directement avec l'antigène. On trouve également un second type de régions, appelées régions charpentes (FRs, frameworks), qui maintiennent la structure tertiaire des CDRs. Ces régions charpentes sont assez spécifiques de l'espèce où a été produit l'anticorps. Dans le fragment Fd de la chaîne lourde et dans la chaîne légère, on trouve quatre régions charpentes (FRl à 4) séparées respectivement par trois CDR (CDRl à 3) sur chaque chaîne.

La région variable d'un anticorps est codée par plusieurs gènes : les gènes de segments variables (V), de diversité (D) et de jonction (J). La région variable d'une chaîne lourde d'anticorps est notamment codée par un gène V, un gène D et un gène J ; la région variable d'une chaîne légère est notamment codée par un gène V et un gène J, mais ne comprend pas de gène D. Par recombinaison des gènes germinaux humains V, D et J, on obtient une séquence VDJ ou VJ, à laquelle peuvent être ajoutés des résidus aux jonctions V/D et D/J (chaîne lourde) ou bien à la jonction V/J (chaîne légère), codant respectivement pour les parties variables des chaînes lourde et légère.

Chez l'homme, les gènes des chaînes lourdes (locus IGH), les gènes des chaînes légères kappa (locus IGK) et les gènes des chaînes légères lambda (locus IGL), sont respectivement situés sur les chromosomes 14, 2 et 22. Par recombinaison des gènes des locus IGH, IGK et IGL durant la différenciation des lymphocytes B, les anticorps sont synthétisés.

Chez l'homme, le locus IGK comprend 76 gènes IGKV (variables) dont 34 à 37 sont fonctionnels et appartiennent à 5 sous-groupes ; le locus IGL comprend 70 à 74 gènes IGLV (variables) dont 29 à 35 sont fonctionnels et appartiennent à 10 sous-groupes. Il existe cinq gènes IGKJ (jonction) situés en 3' des gènes IGKV. Enfin, le locus IGH comprend 123 à 129 gènes IGHV selon les haplotypes, dont 38 à 46 sont fonctionnels et appartiennent à 6 ou 7 sous-groupes. Vingt-sept gènes D (diversité), dont 23 fonctionnels et neuf gènes JH, dont six fonctionnels, ont été décrits (Génétique Moléculaire des Immunoglobulines, Prof.Marie-Paule LEFRANC et Gérard LEFRANC, IMGT Education).

Le terme « anticorps » se réfère à une molécule d'immunoglobuline ayant la capacité de se lier spécifiquement à un antigène particulier. Des fragments d'anticorps ou d'immunoglobuline bien connus sont par exemple les fragments F(ab')2, F(ab)2, Fab, Fab', Fv, scFv, diabody, dAb et Fd, ou encore une chaîne lourde ou une chaîne légère, un VH ou un VL. Le terme « région hypervariable » se réfère à un CDR : 3 CDRs sont présents sur la partie variable de la chaîne lourde, et 3 CDRs sont présents sur la partie variable de la chaîne légère. Ces régions hypervariables sont étroitement en contact avec l'antigène. Par CDR, on entend donc aussi bien l'une des séquences peptidiques présentes sur la chaîne lourde (i.e. CDRl, CDR2 ou CDR3 de VH), que l'une des séquences peptidiques présentes sur la chaîne légère (i.e. CDRl, CDR2 ou CDR3 de VL). Dans la présente demande, lorsque l'on parle de « séquence peptidique d'une région hypervariable », on entend la séquence peptidique d'un CDR de la chaîne lourde ou de la chaîne légère. Les 3 CDRs présents sur la partie variable de la chaîne lourde et les 3 CDRs présents sur la partie variable de la chaîne légère forment le site de fixation à l'antigène. Si plusieurs délimitations des CDRs peuvent être proposées dans le cadre de leur définition scientifique, la délimitation englobant la taille maximale de chacun des CDRs doit être préférentiellement retenue selon la présente invention. Toute autre définition est néanmoins acceptable. Le Mammifère duquel provient la séquence peptidique (ou nucléotidique) de la région hypervariable d'anticorps ou de fragment d'anticorps utilisée en a) doit avoir une séquence humaine homologue. En effet, pour obtenir une région hypervariable germinalisée administrable à l'homme, il est important que la séquence initiale ait une séquence homologue humaine, qui sert de référence pour réaliser le procédé selon l'invention. Par anticorps homologue d'un anticorps humain, on entend un anticorps dérivé d'une séquence ancestrale commune (ancêtre commun) avec l'anticorps humain. Le CDR de Mammifère est de préférence un CDR de Primate. Les Primates peuvent être humains ou non humains, et regroupent notamment les Cercopithécidés (Cercopithecidae) et les Hominidés (Hominidae). De préférence, les Mammifères sont choisis parmi le macaque, l'homme, le chimpanzé, le bonobo, le gorille, l'orang-outan, et le babouin. De préférence, les Mammifères sont choisis parmi le macaque et l'homme.

Le terme « gène germinal humain » se réfère à tout gène humain présent dans les cellules germinales (spermatozoïdes, ovules). Un tel gène comprend une séquence nucléotidique non modifiée, i.e. n'ayant subi aucune mutation liée à la maturation d'affinité. Les gènes germinaux V, D et J, notamment humains, au sens de l'invention, n'ont subi aucune recombinaison et aucune mutation liée maturation d'affinité : ils sont en configuration germinale.

La maturation d'affinité repose sur 2 processus :

des mutations somatiques qui touchent l'ensemble des segments géniques qui codent les régions variables des anticorps, i.e. les segments variables (V), les segments de diversité (D) et les segments de jonction (J) ;

et la sélection dirigée par l'antigène qui conduit à l'expansion des clones qui, suite aux mutations, expriment les anticorps présentant la plus haute affinité. Aussi, un gène germinal V, D ou J humain n'a subi aucune mutation somatique liée à la maturation d'affinité, et correspond à la séquence initiale présente dans les cellules germinales humaines. Puisque l'invention concerne les anticorps, de tels gènes germinaux humains s'entendent dans la présente invention de ceux codant les IgM humaines. Les IgM humaines sont en effet codés dans leur partie variable par des séquences de gènes germinaux recombinés VDJ (chaînes lourdes) et VJ (chaînes légères).

L'invention est ainsi applicable à tout anticorps qui n'est pas codé par des gènes germinaux humains, donc à tout anticorps sauf les IgM humaines. Par « gène germinal humain codant la séquence peptidique la plus proche » d'une séquence donnée, on entend le gène germinal humain codant la séquence peptidique (ou nucléotidique pour le procédé alternatif) qui présente le plus grand « pourcentage d'identité » avec la séquence donnée, ou le plus grand « pourcentage de similitude » avec la séquence donnée. Par abréviation, dans la suite de la présente demande, on parlera indifféremment de « gène germinal humain codant la séquence peptidique (ou nucléotidique pour le procédé alternatif) la plus proche » ou de « gène germinal humain le plus proche ».

Le pourcentage de similitude de séquences peptidiques prend en compte les identités entre acides aminés, ainsi que les propriétés physico-chimiques similaires entre certains acides aminés. On dit que des acides aminés ont des propriétés physico-chimiques similaires si la substitution d'un acide aminé en un autre ne perturbe pas la fonction de la protéine ; on parle alors de substitution conservative. Par exemple, on peut échanger l'acide aminé hydrophobe valine en leucine. Le pourcentage de similitude est calculé comme le pourcentage d'identité, détaillé ci-après, mais prend en compte l'identité entre acides aminés et les substitutions conservatives.

Le pourcentage d'identité de séquences peptidiques est déterminé en comparant 2 séquences alignées de manière optimale sur une fenêtre de comparaison, dans laquelle la portion de séquence d'acides aminés peut comprendre des additions ou délétions (i.e. gaps) comparé à la séquence de référence (qui ne comprend pas d'addition ou délétion) pour un alignement optimal des 2 séquences. Le pourcentage d'identité peut être calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles des résidus d'acides aminés identiques figurent dans les 2 séquences, pour obtenir le nombre de positions identiques, en divisant le nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, et en multipliant par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité de séquence.

Alternativement, le pourcentage d'identité peut être calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles soit le résidu d'acide aminé identique entre les 2 séquences, soit le résidu d'acide aminé est aligné avec un gap pour obtenir le nombre de positions identiques, en divisant le nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, et en multipliant par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité de séquence. De nombreux algorithmes sont disponibles pour aligner 2 séquences. L'alignement optimal de séquences peut être effectué notamment par l'algorithme d'homologie locale de Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, par l'algorithme d'alignement d'homologie de Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, par la méthode de recherche de similarité de Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:2444, par implémentations informatiques de ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the GCG Wisconsin Software Package), ou par inspection visuelle (voir Current Protocols dans Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, une joint venture entre Greene Publishing Associates, Inc. et John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplément) (Ausubel)). Des exemples d'algorithmes sont notamment BLAST et BLAST 2.0, décrits dans Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410 et Altschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389- 3402, respectivement. Un programme pour réaliser des analyses BLAST est disponible sur le site du National Center for Biotechnology Information. Par exemple, une détermination d'alignement de séquences et de pourcentage d'identité de séquences peut utiliser le programme BESTFIT ou GAP dans le pack GCG Wisconsin Software (Accelrys, Madison WI), en utilisant les paramètres par défaut.

Le pourcentage d'identité de séquences nucléotidiques est déterminé comme décrit pour les séquences peptidiques, mais en utilisant cette fois des séquences nucléotidiques.

Le terme « région hypervariable germinalisée » se réfère à un CDR de Mammifère, de préférence de Primate, dans lequel certains acides aminés (ou nucléotides pour le procédé alternatif) ont été substitués par les acides aminés (ou nucléotides pour le procédé alternatif) figurant en position(s) identique(s) dans la séquence peptidique (ou nucléotidique pour le procédé alternatif) codée par le gène germinal humain le plus proche.

L'affinité K _D d'un anticorps peut être mesurée par les techniques conventionnelles connues de l'homme du métier. On parle d'affinité comparable entre 2 anticorps pour une cible donnée lorsque le changement d'affinité ne provoque pas de modification fonctionnelle sur l'anticorps destiné à l'usage thérapeutique (par exemple, pas de différence de neutralisation de toxine ou de cytotoxicité vis-à-vis de cellules cibles, entre l'anticorps initial, i.e. à la base de l'étape a), et l'anticorps, notamment l'IgG, obtenu par le procédé selon l'invention et proposé en thérapeutique). De préférence, on parle d'affinités comparables entre 2 anticorps pour une cible donnée lorsque leurs K _D varient d'au plus un facteur 100, de préférence 50, de préférence 10, de préférence 5, de préférence 2. En effet, dans certains cas, l'activité de l'anticorps dépend peu de l'affinité de ses sites de fixation à l'antigène.

L'affinité d'un anticorps A est supérieure à l'affinité d'un anticorps B pour une même cible si le K _D de A est au moins 150 fois plus petit, de préférence au moins 500 fois plus petit, de préférence au moins 1000 fois plus petit que le K _D de l'anticorps B.

La constante d'affinité K _D peut être calculée à partir des constantes d'association et de dissociation mesurées en temps réel par résonance plasmonique de surface tel qu'expliqué par les protocoles des appareils Biacore (General Electric Healthcare) ou directement par ELISA de compétition, par exemple.

Le procédé selon la présente invention fournit donc des régions hypervariables germinalisées. De préférence, ladite(lesdites) région(s) hypervariable(s) germinalisée(s) est(sont) présente(s) dans des fragments d'anticorps de type F(ab')2, Fab, Fv, scFv, diabody, dAb et Fd, ou dans des anticorps chimériques ou totalement humains dans lesquels la partie Fc de l'anticorps provient de séquences homologues humaines ou non humaines. Ces anticorps ou fragments d'anticorps peuvent comprendre un seul CDR germinalisé, 2 CDRs germinalisés ou les 3 CDRs de chacune des chaînes lourde et/ou légère peuvent être germinalisés (au total, de 1 à 6 CDRs par site de fixation à l'antigène, et de 1 à 12 CDRs par IgG, par exemple).

Selon un mode de l'invention, la partie Fc de l'anticorps peut être choisie de façon à produire des IgA, des IgM ou des IgG.

Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, lorsque la région hypervariable germinalisée est présente dans un anticorps, cet anticorps possède une partie Fc d'origine humaine. De tels anticorps entiers sont préférés pour l'administration chez l'homme car ils présentent une demi- vie plus longue que des fragments d'anticorps tels que les Fab, et sont plus adaptés à une administration intraveineuse, intra-péritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou transdermale. Dans certains modes de réalisation de l'invention, des fragments d'anticorps tels que les fragments Fab sont préférés pour les raisons suivantes :

i) comme les fragments Fab ne possèdent qu'un seul site de liaison à l'antigène, les complexes immuns de grande taille ne peuvent pas se former,

ii) l'absence de région Fc empêche l'apparition d'une réaction inflammatoire activée par le Fc, telle que l'activation de la cascade du complément,

iii) la pénétration dans les tissus d'une petite molécule Fab est plus facile, et

iv) la production de Fabs est facilement réalisée et à faible coût dans des bactéries telles que E. coli.

Ainsi, selon un aspect, le procédé selon la présente invention fournit des Fabs ayant au moins une région hypervariable germinalisée, ou des fragments de cet anticorps plus petits ou plus grands que des fragments Fabs ou encore des peptides de liaison à l'épitope.

Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir des anticorps et fragments d'anticorps présentant une affinité comparable ou améliorée par rapport à l'anticorps initial de Mammifères, de préférence de Primate, ainsi qu'une meilleure tolérance par le système immunitaire humain. Un tel anticorps « germinalisé » présente l'avantage de ne pas ou de moins induire de réponse immune contre lui-même, et d'avoir une plus longue demi-vie et d'induire moins d'effets secondaires nocifs pour le sujet traité.

Le procédé selon l'invention comprend une étape a) d'obtention de la séquence peptidique (ou nucléotidique pour le procédé alternatif) d'une région hypervariable d'un anticorps ou de fragment d'anticorps de Mammifère, de préférence de Primate, ledit anticorps ou fragment d'anticorps étant distinct d'une IgM humaine, ledit anticorps ou fragment d'anticorps étant dirigé contre une cible. Comme indiqué ci-avant, le Mammifère choisi comme modèle de départ présente une séquence homologue humaine ; cela signifie que pour obtenir une région hypervariable germinalisée d'anticorps dirigé contre une cible, le Mammifère choisi comme modèle de départ doit posséder un anticorps dirigé contre ladite cible qui est un homologue d'un anticorps humain. Cette étape a) peut être réalisée selon toute méthode connue de l'art antérieur, notamment par séquençage à partir de l'anticorps natif ou son fragment, ou par séquençage de l'ADN codant cet anticorps natif ou son fragment, puis traduction de la séquence nucléotidique.

La séquence peptidique (ou nucléotidique) de la région hypervariable est spécifique d'une cible donnée.

La séquence obtenue à l'étape a) est de préférence une séquence d'une région hypervariable d'anticorps ou de fragment d'anticorps humain ou de macaque, à l'exception d'une IgM humaine. Puis, la séquence peptidique de la région hypervariable obtenue en a) est comparée avec les séquences peptidiques codées par les gènes germinaux V, D et J humains. Les séquences peptidiques codées par les gènes germinaux V, D et J humains correspondent aux séquences peptidiques des régions variables des chaînes lourdes et légères d'anticorps n'ayant pas subi de maturation d'affinité. Cette comparaison a pour but d'identifier au moins un gène germinal V, D ou J humain le plus proche. Le but de l'étape b) est d'identifier, parmi la multitude de gènes germinaux V, D et J humains existant, au moins un gène germinal V, D ou J humain ayant le plus fort pourcentage d'identité avec la séquence obtenue en a). En effet, la séquence peptidique codée par le gène germinal V, D ou J humain qui présente le plus fort pourcentage d'identité avec la séquence de région hypervariable obtenue en a) correspond à la séquence peptidique la plus proche de la séquence de départ. Elle détermine donc de fait le gène germinal humain le plus proche, qui est obtenu en fin d'étape b).

Alternativement, lorsque l'étape a) utilise des séquences nucléotidiques (procédé alternatif), il est aussi possible de comparer, lors de cette étape b), les séquences nucléotidiques entre elles, et de muter les régions hypervariables de l'anticorps à germinaliser (étape c)) pour augmenter la proximité avec les gènes V (D) J

De préférence, l'étape b) comprend la comparaison entre la séquence peptidique de la région hypervariable obtenue en a) et les séquences peptidiques codées par les gènes germinaux V, D et J humains.

De préférence, l'étape b) comprend la comparaison entre la séquence obtenue en a) et les séquences peptidiques codées par tous les gènes germinaux V, D et J humains, afin d'identifier le gène V, le gène J et éventuellement le gène D (i.e. dans le cas d'une chaîne lourde) codant les séquences peptidiques les plus proches de la séquence obtenue en a). Grâce à cette étape b), les gènes germinaux humains V, J et éventuellement D présentant les plus forts pourcentages d'identité (donc les plus proches) avec la séquence obtenue en a) sont identifiés.

L'étape b) peut être réalisée en utilisant des outils de comparaison en ligne, comme VQuest ou DomainGapAlign du serveur IMGT (h ttp : //im gt.cines.fr); elle peut aussi être faite par d'autres moyens, y compris manuellement. Ces outils indiquent les séquences peptidiques codées par les gènes germinaux V, D et J humains les plus proches de chaque séquence obtenue en a). Une telle analyse permet également de localiser les différences entre les séquences peptidiques obtenues en a) et les séquences peptidiques codées par les gènes germinaux humains.

Les étapes a) et b) peuvent être réalisées sur la chaîne lourde et/ou sur la chaîne légère de la région hypervariable.

La séquence peptidique de région hypervariable d'anticorps ou de fragment d'anticorps obtenue en a) est ensuite substituée, pour chaque position sur laquelle l'acide aminé diffère entre la séquence obtenue en a) et la séquence peptidique codée par le gène germinal V, D ou J humain le plus proche (obtenue en b)), par mutagénèse dirigée in vitro, par l'acide aminé correspondant de cette dernière séquence (étape c)). Par exemple, si une séquence de région hypervariable d'anticorps de macaque est préparée en a), l'étape c) peut consister en une substitution, pour chaque acide aminé pertinent, de l'acide aminé originel de la séquence macaque par l'acide aminé correspondant de la séquence peptidique codée par le gène germinal V, D ou J humain le plus proche : on a donc une évolution de la séquence de la région hypervariable macaque vers la séquence germinale humaine.

Cette étape de mutagénèse dirigée peut se faire par toute méthode appropriée, telle que par mutation(s) ponctuelle(s) dirigée(s) ou par synthèse de gène par exemple.

Cette étape c) peut être réalisée en mutant un à un les acides aminés pertinents, ou bien en les mutant par groupe(s). A la fin de l'étape c), on obtient une série de régions hypervariables d'anticorps ou de fragments d'anticorps, chacune de ces régions hypervariables comprenant une ou plusieurs mutation(s). Dans l'exemple du paragraphe précédent, à la fin de l'étape c), on peut ainsi obtenir une série de régions hypervariables d'origine macaque, comprenant chacune une mutation correspondant à l'acide aminé de la séquence peptidique codée par le gène germinal V, (D) ou J humain le plus proche.

Alternativement, lorsque l'étape a) utilise des séquences nucléotidiques (procédé alternatif), on obtient en fin d'étape c) une série de séquences nucléotidiques de régions hypervariables d'anticorps ou de fragments d'anticorps, chacune de ces régions hypervariables comprenant une ou plusieurs mutation(s).

Parmi la série obtenue à l'étape c), il faut ensuite sélectionner les régions hypervariables d'anticorps ou de fragments d'anticorps ayant une affinité pour la cible comparable ou supérieure à l'affinité de la région hypervariable initiale (obtenue en a)) pour cette même cible : cela constitue l'étape d). En effet, l'étape d) vise à sélectionner uniquement les régions hypervariables mutées (i.e. comprenant chacune au moins une mutation ponctuelle qui la rapproche du gène germinal humain le plus proche) présentant une affinité comparable ou supérieure pour la cible, par rapport à la région hypervariable initiale. Cette affinité peut se mesurer par appareil Biacore ou toute technique équivalente comme indiqué plus haut.

A la fin de l'étape d), on obtient ainsi une série de régions hypervariables mutées qui présentent sensiblement la même affinité, ou une affinité supérieure pour la cible que la région hypervariable initiale.

Alternativement, lorsque l'étape a) utilise des séquences nucléotidiques (procédé alternatif), l'étape d) comprend la traduction des séquences nucléotidiques de régions hypervariables mutées obtenues en c), puis la sélection des régions hypervariables d'anticorps ou de fragments d'anticorps ayant une affinité pour la cible comparable ou supérieure à l'affinité de la région hypervariable initiale (obtenue en a)) pour cette même cible.

A partir de cette sélection, on peut ajouter optionnellement une étape e) : cette étape e) comprend la préparation d'une région hypervariable présentant toutes ou partie des mutations présentes dans au moins une séquence peptidique sélectionnée à l'étape d). De préférence, cette étape e) comprend la préparation d'une région hypervariable présentant toutes les mutations présentes dans toutes les séquences peptidiques de la sélection de l'étape d).

Le produit obtenu en fin d'étape e) correspond ainsi à une séquence synthétique de région hypervariable d'anticorps de Mammifère comprenant une ou plusieurs mutations ponctuelles qui rapprochent ladite séquence du gène germinal humain le plus proche. Aussi, de préférence, in fine, on obtient une région hypervariable ayant une forte identité ou une forte similarité avec les gènes germinaux humains les plus proches, et qui présente l'affinité de l'anticorps initial (i.e. à la base de l'étape a)).

De préférence, le procédé selon l'invention comprend également, après l'étape d) ou e) (lorsque cette dernière est effectuée), une étape f) d'évaluation de la région hypervariable germinalisée obtenue. Cette étape f) peut comprendre le calcul du pourcentage de similarité avec la séquence codée par le gène germinal humain le plus proche (ou « index de germinalité » ou « germinality index ») pour la séquence peptidique initiale obtenue en a), et pour la séquence peptidique finale obtenue en d) ou e). L'index de germinalité selon l'invention peut être mesuré par analogie comme indiqué dans Pelât et al, Germline Humanization of a Non-hurnan Primate Antibody that Neutralizes the Anthrax Toxin, by in Vitro and in Silico Engineering, J. Mol. Biol. (2008) 384, 1400-1407. Pelât et al décrit la notion d'index de germinalité pour les régions charpentes FR seulement ; il est possible d'extrapoler ce calcul de façon similaire pour les régions hypervariables, et également pour les régions variables. Brièvement, l'index de germinalité selon la présente invention se calcule comme suit : le gène germinal humain le plus proche est traduit, et le pourcentage d'acides aminés identiques entre la séquence traduite et la(es) séquence(s) peptidique(s) de région hypervariable obtenue(s) en a) (ou d) ou e)) est. calculé et appelé index de germinalité. L'étape f) peut aussi être effectuée par calcul des H-scores et des G-scores. Ces scores sont dérivés du Z-score, qui indique le degré « d'humanité » (« humanness ») d'une séquence : un Z-score de 0 correspond à une séquence qui est en moyenne similaire au répertoire de séquences humaines, un Z-score positif correspond à des séquences qui sont en moyenne fortement identiques aux séquences humaines, et un Z-score négatif correspond à des séquences qui sont en moyenne moins typiques de séquences humaines (Abhinandan et al, Analyzing the "Degree of Humanness" of Antibody Séquences, J. Mol. Biol. (2007) 369, 852-862).

Le H-score (pour « humanness score ») correspond au Z-score calculé par rapport à tout le répertoire humain exprimé et représenté dans la banque de séquences de Kabat, et le G-score (pour « germline-derived score ») correspond au Z-score calculé par rapport à chaque partie de ce répertoire qui appartient à une même famille, puis moyenné pour l'ensemble de ces parties. Le H-score et le G-score peuvent être mesurés comme indiqué dans Thullier et al, The Humanness of Macaque Antibody Séquences, J. Mol. Biol. (2010).

Lorsque le procédé selon l'invention comprend une étape f), cette étape peut comprendre le calcul :

- de l'index de germinalité de la séquence peptidique obtenue en a) et de l'index de germinalité de la séquence peptidique obtenue en d) ou e) ; et/ou

- du H-score ou du G-score de la séquence peptidique obtenue en a) et de la séquence peptidique obtenue en d) ou e),

puis la comparaison respective entre ces valeurs.

L'index de germinalité doit normalement être augmenté entre la séquence peptidique initiale obtenue en a) et la séquence peptidique finale obtenue en d) ou e) grâce au procédé selon l'invention. De même, les H- et G-scores doivent normalement être augmentés entre la séquence peptidique initiale obtenue en a) et la séquence peptidique finale obtenue en d) ou e) grâce au procédé selon l'invention.

La présente invention a aussi pour objet une région hypervariable germinalisée d'anticorps susceptible d'être obtenue par le procédé décrit ci-dessus.

L'invention a également pour objet un anticorps ou fragment d'anticorps comprenant la région hypervariable germinalisée ainsi obtenue. Un tel anticorps ou fragment d'anticorps peut comprendre un seul CDR germinalisé, mais peut également comprendre 2 ou 3 CDRs de chacune des chaînes lourde et/ou légère. Un tel anticorps ou fragment d'anticorps peut également comprendre, outre un ou plusieurs CDRs germinalisés, une ou plusieurs régions charpente (FR) également germinalisées. Un autre objet de l'invention est un vecteur comprenant la séquence nucléique codant ladite région hypervariable germinalisée ou ledit anticorps ou ledit fragment d'anticorps.

Ces acides nucléiques pourront être compris dans un vecteur recombinant pour le clonage ou pour l'expression des anticorps de l'invention.

La présente invention inclut tous les vecteurs recombinants contenant des séquences codantes pour la transformation, transfection ou thérapie génique eucaryote ou procaryote. De tels vecteurs pourront être préparés selon les techniques conventionnelles de biologie moléculaire et comprendront en outre un promoteur approprié, optionnellement une séquence signal pour export ou la sécrétion, et des séquences régulatrices nécessaires pour la transcription de la séquence nucléotidique.

Un polypeptide de fusion peut être utile pour la purification des anticorps de la présente invention. Le domaine de fusion peut par exemple inclure une queue poly-histidine qui permet la purification sur des colonnes Ni+, ou une ancre membranaire de phage filamenteux qui est particulièrement utile pour le screening de banque, selon la technologie du « phage display ».

Un des vecteurs approprié dans le cadre de l'invention est une molécule d'ADN recombinante adaptée pour recevoir et exprimer une première et une seconde séquence d'ADN, de façon à permettre l'expression d'anticorps hétérodimérique tel qu'un anticorps de longueur complète ou des fragments F(ab')2 ou Fab selon l'invention. Un tel vecteur fournit un système pour indépendamment cloner les deux séquences d'ADN dans deux cassettes séparées présentes dans le vecteur, de façon à former deux cistrons séparés pour l'expression d'un premier et d'un second polypeptide de l'anticorps hétérodimérique. Un tel vecteur d'expression est appelé vecteur di-cistronique.

Les anticorps modifiés de la présente invention peuvent être produits dans des cellules eucaryotes telles que des CHO ou des hybridomes humain ou murin par exemple, ainsi que dans des cellules végétales. La présente invention a également pour objet des cellules hôtes, procaryotes ou eucaryotes, comprenant un vecteur selon l'invention.

Enfin, la présente invention a pour objet une composition, notamment pharmaceutique, comprenant ladite région hypervariable germinalisée ou ledit anticorps ou ledit fragment d'anticorps.

Ladite composition pharmaceutique comprend de façon préférée un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Un tel véhicule correspond au sens de l'invention à un matériel non toxique qui n'interfère pas avec l'efficacité de l'activité biologique des ingrédients actifs de la composition. Le terme « pharmaceutiquement acceptable » réfère à un matériel non toxique qui est compatible avec un système biologique tel qu'une cellule, une culture cellulaire, un tissu ou un organisme. Les caractéristiques du véhicule dépendront du mode d'administration. L'anticorps ou le fragment d'anticorps germinalisé selon l'invention peut être marqué. Des exemples de marqueurs comprennent les enzymes, les radio-isotopes, les composés fluorescents, les métaux colloïdes, les composés chimioluminescents, et les composés bioluminescents. Les méthodes de liaison d'un marqueur à un anticorps sont bien connues de l'homme du métier.

Une autre technique de marquage consiste à coupler l'anticorps à des haptènes de faibles poids moléculaire, ces haptènes pouvant être spécifiquement modifiés au moyen d'une seconde réaction. Des exemples d'haptènes sont la biotine, qui réagit avec l'avidine, ou le dinitrophenol, le pyridoxal ou la fluorescéine, qui peuvent réagir avec des anticorps spécifiques anti-haptènes.

La présente invention a pour objet une méthode de traitement d'un sujet, de préférence un humain, dans laquelle une quantité thérapeutiquement efficace d'un anticorps ou d'un fragment d'anticorps selon l'invention est administré audit sujet.

Une quantité thérapeutiquement efficace correspond à une quantité suffisante pour diminuer les symptômes de la maladie et l'évolution de l'infection. Cette quantité peut varier avec l'âge, le sexe du sujet et le stade de la maladie et sera déterminée par l'homme du métier. Une quantité thérapeutiquement efficace peut varier entre 0.01 mg/kg et 50 mg/kg, préférablement entre 0.1 mg/kg et 20 mg/kg, et plus préférablement entre 0.1 mg/kg et 2 mg/kg, en une ou plusieurs administrations quotidiennes, pendant un ou plusieurs jours.

Le mode d'administration peut être par injection ou par perfusion graduelle. L'injection peut être intraveineuse, intra-péritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou transdermale.

Les préparations pour une administration parentérale peuvent inclure des solutions aqueuses ou non-aqueuses stériles, des suspensions ou des émulsions. Des exemples de solvents non-aqueux sont le propylène glycol, le polyéthylène glycol, des huiles végétales, telle que l'huile d'olive, ou des esters organiques injectables tels que l'éthyl oléate. Des véhicules aqueux comprennent l'eau, des solutions alcool/eau, des émulsions ou des suspensions.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à un exemple d'obtention d'anticorps selon l'invention.

Dans les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, il sera fait référence aux figures en annexe:

Figure 1 : schéma en collier de perles de la région variable de la chaîne lourde et de la région variable de la chaîne légère de l'anticorps 45RCA.

La représentation IMGT en collier de perles est réalisée en accord avec la numérotation IMGT.

Matériels et méthodes

Souches E. coli

Les souches E. coli suivantes ont été utilisées :

- XL1 (Stratagène, La jolla, CA) : recAl, endAl, gyrA96 thi-1 hsdR17 sup E44 relAl lac [F'proAB lacIqZAM15 TnlO(Tetr)] - SURE (Stratagène): el4(McrA) A(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endAl supE44 thi-1 gyrA96 relAl lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F ^' proAB lacIqZAM15 TnlO (Tetr)]

- HB2151, utilisées pour l'expression de scFv solubles.

Anticorps et toxines

L'anticorps utilisé est un scFv de PNH de très haute affinité (41 pM), neutralisant la ricine, appelé 43RCA (T. Pelât & al, BMC Biotechnology 2009, 9 :60).

La chaîne A de la ricine, injectée au macaque, a été achetée chez Vector Labs, de même que la ricine complète.

Sélection d'anticorps par phage

Les particules de phages-scFv ont été purifiées et concentrées à partir de 50 ml de culture par précipitation au PEG, puis re-suspendues dans 3 ml de PBS-BSA 1%-azide 0,02% et filtrées sur un filtre de 0,45 μιη. Le titre de cette préparation de phage était d'environ 5 10 ¹⁰ pfu/ml. Les phages-scFv ont été soumis à trois cycles d'infection- sélection-récupération tel que précédemment décrit (Andris-Widhopf, Rader et al. 2000). Expression de scFv soluble, extraction périplasmique et purification

Chaque variant ADN a été transformé dans des bactéries de la souche d'E. coli appelée HB2151, rendues chimiquement compétentes. Les cellules ont été cultivées à 30°C, agitées à 250 rpm dans IL de milieu SB contenant 50 μg/ml de carbénicilline et 0,1% de glucose. Lorsque la culture a atteint une A ₆ oo de 1,5, une induction avec 1 mM d'IPTG a été effectuée pendant 18h à 22°C.

Les scFvs ont été extraits avec du sulfate de polymixine B (Sigma) et purifiés sur colonne de nickel (Ni-NTA spin column, QIAGEN, Valencia, CA) selon les instructions du fabricant, puis dialysés avec du PBS IX à 4°C pendant 3h. Quantification du scFv

La pureté du Fab a été testée par SDS-PAGE et sa concentration a été déterminée à l'aide du logiciel Quantity One® (Biorad). Mesure en temps réel de la résonance plasmonique de surface (SPR)

Les constantes de cinétique de l'interaction entre la ricine et les scFv obtenus précédemment ont été déterminées en utilisant le système Biacore X SPR (General Electric Healthcare). La ricine a été immobilisée sur une puce sensible CM5 en utilisant une procédure de couplage des aminés par injection de 30 μΐ de 2 μg/ml de ricine dans 10 mM de sodium acétate pH 4,5. Pour minimiser la probabilité de reliaison, le K _D a été mesuré en utilisant un débit élevé (30 μΐ/min) et une quantité minimale d'antigène couplé (environ 500 RU, unités de résonance). Le taux de liaison de différentes concentrations de scFv allant de 5 à 400 nM dans du PBS a été déterminé à un débit de 30 μΐ/min. Les données de liaison ont été introduites dans un modèle langmuir 1 : 1 du logiciel d'évaluation BIA. Les constantes d'association et de dissociation (k _on et k _Qff respectivement) pour la liaison du scFv à la ricine ont été déterminées à 35°C.

Analyse de séquences

Les séquences des régions variables des chaînes lourde et légère des clones sélectionnés ont été déterminées par Génome Express (Meylan, France) en utilisant les amorces Mkmyc and MkpelB, (Kirsch et al., 2005). Les séquences ont été analysées en ligne, en utilisant le système IMGT (http:/imgt.cines.fr).

Résultats

Obtention d'anticorps germinalisés dans leurs régions charpentes FR

Le scFv 43RCA a été analysé en utilisant l'outil DomainGapAlign, qui a indiqué les gènes germinaux humains codant des séquences les plus proches des séquences peptidiques de 43RCA. Ces gènes étaient IGKV1-5*01 et IGKJ4*01 pour la chaîne légère, et IGHV3- 11*01 et IGHJ5*01 pour la chaîne lourde (DomainGapAlign ne recherche pas les gènes D).

La germinalisation des régions charpentes (ou « super-humanisation ») a eu lieu comme indiqué au tableau 1. Tableau 1 : Mutations correspondant à la super-humanisation de 43RCA

NB : les acides aminés sont désignés par le code à une lettre II a donc été observé que quatre mutations (en position 3,4,13,14) altèrent l'affinité ; elles figurent en italique et en gras dans le tableau 1. Les quinze autres mutations ont été associées dans un gène synthétique codant le variant super-humanisé, dont l'affinité pour la ricine a été mesurée à 2,7 10 ^"11 M (27 pM).

En partant de ce variant super-humanisé, la germinalisation des régions hypervariabli CDR a été effectuée.

Obtention d'anticorps germinalisés dans leurs régions charpentes FR et dans leurs régions CDR

En partant du variant super-humanisé de 43RCA, les 15 mutations correspondant à la germinalisation dans les régions hypervariables, et figurant sur le tableau 2, ont été réalisées (« hyper-humanisation »). Tableau 2 : Mutations correspondant à l'hyper-humanisation de 43RCA

II a donc été observé que cinq mutations (positions 2, 4, 12, 13, 14) altèrent l'affinité ; elles figurent en italique et en gras. Les dix autres mutations ont été associées dans un gène synthétique codant le variant super- et hyper-humanisé, dont l'affinité pour la ricine a été mesurée à 8,9 10 ^"11 M (89 pM). Onze positions sur quinze ont donc pu être mutées sans altération significative de la réactivité de l'Ac, par comparaison avec l'affinité du scFv parental.

Les résultats de ces travaux peuvent être évalués par la mesure du Z-score (K.R. Abhinandan & A . Martin, 2007), ou de l'index de germinalité (T. Pelât & al, 2008) étendu aux régions hypervariables, ou bien de paramètres dérivés des deux précédents.