《実施例1:劇症C型肝炎ウイルス全長遺伝子の 単離及び解析》
(A)血清からのRNAの抽出
 劇症肝炎患者の急性期に採取した血清250μL� ��り、High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche
diagnostics corporation)を用い、メーカーの推奨� �る方法に従い、RNAを精製した。

(B)cDNAの合成及びPCRによるcDNAの増幅
 精製したRNAにXR58Rプライマーを加え、SuperSuc ript II reverse transcriptase (Invitrogen社)により� �メーカーの推奨する方法に従い、42℃、1時� �逆転写反応を行わせ、cDNAを得た。得られた� ��応液にRNaseH(Invitrogen)を加え、37℃、30分反応 させ、RNAを分解した。この反応液を、HC-LongA1 プライマーと1b9405Rプライマー及びTakara LA Ta q DNA polymerase (宝酒造)を用い、94℃、20秒、6 8℃、9分間からなる30回のサーマルサイクル� �応によるポリメラーゼチェインリアクショ� �(PCR)を行い、cDNAを増幅した。更に、得られ� �反応液の一部を、HC85FとHC9302Rプライマーを� �いてPCRを行い、HCV cDNAを増幅した。

(C)cDNAのクローニング
 増幅したDNA断片は、0.7%アガロースゲルを用 い電気泳動によって分離し、QIAquick gel purifi cation kit (QIAGEN社)を用い、メーカーの推奨す る方法に従って、DNA断片を回収した。回収し たDNA断片は、pGEM-T easyベクター(Promega社)と連 結反応させ、そのプラスミドによりDH5α株を� ��質転換した。アンピシリン耐性の形質転換� ��を選択し、2YT培地を用いて培養した。培養� ��た菌体からWizard Plus SV Miniprep DNA Purificati on Systemを用いプラスミドを精製した。

(D)塩基配列の決定
 HCV cDNAの塩基配列は、HCVの遺伝子型1bの塩� �配列に基づいて設計したプライマーを用い� �決定した。CEQ
DTCS Quick Start Kit(ベックマン・コールター)� �用い、メーカーの推奨する方法に従い、反� �を行い、CEQ2000 XL DNA analysis system (Software  version 4.0.0、ベックマン・コールター)により 解析した。得られたデータをSequencher (Version� �4.1.2、Gene Codes Corporation)により解析した。� �られたHCVクローンをpTPF1-0193と命名した。

(E)5’非翻訳領域のcDNAの取得と塩基配列の決� ��
 更に、前記の(A)の工程で得られたRNAより、5 ’RACE法により、5’非翻訳領域の末端のcDNAを 取得した。5’RACE
System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version2 .0 (Invitrogen社)のキットを用い、添付の指示� �に従って、実施した。
 cDNA合成のためのアンチセンスプライマーは 、Chiba-asを使用した。SuperScript II Reverse
Transcriptase(Invitrogen)でcDNAを合成し、S.N.A.P colu mnで精製後、cDNAにTdT-tailing反応を行い、dCTPを 付加した。キットに添付の5’RACE Abridged Anch orプライマー及びKY78プライマーでTakara LA Taq  DNA polymerase(宝酒造)を用いて、1回目のPCRを� ��った。このPCR産物の一部を鋳型として、キ� ��トに添付のUTPプライマーとKM2プライマーで� ��Takara
LA Taq DNA polymerase(宝酒造)を用いて2回目のPCR を行い、PCR産物を得た。このPCR産物をpGEM-T
easyベクターにクローニングし、前記(D)の工� �に従い、塩基配列を決定した。得られた配� �番号1における第1位から第709位までを含むHCV
cDNAクローンをpTPF1-0007と命名した。

(F)3’非翻訳領域のcDNAの取得と塩基配列の決� ��
 前記の(A)の工程で得られたRNAより、3’RACE� �により、3’非翻訳領域の末端のcDNAを取得し た。まず、患者のRNAにPoly(A) Tailing Kit(Ambion)� ��用いて、添付の指示書に従い、Poly(A)を付加 した。XR58Rプライマーの代わりにdT-Adpプライ� ��ーを、1st PCRのプライマーとして3UTR-1Fプラ� ��マー及びAdpプライマーを、2nd PCRのプライ� �ーとしてXR58F及びAdpプライマーを用いた以外 は、前記工程(B)~(D)の操作を繰り返した。得� �れたHCV cDNAクローンを pTPF1-8994と命名した� �

 得られたHCV株をTPF1株と命名した。TPF1株� �、全長9594塩基のHCVであり、その塩基配列を� ��列番号1に示した。得られたTPF1株のポリヌ� �レオチドは、その342番から9374番の間に、3010 個の一つながりのアミノ酸をコードする翻訳 領域を有するものであった。TPF1株のポリプ� �テインのアミノ酸配列を配列番号2に示す。

 以下にクローニング及び塩基配列の決定に� ��いたプライマーを示す。
XR58R(配列番号12):5’-tcatgcggct cacggacctt tcacagcta g-3’
HClongA1(配列番号13):5’-atcgtcttca cgcagaaagc gtctag ccat-3’
1b9405R(配列番号14):5'-gcctattggc ctggagtgtt tagctc-3� ��
HC85F(配列番号15):5'-atggcgttag tatgagtgtc gtgcagcct-3 ’
HC9302R(配列番号16):5’-tcgggcacga gacaggctgt gatatat gtc t-3’
chiba-as(配列番号17):5'-tgcacggtct acgagacct-3’
KY78(配列番号18):5’-ctcgcaagca ccctatcagc cagt-3’
KM2(配列番号19):5’-aggcattgag cgggtttat-3’
dT-Adp(配列番号20):5’-ctagactcga gtcgacatcg tttttttt tt
tttttttt-3’
3UTR-1F(配列番号21):5’-atcttagccc tagtcacggc-3’
Adp(配列番号22):5’-ctagactcga gtcgacatcg-3’
XR58F(配列番号23):5’-ctagctgtaa aggtccgtga gccgcatga -3’
M13 Primer M3(配列番号24):5’-gtaaaacgac ggccagt-3� �
M13 Primer RV(配列番号25):5’-caggaaacag ctatgac-3� �
104(配列番号26):5’-aggaagactt ccgagcggtc-3’
HC841S(配列番号27):5’-ggaacttgcc cggttgctct ttctctat ct tc-3’
E1(配列番号28):5’-attccatggt ggggaactgg gctaa-3’
HC2069S(配列番号29):5’-taacaatacc ttgacctgcc ccacgga ctg-3’
HC2430S(配列番号30):5’-aacatcgtgg acgtgcaata cctgtac gg-3’
HC2461AS(配列番号31):5’-gaccctacac cgtacaggta-3’
HC2769S(配列番号32):5’-ttggaccggg agatggctgc atcgtg- 3’
HC3632F(配列番号33):5’-cacccaaatg tacaccaatg t-3’
HC3928S(配列番号34):5’-tacccgttga gtctatggaa ac-3’
HC4016AS(配列番号35):5’-cacttggaat gtctgcggta-3’
HC4498S(配列番号36):5’-agggggggag gcatctcatt ttctg-3 ’
HC4888F(配列番号37):5’-tgctatgacg cgggctgtgc ttggta- 3’
HC5381F(配列番号38):5’-ggtcattgtg ggcaggatca t-3’
HC5692S(配列番号39):5’-ctgcctggaa accccgcgat-3’
HC5858F(配列番号40):5’-tggcagcata ggccttggga aggt-3� ��
HC6315F(配列番号41):5’-aagacctggc tccagtccaa g-3’
5A-1(配列番号42):5’-ttccatgctc accgacccct c-3’
HC7090S(配列番号43):5’-gtggagtcag agaataaggt-3’
HC7743F(配列番号44):5’-cagaagaagg tcacctttgac-3’
HC8192S(配列番号45):5’-gcagcgggtc gagttcctgg tgaat-3 ’
HC8939F(配列番号46):5’-ctacggggcc tgttactcca ttgaac- 3’

《実施例2:サブジェノミックRNAレプリコンの� ��成》
 C型肝炎ウイルスTPF1株の全長のポリヌクレ� �チドを、pBluescriptIISK(+)のT7 RNAプロモーター� ��列の下流に挿入した(以下、pTPF1と称する)。

 次に、pTPF1の構造タンパク質をコードする� �域と非構造タンパク質をコードする領域の� �部を、ネオマイシン耐性遺伝子(ネオマイシ� ��リン酸転移酵素、NPT-II)及びEMCV-IRES(脳心筋� �ウイルスの内部リボゾーム結合部位)と入れ� ��えて、plasmid DNA pRepTPF1を構築した。この構 築手順は、既報(Lohmann
et al., Science, (1999) 285, p.110-113)に従った。

 具体的にはまずpTPF1を制限酵素AgeI及びBsrG Iで切断し、その切断部位に、pTPF1由来の5’UT RからCore領域におよぶ配列とpcDNA3.1(+)由来の� �オマイシン耐性遺伝子とをPCR増幅により増� �し制限酵素AgeIとPmeIで切断した断片、及びEMC V-IRESからNS3領域におよぶ配列をPCR増幅により 結合し制限酵素PmeI及びBsrGIで切断した断片を 連結挿入した。このplasmid DNA pRepTPF1をXbaIで� ��断したものを鋳型に、Megascript T7 kit (Ambion )を用いてRNAを合成した。メーカーの推奨す� �方法にてRNAを精製した。

 ヒト肝がん細胞(Huh7、JCRB0403)はDulbecco’s
modified Eagle medium (D-MEM, IWAKI)に10%ウシ胎仔� �清(FBS)、ペニシリンとストレプトマイシンを それぞれ50 U/mL、50 μg/mLとなるように加えた ものを培養液として、5%二酸化炭素付加、37� �で培養を行った。コンフルエントになる前� �細胞をトリプシン、EDTA処理により培養皿か� ��剥離させ、血清添加培地に再懸濁すること� ��よりトリプシンを不活化する。PBSで2回洗浄 後、1.25% DMSOを添加したCytomix(120mM Potassium ch loride、10mM Potassium phosphate、5mM Magnesium
chloride、25mM HEPES、0.15mM
Calcium chloride、2mMEGTA、pH7.6)に再懸濁し、ギャ ップ0.4 cmのエレクトロポレーションキュベ� �トに移す。

 適当量のRNAを細胞に加えた後、5分間氷上 で十分冷却する。エレクトロポレーター(Bio-R ad)で、960uF、250Vにてパルスを加える。直ちに 8mLの培地に再懸濁し、一部をプレートに播く 。一定時間培養した後、培養プレートにG418(� ��オマイシン)を1mg/mLの濃度で添加した。その 後、4日間隔で培養液を交換しながら培養を� �続した。播種時から約20日間培養後の培養プ レートから生存細胞のコロニーをクローン化 し、培養を継続した。このようなコロニーの クローニングにより、pRepTPF1レプリコンRNAが� ��律複製している細胞を樹立することができ� ��。レプリコンRNA複製の有無は、細胞性RNAに� ��まれる複製レプリコンRNAのコピー数を、定� ��的RT-PCR法にて解析した。

マイナス鎖の定量方法
 レプリコンRNAの自律複製が起こっているこ� ��は、細胞中にHCV RNAの5’UTR領域のマイナス� ��が検出できるか否かで調べた。マイナス鎖� ��特異的な定量法は特願平08-187097号公報に記� ��のマイナス鎖RNAの特異的検出法と同様の方� ��で行った。
 pRepTPF-1を鋳型にin vitroで合成したRNAをエレ� ��トロポレーションで導入した細胞から、有� ��な量のマイナス鎖が検出でき、細胞内にお� ��てレプリコンRNAが自律的に複製しているこ� ��が確認された。

《実施例3:適応変異の解析》
 実施例2に従って、pRepTPF1を鋳型にin vitroで� ��成したRNAをHuh7細胞へトランスフェクション することで樹立したレプリコンRNA複製細胞株 から、ISOGEN(日本ジーン)を用いて、メーカー� ��推奨する条件に従い細胞内RNAを抽出した。

 この細胞内RNAから実施例1でTPF1より遺伝子� �取得したのと同様の手順で、レプリコンRNA� �ほぼ全領域にわたるDNAを増幅した。具体的� �は、抽出した細胞内RNAを鋳型としてSuperSucrip t II reverse
transcriptase (Invitrogen)とXR58Rプライマーとによ� ��レプリコンRNAに対するcDNAを合成した。

 このcDNAの一部を用い、EMCV-S1プライマー:5’ -tgcacatgct
ctacatgtgt ttagtcgagg-3’(配列番号60)とHC9405Rプラ� ��マーの存在下で、Takara LA Taq DNA polymerase  (宝酒造)を用い、94℃、20秒、68℃、6分間から なる30回のサーマルサイクル反応によるポリ� ��ラーゼチェインリアクション(PCR)を行うこ� �により、HCV cDNAの増幅を行った。pGEM-T easy� �クターにクローニングしたクローンの配列� �決定したところ、塩基数5752番目のAがT、6237� ��目のGがAへの置換が認められた。その結果� �配列番号2のアミノ酸番号1804に相当するアミ ノ酸がQ(グルタミン)からL(ロイシン)、アミノ 酸番号1966に相当するアミノ酸がE(グルタミン 酸)からK(リジン)へそれぞれ変異した。

 次に、前記のアミノ酸置換がレプリコンRNA� ��複製に及ぼす影響について検討した。まず� ��実施例2において作製したHCV RNAレプリコン� �pRepTPF1にアミノ酸番号1804(QからLへ)及びアミ� ��酸番号1906(EからKへ)の適応変異をQuick
Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いメーカーの推奨 する方法に従い、導入した。このアミノ酸置 換を導入したレプリコンRNAをpRep4Bと命名した 。

 変異を引き起こす塩基配列を有しないpRep TPF1及びアミノ酸変異を有するpRep4Bのplasmid DN AをXbaIで切断したものを鋳型に、Megascript T7  kit (Ambion)を用いてRNAを合成した。メーカー� �推奨する方法にてRNAを精製した。精製した� �れぞれのRNAをHuh7細胞にトランスフェクショ� ��し、G418存在下で約20日間培養を行いクリス� ��ルバイオレットで生存細胞を染色した。染� ��されたコロニー数を計測し、トランスフェ� ��ションしたレプリコンRNA量1μg当りのコロニ ー数を計算した。

 RepTPF1 RNA 1μgをトランスフェクションした� ��合には1個のG418耐性コロニーが選択され、Re p4B RNA 1μgをトランスフェクションした場合� ��は10 ⁴ 個のコロニーが選択された。つまり、レプリ コンRNAにおけるアミノ酸変異を引き起こす塩 基変異は、Huh7細胞においてレプリコンRNAの� �製効率を増大させる適応変異であると考え� �れた。

《実施例4:HCV RNAの複製に対する適応変異の� �果》
 実施例2において作成した完全長HCV
DNA pTPF1を制限酵素SfiIで切断し、その切断部� ��に、pRep4Bを制限酵素SfiIで切断した断片を連 結挿入することで、適応変異が挿入された完 全長HCV DNA
pTPF1/4Bを作成した。

 この適応変異が挿入されたpTPF1/4Bより合� �された完全長HCV RNAのHuh7細胞における複製� �率をpTPF1の場合と比較した。具体的には実施 例2と同様の方法を用い、完全長HCV RNAをin vi troで合成し、Huh7細胞にトランスフェクショ� �した。トランスフェクションを行った細胞� �、直ちに10mLの培地に再懸濁し、12 wellプレ� �トに(直径22.1mm)に1mLずつ播き培養を開始した 。4時間、24時間、48時間及び72時間に培養上� �を回収した。回収した培養上清は、2krpmで10� ��間遠心し上清を回収した。上清100μLをHCVコ� ��抗原のキット(富士レビオ、ルミパルス)を� �用し測定した。

 図1に示すように、適応変異を導入したpTPF1/ 4Bの上清中におけるコア抗原の測定値は、い� ��れのポイントにおいても、適応変異を持た� ��い対照のpTPF1の場合より高かった。このこ� �は本発明の適応変異を完全長HCV RNAレプリコ ンに導入することにより、細胞内において高 効率に複製し、コア蛋白質を上清中に分泌し ていることを示している。肝臓で複製してい る構造と同じ全長型ゲノムが、in-vitroで複製� ��能であることを示したものである。
 特に、本発明のTPF1-NS4Bポリペプチドにおい� ��、前記の適応変異を有するTPF1-変異NS4Bポリ� ��プチドをコードするポリヌクレオチドを、� ��プリコンRNAに用いることにより、RNAの複製� ��率が上昇したものと考えられる。

《実施例5:再感染可能なHCV粒子の構築》
 実施例4において培養上清中に分泌されたコ ア抗原がウイルス粒子を形成し、in vitroにお いて再感染可能か検討した。具体的には、pTP F1/FL4Bより合成された完全長HCV RNAをHuh7細胞� �トランスフェクションし、72時間培養を行っ た後に培養上清を回収した。回収した培養上 清は2krpmで10分間遠心後、フィルター濾過(0.45 μm、Millipore)を行い破砕した細胞等を除去し� �。

 フィルター濾過を行った上清は、12
wellプレート(直径22.1μm)に培養したHuh7細胞と3 時間、4℃の低温条件下で反応させた。反応� �、5%二酸化炭素付加、37℃のインキュベータ� ��内に移し培養を行った。4時間、24時間、48� �間、72時間及び96時間に細胞を1mMEDTA-PBSで剥� �し遠心分離にて回収した。細胞ペレットを50 μL RIPA緩衝液(20mM
Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mMEDTA, 1%NP40, 0.1%D eoxycholate, 0.1%SDS
complete protease inhibitor cocktail (Roche diagnostics  corporation))に溶解し、10krpmで5分間遠心によ� �上清を回収した。上清5μLをHCVコア抗原のキ� ��ト(富士レビオ、ルミパルス)を使用し測定� �た。

 図2に示すように、pTPF1/4Bの培養上清を処� ��した細胞内のコア抗原は4時間から24時間に� ��けていったん減少した後、48時間から上昇� �、96時間後も増加していた。このことは本発 明の完全長HCV RNAが細胞中で複製し放出され� ��培養上清中には、新たなHuh7細胞に感染可能 なウイルス粒子が含まれることを示している 。

《実施例6:インターフェロン感受性の急性肝� ��患者からのC型肝炎ウイルス全長遺伝子の取 得》
 インターフェロン治療で奏効を示した急性� ��炎患者の血清からC型肝炎ウイルス全長遺伝 子の取得を試みた。患者血清からRNAの抽出試 薬であるISOGEN-LS(日本ジーン)を用い、添付の� ��示書に従ってRNAを抽出した。

 このRNAから実施例1でTPF1より全長遺伝子� �取得したのと同様の手法を用い、第85位から 第9302位までの、HCV遺伝子を取得した。pGEM-T  easyベクターにクローニングし、配列を決定� �たところ、遺伝子型1bに属する典型的な全長 遺伝子であった。

 続いて、3’非翻訳領域の核酸配列を決定し た。抽出したRNA2.5μLにプライマー8913Fを5 pmol e(0.5μL)加え、70℃で3分間保持し、氷中で急冷 した。これに5xFirst-Strand Buffer 2μL、0.1M DTT  1μL、20mM
dNTP 0.5μL、RNase Inhibitor(宝酒造) 20units、SuperS ucript II reverse
transcriptase (Invitrogen) 0.5μLを加え、全量で10μ Lになるようにジエチルピロカーボネイト処� �した滅菌水を加えた。この混合液を42℃、60� ��反応させた。RNAを破壊するため、RNaseH(宝酒 造、60U/μL)を12U加え、37℃で30分保持し、その 後72℃、3分で失活させ、cDNAとして用いた。

 このcDNA、2μLをプライマー8913F及びRP2を用い て前記と同様の方法でPCRを行った。このPCRの 産物の一部を用い、8939FとR1のプライマーで2� ��目のPCRを行い、約600baseのPCR産物を得た。こ のPCR産物をpGEM-T
Easy ベクターにクローニングし配列を決定し た。

 一方HCV cDNAの5’末端は、以下のように単 離し配列を決定した。前述のRNaseHで処理した cDNA反応液の一部を、HCLongH1及びHC705Rと、Takara  EX Taq DNA polymerase (宝酒造)を用い、94℃、2 0秒、55℃、30秒、72℃、1分からなるサーマル� ��イクルを35回繰り返すPCRにより、既に報告� �れているHCV cDNAの第1位から709位に相当する� ��片を増幅させた。このPCR産物をpGEM-T easyベ� ��ターにクローニングし、配列を決定した。

 以上により、全ウイルスゲノム配列を取� ��し、これをAHC1株と命名した。得られたAHC1� �は、全長9594塩基長であり、決定された全ウ� ��ルスゲノムの塩基配列は、その342番から9374 番の間に、3010個の一つながりのアミノ酸を� �ードする翻訳領域を有するものであった。� �の塩基配列を配列番号10に、アミノ酸配列を 配列番号11に示した。

 以下にクローニング及び遺伝子解析に用い� ��プライマーを示す。
XR58R(配列番号12):5’-tcatgcggct cacggacctt tcacagcta g-3’
HClongA1(配列番号13):5’-atcgtcttca cgcagaaagc gtctag ccat-3’
1b9405R(配列番号14):5'-gcctattggc ctggagtgtt tagctc-3� ��
HC85F(配列番号15):5'-atggcgttag tatgagtgtc gtgcagcct-3 ’
HC9302R(配列番号16):5’-tcgggcacga gacaggctgt gatatat gtc t-3’
HC8913F(配列番号47):5’-cttgaaaaag ccctggattg tcagat- 3’
HC8939F(配列番号46):5’-ctacggggcc tgttactcca ttgaac- 3’
R1(配列番号48):5’-acatgatctg cagagaggcc agtatcagca  ctctc-3
HClongH1(配列番号49):5'-gccagccccc tgatgggggc gacactcc ac c-3’
HC705R(配列番号50):5'-agccgcatgt aagggtatcg atgac-3’ ’
RP2(配列番号51):5’-acatgatctg cagagaggcc-3’
M13PrimerM3(配列番号24):5’-gtaaaacgac ggccagt-3’
M13PrimerRV(配列番号25):5’-caggaaacag ctatgac-3’
HC161S(配列番号52):5’-gagtacaccggaattgccaggacgaccggg-3 ’
104(配列番号26):5’-aggaagactt ccgagcggtc-3’
HC841S(配列番号27):5’-ggaacttgcc cggttgctct ttctctat ct tc-3’
HC1405S(配列番号53):5’-attccatggt ggggaactgg gccaa-3 ’
E1(配列番号28):5’-attccatggt ggggaactgg gctaa-3’
HC2006AS(配列番号54):5’-catccatgtg cagccgaacc aatt-3 ’
HC2199AS(配列番号55):5’-aggggtagtg ccaaagcctg tatggg tagt-3’
HC2430S(配列番号30):5’-aacatcgtgg acgtgcaata cctgtac gg-3’
HC2769S(配列番号32):5’-ttggaccggg agatggctgc atcgtg- 3’ 
HC3111AS(配列番号56):5’-ataatgaccc ccggcgactt tccgca ctaa c-3’
HC3591AS(配列番号57):5’-catggtagac agtccagcac-3’
HC4016AS(配列番号35):5’-cacttggaat gtctgcggta-3’
HC4498S(配列番号36):5’-agggggggag gcatctcatt ttctg-3 ’
HC4888F(配列番号37):5’-tgctatgacg cgggctgtgc ttggta- 3’
1b5290AS(配列番号58):5’-gacatgcatg tcatgatgta tttg-3 ’
HC5950AS(配列番号59):5’-ctcatgacct taaaggccac-3’
HC5858F(配列番号40):5’-tggcagcata ggccttggga aggt-3� ��
HC6315F(配列番号41):5’-aagacctggc tccagtccaa g-3’
5A-1(配列番号42):5’-ttccatgctc accgacccct c-3’
HC7090AS(配列番号43):5’-accttattct ctgactccac-3’
HC7743F(配列番号44):5’-cagaagaagg tcacctttgac-3’
HC8192S(配列番号45):5’-gcagcgggtc gagttcctgg tgaat-3 ’

《実施例7:インターフェロンによるHCV
RNAレプリコン複製阻害》
 インターフェロンのHCV複製阻害作用を完全� ��HCV RNAレプリコンを用い評価を試みた。イ� �ターフェロンの阻害作用の評価に使用した� �全長HCV RNAは、実施例4においてHuh7細胞にお� ��て高効率に複製可能なpTPF1/4B、及び実施例6� ��おいて取得したAHC1とpTPF1/4Bのキメラ体を用� ��た。キメラベクターは完全長HCV DNA pTPF1を� ��限酵素AgeIとBsrGIで切断し、その切断部位に� ��AHC1を制限酵素AgeIとBsrGIで切断した断片を連 結挿入することで、AHC1の構造蛋白質領域が� �入されたHCV DNA pTPF1/AHC1_AgeBsrを作成した。

 実施例2と同様の方法を用いてpTPF1/4B及びp TPF1/AHC1_AgeBsrの完全長HCV RNAを合成し、Huh7細� �にトランスフェクションした。トランスフ� �クションを行った細胞は、直ちに15mLの培地� ��再懸濁し、12 wellプレートに(直径22.1mm)に1mL ずつ播き培養を開始した。

 培養開始24時間後、様々な濃度(0.1IU/mLから30 0IU/mL)のインターフェロンを溶解した培地と� �換した。更に24時間培養後、細胞を1mMEDTA-PBS� ��剥離し遠心分離にて回収した。細胞ペレッ� ��を50μL RIPA緩衝液(20mM
Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mMEDTA, 1%NP40, 0.1%D eoxycholate, 0.1%SDS
complete protease inhibitor cocktail (Roche diagnostics  corporation))に溶解し、10krpmで5分間遠心によ� �上清を回収した。上清5μLをHCVコア抗原のキ� ��ト(富士レビオ、ルミパルス)を使用し測定� �た。

 細胞内におけるコア抗原量をコントロール( インターフェロン無添加区)に対して、50%の� �ア抗原量を示すインターフェロン濃度をプ� �ットにより算出し、IC50とした。結果は表2に 示した。

 前記試験の結果より、pTPF1/4Bがインター� �ェロン抵抗性であり、一方のpTPF1/AHC1_AgeBsrが インターフェロン感受性であることが示され た。このことは本発明の完全長HCV RNAレプリ� ��ンは、インターフェロン抵抗性のRNAレプリ� ��ンであり、インターフェロン抵抗性を示すC 型肝炎ウイルスの治療薬開発に有用であると 考えられる。

《実施例8:シクロスポリンAによるHCV RNAレプ� ��コン複製阻害》
 シクロスポリンAのHCV RNAレプリコン複製に� ��する阻害作用の評価を試みた。評価にはpTPF 1/4Bを使用した。実施例2と同様の方法を用い� ��Huh7細胞にトランスフェクションを行い、12� �wellプレートに播種した。4時間培養後、シク ロスポリンA 1μgを溶解した培地と交換した� �

 シクロスポリンA含有培地と交換後、24時� ��、48時間及び72時間培養後の細胞を実施例7� �同様の方法を用いて細胞内のHCVコア抗原量� �HCVコア抗原のキット(富士レビオ、ルミパル� ��)を使用し測定した。

 図3に示すように、シクロスポリンA(CsA)添 加区はトランスフェクション後4時間を最大� �し、その後減少していることを確認した。� �方、コントロール(CsA無添加区)は4時間から24 時間にかけていったん減少した後、48時間か� ��上昇し、72時間後も増加することを確認し� �。よってCsAは抗C型肝炎ウイルス活性を有す� ��ことが確認された。このことは本発明の完� ��長HCV RNAは、これまでに報告されているC型� ��炎治療薬の試験系(スクリーニング方法)と� �て利用できることを示している。更にHCVの� �製及び/又はHCV蛋白質の翻訳に影響を及ぼす� ��種物質をスクリーニングするための試験系� ��して利用可能である。

《実施例9:TPF1株のNS4Bタンパク質における適� �変異の効果》
 TPF1株を用いたRNAレプリコンで得られたNS4B� �ンパク質における2つのアミノ酸の適応変異� ��、他の遺伝子型1bのHCV遺伝子におけるレプ� �コンRNAの複製に与える影響を検討した。
 実施例6で得られたAHC1株の3010個のアミノ酸� ��NS4B領域のタンパク質に適応変異が導入され るように、ヌクレオチドに変異を導入した。 具体的には、Quick Mutagenesis Kit (Stratagene)を� �い、メーカーの推奨する方法に従い、第1804� ��のアミノ酸をQ(グルタミン)からL(ロイシン)� ��、第1966番のアミノ酸をE(グルタミン酸)から K(リジン)へ変異させるためのヌクレオチドの 変異を導入した。得られたクローンのRNAの塩 基配列を配列番号61に、アミノ酸配列を配列� ��号62に示す。

 得られた変異が導入された適応変異AHC1株の 全長のポリヌクレオチドを用いたことを除い ては、実施例2の操作を繰り返し、適応変異� �有するプラスミドDNA pRepAHC1/4Bを取得した。� ��のpRepAHC1/4Bを制限酵素XbaIで切断したものを� ��型として、RepAHC1/4BレプリコンRNAを取得し、 ヒト肝がん細胞(Huh7、JCRB0403)にトランスフェ� ��ションし、RepAHC1/4BレプリコンRNAが自律複製 している細胞株を樹立した。
 コントロールとして、適応変異が導入され� ��いないAHC1株の全長のポリヌクレオチドを用 いて同じ操作を繰り返した場合は、レプリコ ンRNAが自律複製している細胞株は樹立できた が、RepAHC1/4Bレプリコンの約1000分の1の効率で あった。従って、遺伝子型1bのHCV遺伝子に、N S4bタンパク質の2つの適応変異をコードする� �クレオチドの変異を導入することにより、� �プリコンRNAが効率的に自律複製することが� �かった。

 次に、得られた細胞株を用いたことを除い� ��は、実施例3の操作を繰り返し、複製したレ プリコンRNAのヌクレオチド配列を決定した。 その結果、塩基数3685番目のCがTに変異してお り、配列番号11のアミノ酸番号1115に相当する アミノ酸がP(プロリン)からL(ロイシン)に変異 していた。この変異を前記pRepAHC1/4Bに導入し� ��プラスミドpRepAHC1/4Bmを得た。pRepAHC1/4Bから� �られたレプリコンRNAであるRepAHC1/4Bと、pRepAHC 1/4Bmから得られたレプリコンRNAであるRepAHC1/4B mをHuh7にトランスフェクションして、得られ� ��コロニー数を計算した。RepAHC1/4Bの塩基配列 を配列番号67に、RepAHC1/4Bmの塩基配列を配列� �号68に示す。
 RepAHC1/4BのRNA 1μgをトランスフェクションし た場合には約10E3個のG418耐性コロニーが選択� ��れ、RepAHC1/4Bm RNA 1μgをトランスフェクショ ンした場合には約10E6個のコロニーが選択さ� �た。従って、NS4Bタンパク質における2つの前 記適応変異に加えて、他の1つ以上の適応変� �が導入されることにより、レプリコンRNAの� �製効率が上昇することがわかった。

 次に、完全長のHCV DNAとして、pTPF1の代わり にpAHC1を用いたこと、及びpRep4Bの代わりにpRep AHC1/4Bmを用いたことを除いては、実施例4の操 作を繰り返し、完全長のHCV DNAであるpAHC1お� �びpAHC1/4Bmを作製し、pAHC1から作製したレプリ コンRNAであるAHC1、及びpAHC1/4Bmから作製した� �プリコンRNAであるAHC1/4BmのHuh7細胞へのトラ� �スフェクション後の培養上清中のコア抗原� �量を測定した。結果を図4に示す。
 図4に示すように、適応変異を有するAHC1/4Bm� ��レプリコンRNAをトランスフェクションした� ��胞の24時間、48時間、及び72時間後の培養上� ��中のコア抗原の測定値は、対照のAHC1をトラ ンスフェクションした細胞の培養上清中のコ ア抗原の測定値より高かった。なお、レプリ コンRNAであるAHC1/4Bmの塩基配列を配列番号63� �、コードされているアミノ酸配列を配列番� �64に示す。